Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Важнейшими этапами эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), инициирующего диссеминацию раковых клеток, является разрушение стабильной адгезии с соседними клетками и появление у клеток способности к миграции. Для понимания цитоскелетных механизмов, определяющих изменения фенотипа клеток эпителиальной природы при прохождении ЭМП, в 2019 году в культуре MDCK были проанализированы ранние этапы ЭМП, индуцированные HGF. Как показали конфокально-микроскопические исследования клеток MDCK, стабильно трансфицированных плазмидой mCherry-актина, первым этапом дестабилизации межклеточных контактов является разрушение кольцевого актинового пучка и полимеризация актиновой сети в зонах межклеточного взаимодействия, приводящая к образованию ламеллиподий по всему клеточному периметру. При видеомикроскопическом анализе перемещения латексных частиц по поверхности клеток было показано, что индукция псевдоподиальной активности на ранних этапах ЭМП сопровождалась усилением ретроградного тока актина-миозина на активных клеточных краях, а также появлением ретроградного тока на межклеточных границах. Как показало исследование культуры MDCK, стабильно экспрессирующей конструкцию GFP-Е-кадхерина, динамические изменения актинового цитоскелета приводили к замещению линейных межклеточных адгезионных контактов (АК) на нестабильные точечные и радиальные АК в псевдоподиях, а в последующем – к разрушению контактов между клетками. В культуре MDCK в присутствии HGF было детектировано появление у клеток эпителиального происхождения передне-задней поляризации, характерной для активно мигрирующих мезенхимальных клеток. С использованием конфокальной микроскопии было исследовано распределение белков межклеточной адгезии α-катенина и β-катенина в культуре IAR-20 при индукции ЭМП под действием EGF. В контрольных клетках α-катенин аккумулировался вместе с Е-кадхерином в линейных АК. При вхождении в ЭМП параллельно с разрушением АК происходило перераспределение α-катенина и он обнаруживался в везикулах в активных псевдоподиях на межклеточных границах. На более поздних сроках действия EGF везикулы, положительно окрашенные на α-катенин, выявлялись не только на периферии клеток в псевдоподиях, но также и в центральной области клеток. Вновь образующиеся точечные и радиальные АК содержали α-катенин. Во время индукции псевдоподиальной активности и ретроградного тока, связанных с ЭМП, фосфорилированная форма β-катенина (рY654-β-катенин), в отличие от β-катенина, входящего в состав АК, детектировалась в везикулах в зоне активного края и активных протрузий на межклеточных границах. Для проверки нашей гипотезы о значении ретроградного тока адгезионных белков, высвобождающихся из разрушающихся АК при ЭМП, в возникновении у эпителиальных клеток передне-задней поляризации были получены линии клеток IAR-20 и клеток рака молочной железы MDA-MB-468, экспрессирующих GFР-β-катенин и mCherry-α-катенин. Экзогенные белки колокализовались с эндогенными адгезионными белками и аккумулировались в АК. В клетках MDA-MB-468, экспрессирующих mCherry- α-катенин, наблюдалось восстановление линейной организации АК, что подтверждает функциональную полноценность экзогенного α-катенина. Были продолжены исследования миграционной и инвазивной активности клеток MCF-7, трансфицированных конструкцией транскрипционного фактора ЭМП, SNAI1 (tet-off SNAI1). При отмывке от тетрациклина клетки MCF-7-SNAI1 инвазировали монослой нормальных эпителиальных клеток молочной железы MCF-10А. С использованием специфических ингибиторов был проанализирован вклад систем цитоскелета в способность клеток к инвазии эпителиального монослоя. Ингибитор Arp2/3-зависимой полимеризации актина СК-666 и ингибитор форминов SMIFH2, регулирующих полимеризацию линейных актиновых филаментов, не оказывали ингибирующего действия на проползание опухолевых клеток MCF-7-SNAI1 через эпителиальный монослой. Ингибиторы матриксных металлопротеаз маримастат и GM6001 также не влияли на процент инвазии. Вместе с тем на инвазивную активность опухолевых клеток заметно влияло угнетение контрактильности актина-миозина под действием ингибитора ROCK, Y27632, и ингибитора АТФазы миозина, блеббистатина. Ранее мы показали, что пластичность миграционного фенотипа является базовой характеристикой опухолевых стволовых клеток (ОСК). Для изучения миграционных характеристик ОСК на модельных системах была получена линия клеток рака молочной железы MDA-MB-231-Sore6 с репортерной конструкцией Sore 6-GFP, детектирующей экспрессию генов стволовости Oct4 и Sox2. В культуре MDA-MB-231-Sore6 было около 16% GFP+ клеток. При проведении теста на исключение из живых клеток красителей Hoechst 33342 и Rhodamine 123 было показано, что GFP+ клетки были окрашены гораздо слабее, нежели GFP- клетки, что является одним из признаков ОСК. Было проведено флуоресцентно-микроскопическое исследование культуры MDA-MB-231-Sore-6 клеток после окрашивания антителами к белкам Oct4 и Sox2 и показано, что GFP+ клетки позитивно окрашивались на маркеры стволовости Sox2 и Oct4. При окрашивании винкулина не было обнаружено существенных различий в распределении адгезионных структур у GFP+ и GFP- клеток: фокальные адгезии были представлены мелкими фокальными комплексами, расположенными на активных клеточных краях. С помощью DIC-микроскопии была исследована миграционная активность GFP+ и GFP- клеток культуры MDA-MB-231-Sore и было обнаружено, что на адгезивных субстратах GFP+ клетки менее подвижны, чем GFP- клетки. При окрашивании промежуточных филаментов были обнаружены существенные различия в распределении виментиновых промежуточных филаментов между GFP+ и GFP- клетками. В GFP- клетках виментиновые филаменты заполняли всю цитоплазму и доходили до клеточных краев, напротив, во многих GFP+ клетках виментиновые филаменты были сконцентрированы в околоядерной области, при этом интенсивность флуоресцентного окрашивания виментиновых филаментов в GFP+ клетках была снижена. Распределение виментиновых филаментов в цитоплазме, как мы показали ранее, может влиять на пластичность клеточной миграции.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Были получены стабильные линии клеток рака молочной железы MDA-MB-468, экспрессирующих флуоресцентно-меченные конструкции: полноразмерного α-катенина (mCherry-α-cat-906); α-катенина с делецией актин-связывающего домена (mCherry-α-cat-505); α-катенина с мутацией винкулин-связывающего домена (mCherry-α-cat-ΔVin); α-катенина c мутацией в винкулин-связывающем домене и мутацией в актин-связывающем домене (Dn-α-cat-ΔVin+I792A). С использованием конфокальной микроскопии было показано, что клетки MDA-MB-468-mCherry-α-cat-906, MDA-MB-468-mCherry α-cat-505 и MDA-MB-468-mCherry-α-cat-ΔVin собирают Е-кадхериновые межклеточные адгезионные контакты с участием экзогенного α-катенина. Присутствие в молекуле α-катенина хотя бы одного из двух доменов, отвечающих за связывание с филаментным актином, достаточно для сборки Е-кадхериновых контактов в клетках. В отличие от клеток исходной линиии MDA-MB-468, утративших экспрессию эндогенного α-катенина в результате неопластической трансформации, клетки, экспрессирующие экзогенный α-катенин, в присутствии эпидермального фактора могли проходить ЭМП, приобретать мезенхимальный фенотип и мигрировать на двумерном субстрате. В присутствии эпидермального фактора роста в клетках, экспрессирующих mCherry-α-cat-906 и mCherry-α-cat-ΔVin, с помощью флуоресцентной видеомикроскопии был детектирован ретроградный ток актина и аккумуляция α-катенина в околоядерной области, как результат этого тока, что свидетельствует о перестройках актинового цитоскелета и его динамики в ответ на ростовой фактор. Таким образом, α-катенин, наряду с его участием в поддержании межклеточной адгезии, может быть вовлечен в формирование миграционного фенотипа у опухолевых клеток. На основе высоко-метастатической линии клеток рака молочной железы Skbr3 получена и охарактеризована линия клеток с репортерной плазмидой Sore6, в которой усиление флуоресценции GFP указывает на экспрессию генов стволовости Nanog, Oct4 и Sox2, характерных для стволовых клеток. На примере двух полученных линий (MDA-MB-231-Sore6 и Skbr3-Sore6) показано, что экспрессия GFP, свидетельствующая о наличии у клеток признаков стволовости, выражающаяся в экспрессии транскрипционных факторов Sox2, Oct4 и Nanog, ассоциирована с перераспределением виментиновых промежуточных филаментов, которые аккумулируются в околоядерном пространстве и не распространяются в краевые области клеток. С помощью стероидного лактона Витаферина А, вызывающего перераспределение и коллапс виментиновых промежуточных филаментов, показано, что миграция опухолевых клеток на двумерном субстрате, происходящая в условиях коллапса виментиновых филаментов, характеризуется большей направленностью и сопряжена с увеличением блеббинга и повышенным образованием экстраклеточных везикул. Как было показано нами ранее, образование блебов свидетельствует о переходе на амебоидный тип миграции. Поскольку переход на амебоидное движение связан с повышенной способностью к выделению экстраклеточных везикул, и в частности экзосом, было исследовано влияние экзосом больных раком молочной железы на пластичность нормальных и опухолевых клеток и показано, что экзосомы из крови больных стимулируют инициацию ЭМП у клеток эпителия молочной железы человека MCF-10А. Выдвинута гипотеза, объясняющая различия в миграционной пластичности у клеток и, в частности, переход к амебоидному движению. Мы предполагаем, что различия в способности к амебоидной миграции объясняются, прежде всего, строением подмембранного кортикального актинового цитоскелета и организацией промежуточных филаментов в цитоплазме.