КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 16-15-00258

НазваниеE. coli как мишень терапии при болезни Крона

РуководительПобегуц Ольга Владимировна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2019 г. - 2020 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований» (11).

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-227 - Гастроэнтерология и гепатология

Ключевые словаболезнь Крона, Escherichia coli, миелопероксидаза, геном, протеом

Код ГРНТИ76.29.34

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Известно, что болезнь Крона (БК) является тяжёлым хроническим иммуноопосредованным гранулематозным воспалительным заболеванием желудочно-кишечного тракта, которое может поражать все его отделы, начиная от полости рта и заканчивая прямой кишкой. Генерализованный, хронический характер болезни существенно снижает качество жизни больного, приводя зачастую к инвалидности. Патогенез болезни Крона является многофакторным процессом, включающим факторы генетической восприимчивости организма хозяина, состав и разнообразие кишечной микробиоты и иммуноопосредованное повреждение кишечника (Torres J, Mehandru S, Colombel JF, et al. Crohn’s disease. Lancet 2017;389:1741–55). Механизмы и причины возникновения и протекания этой болезни интенсивно исследуются в настоящее время, однако до сих пор не ясен механизм манифестации БК, непонятно, что является причиной болезни и что способствует ее развитию. Поскольку неизвестен механизм патогенеза БК, остаются нерешенными вопросы поиска потенциальных диагностических маркеров и путей терапии этого заболевания. Предполагают, что одна из причин может быть связана с провокацией неконтролируемого иммунного ответа условно-патогенными микроорганизмами, колонизующими слизистую кишечника, одним из кандидатов которых являются E. coli. Действительно, метагеномный анализ кала и биопсии от пациентов с болезнью Крона показал, что одной из особенностей, характерной для этой болезни, является увеличение количества E. coli, способных успешно проникать через муциновый слой, прикрепляться к клеткам эпителия, преодолевать эпителиальный барьер, взаимодействовать с макрофагами, проникать реплицироваться внутри них (Rhodes JM. The role of Escherichia coli in inflammatory bowel disease. Gut 2007;56:610–2). При этом они модулируют защитные свойства макрофагов таким образом, что при этом не происходит гибели клеток, несмотря на кислый рН, окислительный стресс, протеолитические ферменты и антимикробные соединения (Bringer MA, Glasser AL, Tung CH, et al. The Crohn’s disease-associated Adherent invasive Escherichia coli strain LF82 replicates in mature phagolysosomes within J774 macrophages. Cell Microbiol 2006;8:471–84), что составляет защитную функцию этих клеток врожденного иммунитета. Е. coli, обладающие такими свойствами были отнесены к определенной группе адгезивно-инвазивных E. coli (АИЕК). Было показано, что АИЕК не обладают ни одним из известных генетических инвазивных детерминант, характерных для энтероинвазивных, энтеропатогенных или энтеротоксигенных E.coli или Shigella flexneri (например, ген плазмиды ipaC, кодирующий инвазин, ген, кодирующий интимин энтеропатогенной E. (Boudeau, J., A. L. Glasser, C. Neut, P. Desreumaux, A. Cortot, C. Rich, B. Joly, J. F. Colombel, and A. Darfeuille-Michaud. 2000. Invasive ability of Escherichia coli strains isolated from ileal mucosa in Crohn’s disease. Gastroenterology 118:A1847). Активность АИЕК сопровождается высвобождением провоспалительных цитокинов, т.е. выживая и размножаясь внутри макрофагов они усугубляют воспалительный процесс. Поскольку АИЕК способствуют развитию воспалительного процесса, исследователи отнесли эту группу бактерий к патобионтам. Они отличаются от оппортунистических патогенов тем, что их влияние на организм хозяина опосредовано стимулированием иммунной системы (Hornef M. Pathogens, commensal symbionts, and pathobionts: discovery and functional effects on the host. Ilar J 2015;56:159–62). Детерминанты, которые определяют переход к адгезивно-инвазивному фенотипу, отвечают за проникновение и выживание внутри макрофагов до сих пор неизвестны. На сегодняшний день единственным эффективным способом идентификации АИЕК является оценка взаимодействия между бактериальными клетками и клетками-хозяина. Пока не найден молекулярный маркер, с помощью которого можно было бы определять адгезивно-инвазивный фенотип. Наши предыдущие исследования и работы других групп показали, что АИЕК штаммы генетически очень разнообразны - они могут принадлежать к разных филогруппам и серогруппам. Мы предположили, что фенотипические свойства АИЕК штаммов обусловлены общими паттернами экспрессии генов. Задачей нашего проекта является изучение транскрипционного и протеомного профилей адгезивно-инвазивный штаммов, способных прикрепляться, проникать внутрь макрофагов и адаптироваться внутри них в условиях окислительного и кислотного стресса. Такой комплексный подход будет использован впервые в рамках одного проекта. Для исследования будет использована модель заражения моноцитарной клеточной линии макрофагов THP-1. Обнаруженные нами детерминанты могут быть использованы в качестве диагностического инструмента для идентификации АИЕК при болезни Крона, помогут подобрать комплексные приемы реабилитации больных, более эффективные, чем в настоящий момент и связанные с прекращением развития адгезивно-инвазивного фенотипа, а значит и развития воспалительного процесса.

Ожидаемые результаты
В рамках данного проекта мы планируем изучить взаимодействие БК-изолятов, полученных от пациентов с болезнью Крона и обладающих адгезивно-инвазивным фенотипом, с макрофагами на модели инфекции моноцитарной линии макрофагов THP-1 для определения детерминант, ответственных за способность изолятов прикрепляться, проникать внутрь макрофагов и адаптироваться внутри них в условиях окислительного и кислотного стресса. Исследование будет проводится на двух уровнях организации клетки - на уровне транскиптома и протеома. В результате выполнения данного проекта в 2016-18 гг. нами был проведен анализ адгезивно-инвазивной активности 10 БК-изолятов на модели заражения клеточной линии аденокарциномы кишечника Caco. Было показано, что в отличие от лабораторных штаммов и изолятов от здоровых людей, практически все БК-изоляты (80%) могли прикрепляться и проникать внутрь эукариотических клеток. Выявлены наиболее активные БК-изоляты. Это три изолята K5, BruB2 и ZvL2, которые мы планируем использовать в этом исследовании. Будет проведена оценка адгезивно-инвазивного потенциала этих трех БК-изолятов на модели заражения линии макрофагов THP-1 по аналогии с уже разработанной нами в рамках выполнения этого проекта модели заражения клеточной линии Caco. В рамках проекта 2016 года было показано, что в процессе культивирования адгезивно-инвазивные E.coli (АИЕК) постепенно теряют способность прикрепляться и проникать внутрь макрофагов. С помощью последовательного культивирования БК-изолятов и использования модели заражения линии макрофагов THP-1 мы определим на каком пассаже БК-изоляты будут терять адгезивно-инвазивную активность (предварительно нами показано, что это примерно 4-5 пассаж) и получим два состояния, характеризующих адгезивно-инвазивную активность БК-изолятов – активные АИЕК (аАИЕК) и неактивные или неспособные к адгезии и инвазии (нАИЕК). Будет проведен сравнительный анализ транскрипционного профиля генов для этих двух состояний - аАИЕК и нАИЕК, который позволит нам определить гены, уровень экспрессии которых изменяется вместе с потерей адгезивно-инвазивных свойств. Таким образом, мы определим детерминанты, которые отвечают за поддержание адгезивно-инвазивного фенотипа. Кроме этого, будет проведено транскрипционное профилирование изолятов E.coli, которые непосредственно проникли внутрь макрофагов и выживали там длительное время. Этот эксперимент позволит выявить детерминанты, необходимые бактериям для выживания внутри макрофагов. Для подтверждения функциональной роли выявленных генетических детерминант будет проведен сравнительный анализ протеомного профиля БК-изолятов до и после инвазии в макрофаги, а также для двух состояний аАИЕК и нАИЕК двумя независимыми и дополняющими друг друга методами протеомного анализа - дифференциального 2Д электрофореза и ВЭЖХ-МС. На основании такого протеомного профилирования мы выявим белки, определяющие основные направления функциональных изменений, связанных с развитием адгезивно-инвазивного фенотипа в макрофагах. В дальнейшем будет проведен количественный анализ этих белков непосредственно в клетках макрофагов с помощью разработанного нами ранее метода количественного анализа представленности белков без предварительного отделения бактериальных клеток от эукариотических и подращивания их в культуральной среде. Такой подход позволит определить изменения протеомного профиля БК-изолятов непосредственно находящихся внутри макрофагов и будет использован нами для инфекционной модели их заражения адгезивно-инвазивными E. coli впервые. Одновременно с этим мы будем количественно оценивать представленность эукариотических белков макрофагов, панель которых будет подобрана нами при анализе литературных источников. Выявив детерминанты, определяющие адгезивно-инвазивный фенотип и подтвердив их на уровне белка, для дальнейшей их валидации будут получены мутанты, нокаутные и сверхэкспрессирующие по интересующим нас генам, для этих мутантов будет проверена их способность взаимодействовать и проникать внутрь макрофагов. Чтобы убедиться в том, что используемые нами изоляты действительно связаны с воспалительным процессом будет проведена оценка продукции провоспалительных цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, GM-CSF, IF-N-y и TNF-α макрофагов после заражения БК-изолятами. Также будет оценена окислительная активность макрофагов. Вероятно, БК-изоляты способны секретировать в окружающее пространство протеазы, везикулы, пептиды и другие молекулы, обладающие биологической активностью, способные участвовать в процессах адгезии и инвазии. Чтобы изучить секретируемые белки БК-изолятов будет проведен анализ секретома после взаимодействия БК-изолятов с клеточной линией макрофагов. Чтобы прикрепиться к энтероцитам АИЕК необходимо преодолеть слой слизи, основным компонентом которой является гликопротеин муцин. В рамках этого проекта нами было установлено, что БК-изоляты из собранной нами коллекции связывают муцин. Протеомный анализ показал, что при связывании муцина увеличивается продукция белков, участвующих в утилизации 1,2-пропандиола, который является промежуточным звеном метаболизма муцина и фукозы. Предполагается, что БК-изоляты используют эти компоненты слизи в качестве источника углерода. Для того, чтобы расщеплять связанный муцин бактериальной клетке необходимо секретировать протеазы. Для того, чтобы подтвердить возможность использования муцина БК-изолятами и определить какими средствами БК-изоляты могут расщеплять муцин, будет проведен анализ секретома изолятов после их взаимодействия с муцином. Проведенное исследование позволит нам выявить основные детерминанты, определяющие адгезивно-инвазивный фенотип БК-изолятов, а именно белки, участвующие в адгезии и инвазии в макрофаги, белки, секретируемые бактериями при взаимодействии с макрофагами и необходимые для утилизации муцина. Полученные результаты будут соответствовать научным исследованиям мирового уровня. В начале 2000 годов на основе метагеномного анализа кала и биопсии от пациентов с болезнью Крона было обнаружено значительное увеличение количества E. coli, способных проникать через муциновый слой, преодолевать эпителиальный барьер, проникать в макрофаги и реплицироваться внутри них (Glasser AL, Boudeau J, Barnich N, et al. Adherent invasive Escherichia coli strains from patients with Crohn’s disease survive and replicate within macrophages without inducing host cell death. Infect Immun 2001;69:5529–37; Rhodes JM. The role of Escherichia coli in inflammatory bowel disease. Gut 2007;56:610–2). При этом не происходило гибели клеток, E. coli могли выживать и даже размножаться в условиях кислотного и окислительного стресса. За последние 15 лет интерес к ним вырос, и Е. coli с подобным фенотипом классифицируют как новую специфическую патогенную группу, которую назвали адгезивно-инвазивной E. coli (АИЕК) (Darfeuille-Michaud A. Adherent-invasive Escherichia coli: a putative new E. coli pathotype associated with Crohn’s disease. Int J Med Microbiol 2002;292(3-4):185–93). Было показано, что они не только выживают в макрофагах, но при этом индуцируют образование провоспалительных цитокинов, т.е. способствуют развитию воспалительного процесса (Hornef M. Pathogens, commensal symbionts, and pathobionts: discovery and functional effects on the host. Ilar J 2015;56:159–62). Поэтому их выделили в отдельную группу патобионтов. В настоящее время большая часть научных исследований посвящена решению вопроса: являются ли эти адгезивно-инвазивные E. coli триггерами болезни Крона или они обрели способность существовать и адаптироваться в условиях существующего воспалительного заболевания кишечника, когда наблюдаются снижение иммунитета слизистой оболочки, снижение барьерной функции кишечного эпителия (Palmela C, Chevarin C, Xu Z, Torres J, Sevrin G, Hirten R, Barnich N, Ng SC, Colombel JF. Adherent-invasive Escherichia coli in inflammatory bowel disease. Gut. 2018, 67(3):574-587). Появились работы, в которых исследуются механизмы, позволяющие остановить развитие адгезивно-инвазивного фенотипа E. coli, ассоциированных с болезнью Крона (Migliore F, Macchi R, Landini P, Paroni M. Phagocytosis and Epithelial Cell Invasion by Crohn's Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Are Inhibited by the Anti-inflammatory Drug 6-Mercaptopurine. Front Microbiol. 2018 May 14;9:964). Пока не выяснены детерминанты на уровне генома и экспрессии генов, определяющие адгезивно-инвазивный фенотип. Показано, что АИЕК не обладают ни одним из известных генетических инвазивных детерминант, характерных для энтероинвазивных, энтеропатогенных или энтеротоксигенных E.coli или Shigella flexneri. Определены только некоторые функциональные характеристики, например, значение оксидоредуктазных белков в защите от активных форм кислорода, продуцируемых макрофагами, участие ibeA инвазина во взаимодействии с макрофагами, зависимость от продукции интерлейкина TNF-α или модуляция апоптоза инфицированных макрофагов путем деградации каспазы-3 (Bringer MA, Barnich N, Glasser AL, et al. HtrA stress protein is involved in intramacrophagic replication of Adherent and invasive Escherichia coli strain LF82 isolated from a patient with Crohn’s disease. Infect Immun 2005;73:712–21; The oxidoreductase DsbA plays a key role in the ability of the Crohn’s disease-associated Adherent-invasive Escherichia coli strain LF82 to resist macrophage killing. J Bacteriol 2007;189:4860–71; Bringer MA, Billard E, Glasser AL, et al. Replication of Crohn’s disease-associated AIEC within macrophages is dependent on TNF-α secretion. Lab Invest 2012;92:411–9). Однако, полученные данные пока недостаточны для понимания картины развития адгезивно-инвазивного фенотипа в целом. Необходим комплексный подход, включающий анализ на уровне экспрессии генов и протеома, что и планируется осуществить в данном исследовании. Планируемое исследование будет иметь практическое значение. Обнаруженные нами детерминанты могут быть использованы в качестве диагностического инструмента для идентификации АИЕК при болезни Крона. Кроме того, зная основные точки, которые влияют на образование АИЕК, можно будет с помощью скрининга подобрать биологически активные соединения, которые будут останавливать формирование этого фенотипа и его проникновение в макрофаги, а значит останавливать и воспалительный процесс, поскольку АИЕК, размножаясь в макрофагах, способствуют его развитию.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. Из полученных нами ранее изолятов E. coli от пациентов с болезнью Крона мы отобрали три, обладющих наиболее активными адгезивно-инвазивными свойствами – изоляты ZvL2, BruB2 и К5 (БК-изоляты). Определено, что все три изолята способны расти на среде М9 с альтернативными источниками углерода – пропионатом натрия (РА), 1,2-пропандиолом (PG) и ацетатом. Показано, что при этом скорость роста изолятов значительно снижается по сравнением с ростом на среде М9 в присутствие глюкозы (Glu) (Рис. 1). 2. С помощью инфекционной модели с использованием клеточной линии аденокарциномы ободочной кишки Caco-2 определена адгезивно-инвазивная активность БК-изолятов в зависимости от источника углерода в среде культивирования. Показано, что проведение изолятов через 5 пассажей на среде М9 в присутствие РА увеличивает, а проведение через 5 пассаже на среде М9 в присутствие Glu, наоборот, значительно снижает их способность прикрепляться и проникать внутрь эукариотических клеток (Рис. 2). Ни один из других альтернативных источников углерода, а именно ацетат и PG не оказывали подобного эффекта. 3. С помощью гентамицинового теста с использованием клеточной линии макрофагов THP-1 оценена способность БК-изолятов выживать в окислительной среде внутри макрофагов. Показано, что все три БК-изолята более устойчивы к окислительной среде внутри макрофагов по сравнению с лабораторным штаммом Mg1655. Если БК изоляты пассировать на Glu, то они теряют способность выживать внутри макрофагов, процент выживаемости падает до значений, наблюдаемых для лабораторного штамма Mg1655. Наоборот, пассирование в присутствие РА не только сохраняет эту способность, но и увеличивает ее по сравнению с исходными изолятами, полученными из колонии без пассирования. 4. В результате для каждого изогенного БК-изолята получено 2 состояния – активное, для которого характерны высокие адгезивно-инвазивная активность и способность выживать в макрофагах (аАИЕК), обусловленное использованием альтернативного источника углерода РА и неактивное (нАИЕК), когда эти свойства снижаются до показателей, характерных для лабораторного штамма Mg1655 и которые являются следствием длительного пассирования на среде М9 в присутствие Glu (Рис.3) 5. С помощью дифференциального 2Д электрофореза проведен сравнительный анализ протеомов трех изолятов ZvL2, BruB2 и К5 в двух состояниях аАИЕК и нАИЕК. Показано, что эти два состояния значительно отличаются по представленности белков. Определен паттерн дифференциальных белков, характерных для каждого и общих для всех трех изолятов. Представлен список белков, которые могут быть значимыми для наблюдаемого перехода от неактивного состояния изолятов (нАИЕК) к активному (аАИЕК) (Рис. 5, 6; Табл. 3, 4). Для всех трех изолятов характерно повышение уровня поринов, один из которых ompA, как известно, может блокировать активацию комплемента и модулировать фагоцитоз макрофагов. В активной форме изолятов увеличивается уровень белка стресса UspE и снижается уровень его антогониста - белка UspG, которые играют большую роль в адаптации клеток к внешним стрессовым условиям и регулируют гены, отвечающие за формирование жгутиков и подвижность бактерий. РА индуцирует увеличение пероксидаз и белков, участвующие в биосинтезе Fe-S кластеров, которые играют непосредственную роль в устойчивости к окислительному стрессу. Рост на РА способствует увеличению представленности белка DhbA, фермента, участвующего в синтезе энтеробактина – сидрофора, эффективно связывающего железо, и уменьшению уровня энтеробактинэстеразы, участвующей в его деградации. Для бактерий важно сохранять гомеостаз железа, поскольку его истощение – одна из защитных стратегий организма хозяина от патогенов. РА индуцирует увеличение уровня двух транскрипционных факторов (PhoP и OmpR), контролирующих гены, ответственные за защиту клеток от окислительного и осмотического стрессов. 6. Проведен сравнительный анализ тотальных протеомов аАИЕК и нАИЕК для каждого БК-изолята в трех биологических повторах с помощью ВЭЖХ масс-спектрометрического анализа в системе ВЭЖХ Ultimate 3000 RSLCnano, подключенной к спектрометру QExactive Plusmass (Thermo Fisher Scientific). Идентификация белков проводилась по базе данных US National Center for Biotechnological Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), где нами были выложены геномы БК-изолятов ZvL2 (RCE07), BruB2 (RCE03) и K5 (RCE05) (Rakitina DV et al., BMC Genomics, 2017,18(1):544. doi: 10.1186/s12864-017-3917-x)16–18). Удалось идентифицировать около 1800 белков. Определены паттерны дифференциальных белков для каждого БК-изолята (Табл. 5, 6, 7), а также представлен список общих для всех трех изолятов дифференциальных белков (Табл. 8). Полученные данные в большинстве случаев подтвердили результаты дифференциального 2Д электрофореза. Для изолята ZvL2 получено 659 дифференциальных белков, среди них – 247 перепредставленных и 256 - чей уровень падает в аАИЕК, для изолята BruB2 определен 401 белок, из них 228 белков, уровень которых увеличивается и 173 белка - падает в случае активной формы изолята (аАИЕК), для изолята К5 определено 413 дифференциальных белков, среди которых уровень 228 белков увеличивается, 185 – уменьшается в активной форме изолята (аАИЕК). Показано, что для каждого изолята есть индивидуальные особенности изменений протеома, однако большинство определившихся дифференциальных белков были сходны для всех трех изолятов. Установлено, что РА индуцирует увеличение ферментов, участвующих в утилизации пропионата (prpC, prpD), белков-транспортеров аминокислот и пептидов (livM, hisP, hisM, cstA, cycA), белков, связанных с синтезом пептидогликана и структурой клеточной стенки (mipA, mraY), а также поринов (ompA, ompX, ompC, ompN), ферментов цикла трикарбоновых кислот (fceA, sdhA, sdhB, sucA, sucC, gltA, mdh), белков защиты от окислительного стресса (sod, gpr) и осмотического стресса (proX). Растут ферменты биосинтеза жирных кислот и липидов (fabA, fabB, fabI, pssA, pssB, lpxDm lpxC), белки, отвечающие за организацию железо-серных центров (iscU, sufC, lpdA, fre) и белки транслокационной системы Sec (SecG, SecY). Увеличивается уровень нескольких белков, относящихся к семейству Csp- белков холодового шока (cspA, cspC, cspD, cspE), которые, как известно, необходимы для роста клеток при изменении внешних условий. Определено увеличение представленности транскрипционных факторов: rcsB, который регулирует гены, отвечающие за биофильмообразование, клеточное деление, синтез белков внешней мембраны и глутамат-зависимую устойчивость к кислотному стрессу, и cpxP, который в составе двухкомпонентной системы регулирует гены, ответственные за структурирование и работу сенсорных доменов периплазматической мембраны. При этом для всех трех изолятов наблюдается масштабное падение ферментов, отвечающих за биосинтез аминокислот (metT, acd, trpGD, trpA, trpB, ilvCm, hisG, hisH, hisF, hisB, hisA, dapB, dapD, glnA, glsA, aroG, aroDlrp, cysK, terA, glyS, proB, mtnN, serC). Кроме того, падает уровень ферментов биосинтеза нуклеотидов (purC, purK, purD, pyrH), гликолиза (tpiA, pykA, eno, gapA, gpmA, fba), пентозо-фосфатного пути (eda, rpiA, gnd) и биосинтеза полисахаридов (llp). Падает уровень шаперонов (clpB, groL, groS, grpE, hdeB, tig, skp) и некоторых протеаз (pepE, pepD, pepT, sohB). Из регуляторных белков падает белок slp, который участвует в защите клеток от метаболитов органических кислот. Падает уровень белков-репрессоров: rspR - отвечает за регуляцию и переход в состояние голодания, allR - репрессор утилизации глиоксилата, pspA – негативный регулятор pspABCDE оперона, участвует в регуляции целостности мембраны, эффективной транслокации и подержания трансмембранного потенциала. Снижается уровень белка rraB, который отвечает за количество и время жизни внутриклеточной РНК и глобального регулятора yebC. 7. Методом дифференциального 2Д электрофореза проведен анализ значимых для выживания во внутренней среде макрофагов белков БК-изолятов путем сравнительного анализа протеома клеток Е. coli, отобранных на стадии фагоцитоза и после 24-часовой постинфекции. Показано, что в процессе постинфекции растет уровень белков, участвующих в биосинтезе аминокислот, в поддержании целостности внешней мембраны и структурной организации мембранного кластера хемирецепторов, а также белков, участвующих в защите от окислительного стресса и транспорте сахаров. При этом падает уровень белков, участвующих в деградации пропионата и поддержании структуры хромосомы. 8. Показано, что заражение макрофагов БК-изолятами ZvL2 и BruB2 в активном состоянии (аАИЕК), которое связано с использование РА в качестве источника углерода, вызывает увеличение продукции цитокинов IL-6, TNF-α и GM-CSF, в то время, как заражение макрофагов этими изолятами в неактивном состоянии (нАИЕК), которое достигается путем длительного пассирования на среде М9 в присутствие глюкозы– наоборот, снижает их выработку. В случае БК-изолята К5 подобное явление наблюдается только для цитокина TNF-α. 9. Проведён анализ транскрипционного профиля БК-изолятов BruB2, ZvL2 и K5 в трех состояниях – исходные изоляты, которые были выращены на среде М9 в присутствие Glu из колонии без пассирования (ZvL2, BruB2, K5); изоляты в неактивном состоянии (нАИЕК), которые также были получены из колонии, а затем проведены через 5-10 пассажей в среде М9 в присутствие Glu (ZvL2Glu, BruB2 Glu, K5 Glu) и изоляты в активном состоянии (аАИЕК), проведенные через 5 пассажей на среде М9 в присутствие PA (ZvL2 РА, BruB2 РА, K5 РА). Относительный уровень представленности транскриптов был измерен с помощью реал-тайм ПЦР с обратной транскрипцией (Методика 6 в приложении). Показано, что уровень экcпрессии генов, ответственных за утилизацию PA и этаноламина увеличивается у аАИЕК и снижается у нАИЕК (Рис. 10) для всех трех изолятов, за исключением изолята BruB2, у которого экспрессия гена eutR не изменялась. Показано, что РА индуцирует транскрипцию ацетил-КоА-синтазы (acs). Для изолята ZvL2 показано, что экспрессия генов pdu-оперона значительно снижается для нАИЕК и увеличивается в активной форме. Для изолятов ZvL2 и BruB2 не удалось определить наличие транскриптов pdu-оперона. Отработан метод выделения РНК из изолятов для высокопроизводителньного секвенирования С помощью набора NEBNext® Ultra™ II Directional RNA Library Prep Kitfor Illumina, NEB приготовлены библиотеки транскриптомов для высокопроизводительного секвенирования, проведен секвенс образцов на секвенаторе HiSeq 2500 System и получены парноконцевые прочтения длиной 2*125 п.о., в среднем примерно 6 млн ридов на образец.

Публикации

1. Букато О.Н., Побегуц О.В., Ракитина Д.В., Байкова Ю.П., Бутенко И.О., Силантьев А., Фисунов Г.Ю., Говорун В.М. Proteomic dataset: Profiling of membrane fraction of Escherichia coli isolated from Crohn's disease patients Data Brief., - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1016/j.dib.2019.104417

2. Михальчик Е.В., Балабушевич Н.Г., Вахрушева Т.В, Соколов А, Байкова Ю.П., Ракитина Д.В., Щербаков П.Л., Гусев С.А., Гусев А.А., Хараева З, Букато О.Н., Побегуц О.В. Mucin adsorbed by E. coli can affect neutrophil activation in vitro. FEBS Open Bio, - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1002/2211-5463.12770

3. Ракитина Д.В., Байкова Ю.П., Побегуц О.В., Букато О.Н., Бутенко И.О., Гаранина И.А., Левитес М.А., Манолов А., Каныгина А.В., Кострюкова Е.С., Семашко Т.А., Карпова И.Ю, Бабенко В., Щербаков П.Л., Халиф И.Л.,Шапина М.В., Парфенов А., Ручкина И. Proteomic dataset: Profiling of cultivated Echerichia coli isolates from Crohn's disease patients and healthy Data Brief., - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1016/j.dib.2019.103734.

4. Байкова Ю.П., Ладыгина В.Г., Евсютина Д.В., Побегуц О.В., Ракитина Д.В. Effect of carbon source on expression of Pdu-operon in E.coli isolated from Crohn's disease patients SCON Molecular Biology, - (год публикации - 2019)

5. Байкова Ю.П., Ракитина Д.В., Семашко T.A., Евсютина Д.В., Букато O.Н., Побегутц О.В. ВЛИЯНИЕ ИСТОЧНИКА УГЛЕРОДА НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ PDU ОПЕРОНА У ИЗОЛЯТОВ E. COLI, Сборник тезисов: VI СЪЕЗД БИОХИМИКОВ РОССИИ, - (год публикации - 2019)

6. Букато О.Н., Побегуц О.В., Евсютина Д.В., Ракитина Д.В., Байкова Ю.П., Ладыгина В.Г., Фисунов Г. Ю. ПРОТЕОМНОЕ ПРОФИЛИРОВАНИЕ АДГЕЗИОННО-ИНВАЗИВНЫХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ У ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ КРОНА Сборник тезисов: VI СЪЕЗД БИОХИМИКОВ РОССИИ, - (год публикации - 2019)

7. Букато О.Н., Побегуц О.В., Евсютина Д.В., Ракитина Д.В., Байкова Ю.П., Матюшкина Д.С., Ладыгина В.Г., Фисунов Г.Ю. ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ АДГЕЗИВНО-ИНВАЗИВНОЙ ESCHERICHIA COLI, АССОЦИИРОВАННОЙ С БОЛЕЗНЬЮ КРОНА Сборник тезисов: Биотехнология - медицине будущего. Материалы всероссийской мультиконференции с международным участием., - (год публикации - 2019)

8. Побегуц О.В., Букато О.Н., Евсютина Д.В., Ракитина Д.В., Байкова Ю.П., Ладыгина В.Г., Фисунов Г.Ю. Proteomic profiling of AIEC strains isolated from patients with Crohn's disease. SCON Molecular Biology, - (год публикации - 2019)

9. Ракитина Д.В, Байкова Ю.П., Семашко Т.А., Побегуц О.В. АНАЛИЗ ГЕНОВ E. COLI, АССОЦИИРОВАННЫХ С БОЛЕЗНЬЮ КРОНА, В МИКРОБИОТЕ КИШЕЧНИКА Сборник тезисов: VI СЪЕЗД БИОХИМИКОВ РОССИИ, - (год публикации - 2019)

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Проведен сравнительный анализ данных протеомного профилирования трех БК-изолятов ZvL2, BruB2 и К5 в двух противоположных по адгезивно-инвазивной активности и способности выживать в макрофагах состояниях – аАИЕК и нАИЕК. Показано, что переход к активному адгезивно-инвазивному фенотипу связан со значительной перестройкой протеома во всех трех изолятах. Общие для трех изолятов изменения связаны с переводом клеток E. coli от одного источника углерода (глюкозы) к альтернативному источнику углерода (РА). Обнаружены значительные изменения направления углеродного метаболического потока - увеличение представленности ферментов метилцитратного цикла (утилизация пропионата), ЦТК и уровня белков НАДН-дегидрогеназа-цитохром во3 комплекса переноса электрона (nuo-оперон), который служит посредником в переключении метаболического потока у бактерий. При этом в условиях роста на РА наблюдается падение уровня ферментов гликолиза, ферментов биосинтеза аминокислот и вместе с тем рост уровня ферментов деградации аминокислот, а также белков-транспортеров аминокислот. Для аАИЕК ZvL2 и K5 наблюдается увеличение, а у BruB2, наоборот, снижение уровня ферментов деградации этаноламина. 2. Определены направления и регуляторные каскады, связанные с активацией вирулентных свойств БК-изолятов. Показано, что каждый из них выбирает свою стратегию, способствующую адгезии, инвазии и выживанию в макрофагах. При пассировании БК-изолята ZvL2 на РА наблюдается четкий ответ клеток на стресс, о чем свидетельствует увеличение уровня белков RspB, сигма фактора RpoS и его адаптерного помощника Rsd. Рост уровня RpoS связан с координированным действием регуляторных путей с участием глобальных регуляторов LrhA и RcsCDB. Для аАИЕК ZvL2 характерна активация регуляторных механизмов, способствующих образованию биопленки, о чем свидетельствуют увеличение уровня компонентов фимбрий 1 типа FimAСН, ключевого регулятора формирования курли CsgD, и регуляторов csgDEFG оперона MlrA, RcsC и RpoS, увеличивается уровень белков, отвечающих за связывание, деградацию и рециркуляцию сигнальной молекулы АИ-2. Показано, что аАИЕК ZvL2 демонстрирует высокую способность образования биопленок. РА индуцирует рост уровня двух поринов OmpA и OmpW. Для аАИЕК изолята BruB2 характерно падение уровня регуляторов ответа на стресс RpoS и BolA и компонентов жгутикового аппарата, но при этом активация транспорта железа (FeoA, SitB, SitВ и EfeU) и серы (CysANUW) и биосинтеза капсулы (KpsE KpsD). В данном случае не наблюдается изменений в регуляторных путях, ведущих к активации формирования биопленки, что согласуется с данными по оценки биопленкообразования. Предполагается, что это связано с перепроизводством целлюлозы, которое, как известно, отрицательно влияет на адгезию к твердым поверхностям. Для аАИЕК изолята К5 характерны рост двух белков RelA и SpoT, которые отвечают за синтез сигнальной молекулы ppGpp, контролирующей репликацию, трансляцию, транскрипцию и активность ферментов стрессового ответа, увеличение уровня компонентов жгутикового аппарата (FliGMNO, FlgGH и сигма-фактора FliA), активация процессов транспорта гема или гем-содержащих белков, сидерофоров и железа, а также рециркуляция сидерофоров (TonB и ExbB, FepA, FepD, FhuA, Fiu, EntS, FeoB и регулятор Fnr). РА также индуцирует увеличение уровня белков RffM и RffT, RffA и RffH, Rfe, Wzz, участвующих в биосинтезе общего О антигена, а также компонентов регуляторной системы RcsBCD, контролирующей биосинтез колановой кислоты и двух ферментов биосинтеза колановой кислоты CpsB и CpsG. Это свидетельствует об активности пути формирования капсулы. Мы не увидели такого количества регуляторных путей, способствующих формированию биопленки, как у изолята ZvL2, однако анализ биопленкообразования показал, что РА значительно активирует этот процесс. 3. Проведен сравнительный протеомный анализ лабораторного штамма K12 Mg1655 и изолята Z8, полученного от здорового человека, пассированных на среде М9 с добавлением РА или глюкозы в качестве источника углерода. Показано, что при переходе от глюкозы к РА, так же, как и у БК-изолятов, наблюдается изменения углеродного метаболического потока в сторону увеличения активности ЦТК, катаболизма аминокислот, транспорта аминокислот и пептидов, и вместе с тем, снижение активности биосинтеза аминокислот, что свидетельствует о том, что клетки испытывают голодный стресс. Однако при этом активации метилцитратного цикла (пути утилизации РА), работы НАДН-дегидрогеназного комплекса не наблюдается. Не наблюдается также никаких изменений в регуляторных каскадах, приводящих к образованию биопленок, активации работы жгутиков, формированию капсулы, модуляции пептидокликанового слоя, накоплению железа или других вирулентных факторов. 4. Проведен сравнительный анализ данных транскриптомного профилирования активной (аАИЕК) и неактивной (нАИЕК) форм БК-изолятов ZvL2, BruB2 и К5. Определены паттерны генов, изменяющих экспрессию в два и более раза. В случае аАИЕК БК-изолята ZvL2 показан рост экспрессии генов, кодирующих белки-транспортеры аминокислот и сульфата, ферменты метаболизма глицерола, деградации этаноламина, синтеза ЛПС, белки, отвечающие за транспорт и связывание железа, структурные компоненты фимбрий и жгутиков. При этом падает экспрессия генов, кодирующих компоненты PTS системы транспорта сахаров, Ni-Fe гидрогеназного комплекса и ферменты метаболизма липидов. В случае аАИЕК BruB2 показан рост экспрессии генов, кодирующих ферменты деградации этаноламина, ЦТК, биосинтеза ЛПС, метаболизма тиамина и биотина, а также белки-транспортеры аминокислот и железа. При этом снижается экспрессия генов, кодирующих компоненты системы токсин-антитоксин, ферменты биосинтеза аминокислот, белки-транспортеры аминокислот и сахаров, белки, участвующие в транспорте железа (fhuBCD, ytfE, entD), снижается уровень генов dgcZ и gstA, кодирующих дигуанилатциклазы, участвующие в синтезе c-di-GMP. В случае аАИЕК БК-изолята К5 показан рост экспрессии генов, кодирующих белки, отвечающие за синтез и транспорт метионина, биосинтез нуклеозидов, биосинтез капсулы, биосинтез ЛПС, транспорт железа и аминокислот, биосинтеза и рециркуляции пептидогоикана, а также субъединицы Ni-Fe комплекса, ферменты деградации глицерола, белки хемотаксиса, и порины ompA и ompW. При этом падает экспрессия генов, кодирующих белки-транспортеры сахаров, нуклеозидов, сульфата и глицерола, компоненты пили и фимбрий, компоненты систем токсин-антитоксин, IV типа секреции, элементов коньюгативного переноса ДНК и Ton-зависимого транспорта. Определены направления изменения экспрессии генов, которые совпадают с данными протеомного профилирования (Табл. 6). 5. Методами масс-спектрометрического анализа и программного обеспечения MaxQuant проведен сравнительный протеомный анализ секретомов БК-изолята ZvL2, пассированного на среде М9 с добавлением РА (аАИЕК) или глюкозы (нАИЕК) в качестве источника углерода. Показано, что паттерны секретируемых белков при выращивании БК-изолята на среде М9 с добавлением РА или глюкозы практически не отличаются, в основном изменения связаны с увеличением уровня тех или иных белков. аАИЕК ZvL2 активнее секретирует порин ompA, липопротеин Slp, мажорный липопротеин Lpp, флавопротеин Wrb, периплазматический шаперон HdeA, белок YaeT, и структурные компоненты жгутиков и фимбрии 1 типа. При этом при пассировании на РА относительно глюкозы падает уровень белка DsbA, липопротеина VacJ, дегликазы HflK, порина OmpF и транспептидазы YbeS. В секретоме аАИЕК обнаружена муреин-эндопептидаза MeрH, которая может быть кандидатом для расщепления муцина. 6. Методом масс-спектрометрического анализа и программного обеспечения MaxQuant проведен протеомный анализ секретомов БК-изолятов ZvL2, BruB2 и К5 при взаимодействии с клеточной линией макрофагов THP-1 в их активной форме (аАИЕК) и неактивной (нАИЕК). Показано, что все три БК-изолята проявляют разную секреторную активность при взаимодействии с макрофагами, при этом паттерны секретируемых белков в основном одинаковы и не зависят от активности БК-изолятов. Изменяется только количественная характеристика секретируемых белков. При заражении макрофагов аАИЕК ZvL2 во фракции секретома увеличивается уровень компонентов жгутикового аппарата и фимбрий 1 типа, оксидоредуктаз, транспортеров аминокислот, белков, участвующие в десульфурации цистеина, белков хемотаксиса, а также АИ-2-связывающий белок LsrB. При этом снижается уровень порина OmpA и липопротеина SlyB. При заражении макрофагов аАИЕК BruB2 растет секреция нуклеозидазы YgdH, липопротеина YfgI, шаперона YbbN, белков TolB и YbgF и снижается активности секреции компонентов жгутиков, оксидоредуктаз, ompA, Slp. БК-изолят К5 проявлял очень слабую секреторную активность, однако нам удалось обнаружить сериновую протеазу EspC, обладающую цитотоксической активностью, способной расщеплять белок цитоскелета фодрин в эукариотических клетках. 7. Методом люциген-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) проведено измерение выработки супероксид анион-радикала ⋅OO¯макрофагами THP-1 и выделенными из крови человека нейтрофилами при их взаимодействии с БК-изолятами в двух различных по активности состояниях – аАИЕК и нАИЕК, а также с контрольными штаммами K12 Mg1655 и Z8. Показано, что в отличие от контрольных штаммов, аАИЕК БК-изолятов активирует макрофаги и нейтрофилы значительно меньше по сравнению с нАИЕК, что свидетельствует о том, что взаимодействие аАИЕК и нАИЕК с клетками врожденного иммунитета имеет различный характер. Предполагается, что при росте на РА БК-изоляты меняют свои поверхностные рецепторы, которые распознаются иммунными клетками. 8. Проведена оценка способности БК-изолятов и контрольных штаммов Mg1655 и изолята E. coli Z8 от здорового человека формировать биопленки с использованием кристаллического фиолетового. Показано, что пассирование на среде М9 с добавлением глюкозы не влияло на их способность к биопленкообразованию. Однако пассирование на РА – значительно активировало этот процесс для двух БК-изолятов - ZvL2(АИ= 6,4) и К5 (АИ= 5,2). Эффект РА был незначительным для изолята BruB2 (АИ=2,4) и контрольных штаммов (АИ= 1,6-1,8). Эффект РА на формирование биопленок был обратим: пассирование аАИЕК на среде М9 с добавлением глюкозы снижало способность образовывать биопленки до уровня, наблюдаемого для исходных штаммов. 9. Проведено секвенирование РНК и cравнительный анализ экспрессии генов БК-изолятов ZvL2, BruB2 и K5 непосредственно внутри макрофагов при заражении клеточной линии THP-1. В качестве опытных образцов была взята 6-часовая точка постинфекции после интернализации бактерий, в качестве контроля - смесь 1:100 по массе БК-изолятов и макрофагов, отобранных непосредственно перед заражением. Дифференциально экспрессирующимися генами считали гены, изменяющиеся в 2 и более раза с p value после поправки Бенджамини-Хохберга на множественное сравнение < 0.05. При попадании БК-изолятов внутрь макрофагов происходит снижение экспрессии генов, кодирующих ферменты ЦТК, гликолиза, утилизации пропионата и компонентов НАДН-дегидрогеназного-цитохром b03 комплекса, что связано с изменением углеродного метаболизма в условиях стресса. 10. С помощью масс-спектрометрического анализа в системе ВЭЖХ проведен сравнительный протеомный анализ БК-изолятов ZvL2, BruB2 и K5 до и после заражения клеточной линии макрофагов THP-1. Паттерны дифференциальных белков оказались очень сходными для всех трех изолятов, в основном наблюдалось падение уровня ферментов биосинтеза энтеробактина, транспортеров сульфата, оксидоредуктаз, порина OmpA, белка Dps. При этом мы наблюдали увеличение уровня белков, участвующих в защите от кислотного стресса. Таким образом, нами показано, что пропионат натрия индуцирует значительную перестройку клеточной организации БК-изолятов, приводящей к активации вирулентного фенотипа. Показано, что переход к вирулентному фенотипу связан с экспрессией prp-оперона, кодирующего ферменты метилцитратного цикла (утилизации пропионата). В отличие от контрольных штаммов Mg1655 и Z8, пропионат индуцирует переход клеток БК-изолятов в состояние стресса и запускает регуляторные каскады, приводящие к активации процессов, связанных с формированием биопленок, капсулы, транспорта железа и метаболизма серы с участием сигнальных молекл c-di-GMP, АИ-2, индола и ppGpp. Данные транскриптомного и протеомного анализа БК-изолятов непосредственно внутри макрофагов показали, что для всех трех изолятов наблюдается изменение углеродного метаболизма, связанного со снижением активации ЦТК, гликолиза, метилцитратного цикла и НАДН-дегидрогеназного комплекса. Предложен список генов БК-изолятов, определяющих переход вирулентному фенотипу, для получения нокаутных мутантов, с помощью которых будут проверены их функциональное участие.

Публикации

1. Мошковская М., Вахрушева Т., Ракитина Д., Байкова Ю., Панасенко О., Базирева Л., Гусев С., Гусев А., Михальчик Е., Смолина Р., Добрецов Г., Щербаков П., Парфенов А., Фадеева Н., Побегуц О., Говорун В. Neutrophil activation by Escherichia coli isolates from human intestine: effects of bacterial hydroperoxidase activity and surface hydrophobicity FEBS Open Bio FEBS PRESS, 10(3):414-426 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1002/2211-5463.12796

2. Побегуц О.В., Ладыгина В.Г., Евсютина Д.В., Еремеев А.В., Зубов А.И., Матюшкина Д.С., Щербаков П.Л., Ракитина Д.В., Фисунов Г.Ю. PROPIONATE INDUCES VIRULENT PROPERTIES OF CROHN’S DISEASE-ASSOCIATED ESCHERICHIA COLI Frontiers in Microbiology, volume 11, 1460 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01460

Возможность практического использования результатов
Патогенез болезни Крона (БК) является многофакторным процессом, включающим факторы генетической восприимчивости, образа жизни и питания, дисбаланс кишечной микробиоты, а также иммуноопосредованные повреждения кишечника. Несмотря на активность исследований, пока не ясны причины возникновения этой болезни. Не сформулировано даже единого представления о природе БК – спектр мнений колеблется от аутоиммунного и наследственно обусловленного происхождения до инфекционного процесса, приписываемого целому ряду микроорганизмов. Терапия в настоящий момент включает диету, фекотрансплантацию, применение антибактериальной терапии, прием противовоспалительных препаратов и как практически неизбежную стадию - резекцию всей пораженной части ЖКТ. Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности выяснения механизмов патогенеза БК, особенно для предотвращения манифестации БК как осложнение после тяжелых инфекционных процессов и травм. Одной из причин БК считают провокацию неконтролируемого иммунного ответа колонизующими слизистую кишечника E. coli, которые способны адгезироваться и проникать в эпителиальный слой кишечника, а также, попадая в макрофаги, выживать и реплицироваться в них, моделируя их защитные функциональные свойства, а также провоцировать воспалительный процесс, активируя секрецию провоспалительных цитокинов. Обнаруженные нами метаболические пути и регуляторные каскады, который приводят к активации вирулентных свойств E. coli помогут разработать новые терапевтические подходы, способствующие прекращению развития адгезивно-инвазивного фенотипа E. coli в организме человека, а значит и развитию воспалительного процесса. Известно, что пропионат используется в качестве средства обработки полуфабрикатов из птицы в качетстве бактерицидного средства. Полученные нами данные ставят под сомнение его применение, т.к. показано, что он индуцирует увеличение вирулентных свойств изолятов E. coli, полученных от пациентов с болезнью Крона.