Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе реализации проекта проведен анализ качественного и количественного состава кишечной микробиоты колорадского жука Leptinotarsa decemlineata природной и лабораторной популяции. Первичное сравнение проводили методом высевания бактерий из выделенных кишечников насекомых на искусственные питательные среды. При высевании кишечников, выделенных из личинок и имаго колорадского жука лабораторной и природной популяции, было показано присутствие спорообразующих и не споровых бактерий в титрах до 5 на 10 в 9 КОЕ. Зарегистрированы отличия в качественном и количественном составе представителей бактериального сообщества насекомых лабораторной и природной популяции. Световая микроскопия показала, что многие из них образовывали споры разных размеров, кокки и кокко-палочки. По морфологии роста на агаризованных селективных питательных средах отобрано более 70 различных культуры. По результатам секвенирования 16S рибосомальной РНК показано, что в кишечнике личинок колорадского жука преобладают бактерии представители семейства Enterobacteriaceae (более 80%), кроме того, следует отметить представителей рода Raoultella и Lactococcus, а также особый интерес представляет наличие значимого количества представителей рода Pseudomonas. Установлено присутствие представителей родов Acinetobacter, Aeromonas, Enterococcus, Vagococcus, Pectobacterium, Bacillus и немногих других, но в малом проценте от общего количества. Для изучения влияния бактерий B. thuringiensis на состав микробиоты колорадского жука была выбрана модель, в которой личинок жука заражали спорами, кристаллами или споро-кристаллической смесью бактерий. Полученные результаты свидетельствуют, что развитие бактериальной инфекции B. thuringiensis у личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata приводит к качественному и количественному изменению состава микробиоты кишечника, при этом отмечено различное влияние спор и кристаллического эндотоксина бактерий на основных представителей микробного сообщества. Изучение состава микробного сообщества в погибших после заражения насекомых показало, что происходит изменение состава в сторону преобладания бактерий, вызывающих развитие септицемии, при проникновении в гемоцель через поврежденный токсином бактерий БТ кишечник. Наблюдаемые изменения в составе бактериального сообщества, могут быть связаны с повышенным уровнем экспрессии антибактериальных белков, усилением активности антиоксидантной и детоксицирующих систем в кишечнике у изучаемых насекомых в ответ на инфекцию. Для изучения иммунного ответа личинок колорадского жука в ответ на бактериальную инфекцию мы проанализировали уровень экспрессии генов лектинов, катепсина Б и просапосин в ткани кишечника, то есть непосредственно в месте локализации и развития бактериального инфекционного процесса, а также в жировом теле – органе системного иммунного ответа насекомых. Установлено увеличение уровня экспрессии данных генов при инфекционном процессе. В качестве лабораторной модели исследования влияния бактериальной инфекции на состав микробиоты насекомых, была использована линия большой вощинной огневки, чувствительная к бактериям B. thuringiensis, и линия, устойчивая к бактериям B. thuringiensis. Поскольку чувствительность линий насекомых отличалась, для сравнения изменений, происходящих в микробиоте, мы использовали различные титры бактерий, для достижения одного уровня гибели насекомых (ЛК 40). Начат поиск симбионтов в кишечнике вощинной огневки и колорадского жука с целью их модификации для синтеза РНК интерферирующих конструкций, блокирующих различные физиологические системы насекомых. В частности, обнаружена бактерия Pseudomonas обладающая антогонистическими свойствами по отношению к бактериям БТ, способная к персистенции и быстрой микроэволюции в популяции насекомых. Отработана методика разрушения прочных тканей, таких как покровы насекомых и листовая пластинка растений, с помощью керамических и стеклянных шариков разного размера на гомогенизаторе с использованием жидкого азота. Это позволило провести детекцию ряда видоспецифичных генов микроорганизмов в динамике, при развитии инфекционного процесса (Гризанова и др., Virulence, 2019). Для подавления экспрессии с помощью РНК интерференции, проведен подбор генов, отвечающих за синтез продуктов различных систем жизнедеятельности (дыхательная, метаболизм белков, иммунная, антиоксидантная, детоксицирующая и пр.) у колорадского жука лабораторной и природной популяций. Установлено, что V-ATPase и ACT (beta-actin) являются перспективными для РНК интерференции, поскольку подавление экспрессии данных генов вызывает высокий уровень смертности колорадского жука (свыше 95% р <0,0001). Работы по поиску генов кандидатов для блокирования будут продолжены в следующем году. На вощинной огневке, как модельной системе, проведено блокирование генов, кодирующих металлопротеазы IMPI, гловерин и пероксидазу FPx. Изучено совместное действие РНК интерференции и энтомопатогенов. По предварительным данным, РНК-сайленсинг оказывал влияние на некоторые нецелевые гены насекомых. Этот вопрос нуждается в дополнительном изучении, так как возможен системный ответ различных генов и риск активации/блокирования нецелевых генов, которые могут повлиять на устойчивость насекомых к различным патогенам и стрессирующим факторам. Проведен поиск дополнительных способов доставки РНК интерферирующих продуктов в организм насекомых вредителей. В частности, для доставки дцРНК в кишечник насекомых фитофагов можно использовать эндофитные микроорганизмы, которые распространяются по тканям растения. Для этого проведен поиск и анализ эндофитной и ростостимулирующей активности различных бактерий рода Bacillus на картофеле. Применение эндофитных штаммов оказывало ростостимулирующее действие на растения картофеля, а также снизило распространенность ризоктониоза, что позволило получить более качественный и высокий урожай по сравнению с контрольными вариантами. Изучение микробиоценозов почвы, растений и насекомых при воздействии эндофитных микроорганизмов необходимо как для оценки перспектив использования эндофитных микробов для транспорта дцРНК, так и для оценки потенциальных рисков при распространении данных микроорганизмов в агроцинозе.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе реализации проекта проведен анализ и зарегистрированы отличия качественного и количественного состава кишечной микробиоты колорадского жука Leptinotarsa decemlineata (КЖ) природной и лабораторной популяций. В кишечнике КЖ, собранного в разных частях ареала распространения, были обнаружены представители семейств бактерий Enterobacteriaceae, Acinetobacter, Pseudomonas, Massilla, Bacteria, Lactococcus, Enterococcus и пр, а также бактерий рода Spiroplasma, которые были отмечены в большинстве выборок. Выделенные культивируемые микроорганизмы были определены до вида с помощью секвенирования (обнаружены и введены в лабораторную коллекцию представители родов Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Enterococcus, Serratia, Dietzia). Данные тестирования на насекомых свидетельствуют о том, что выделенные из кишечника КЖ культуры микроорганизмов могут быть патогенны по отношению к личинкам КЖ. В вариантах со скармливанием патогенных бактерий рода Bacillus, Pseudomonas, Serratia насекомые становятся малоактивными, отказываются от питания и теряют массу. В вариантах со скармливанием условно-патогенных бактерий рода Klebsiella и Enterococcus насекомые не отличались от контроля по скорости развития и массе. Можно предположить, что для колорадского жука они являются симбионтными представителями микробиоты кишечника. Совместное скармливание патогенных бактерий Bacillus thuringiensis (БТ) с бактерими Bacillus cereus и бактериями рода Serratia вызывают увеличение процента гибели КЖ, насекомые становились малоактивными, не питались, к седьмым суткам были мельче контрольных насекомых. Полученные данные свидетельствуют о том, что данные виды бактерий могут, как входить в видовое разнообразие кишечного сообщества, так и переключать стратегию поведения на «патоген» в различных условиях, например при ослаблении иммунитета хозяина, повреждении эпителия кишечника другими токсинами. Бактерии рода Pseudomonas, Klebsiella, Enterococcus не оказывали такого эффекта. Выявление активности факторов вирулентности БТ в средней кишке, а также участие защитных систем хозяина необходимо для их блокирования с помощью РНК интерференции при создании комплексных препаратов. В результате исследований было показано, что комбинированное действие спор и токсинов Cry бактерий БТ приводит к синергетическому эффекту в отношении смертности насекомых по сравнению с отдельными обработками. На ранних стадиях патогенеза реактивные формы кислорода высвобождаются, а перекисное окисление липидов увеличивается в средней кишке насекомых в вариантах, обработанных токсинами Cry. Развитие бактериальной инфекции БТ у личинок КЖ приводит к снижению численности бактерий рода Pseudomonas в микробиоте кишечника, а отдельное влияние спор и Cry-токсинов бактерий на основных представителей микробного сообщества остается незначительным. Бактерии БT начинают размножаться в кишечнике инфицированных насекомых, но их численность остается низкой через 48 часов после заражения (менее 1%). Подавление развития бактерий БТ, вероятно, связано с распознаванием антигена (галактозоспецифический лектин c-типа), повышенной экспрессией антибактериальных белков и метаболизмом (катепсин b, проактиваторный полипептид, подобным просапозину и т. д.), повышенной активностью антиоксидантной и детоксицирующей систем (глутатион трансфераза, эстераза) в средней кишке насекомых в ответ на инфекцию БT. Транскриптомный анализ (RNAseq) кишечников у личинок КЖ, зараженных бактериями БТ, подтвердил факт повышенного уровня экспрессии генов, ответственных за иммунный ответ, детоксицирующую систему и ряд метаболических процессов, важных при защите организма от Cry токсинов бактерий. За прошедший период проведен поиск дополнительных способов доставки РНК интерферирующих продуктов в организм насекомых вредителей. В частности, для доставки двухцепочечной РНК (дцРНК) в кишечник насекомых можно использовать эндофитные микроорганизмы, которые распространяются по тканям растения. Для этого проведен поиск и анализ эндофитной и ростостимулирующей активности различных бактерий рода Bacillus на картофеле. Выполнена оценка фунгицидного действия эндофитных штаммов рода Bacillus, ростостимулирующих свойств, физиологических показателей растений, проведен анализ микрофлоры почвы, биохимический состава клубней картофеля. Исходя из полученных данных для дальнейших работ был отобран ряд ростостимулирующих штаммов БТ, повышающих микробиологическую активность в почве. Кроме того, отработан альтернативный путь доставки дцРНК в организм насекомых, когда интерферирующая конструкция встроена в геном растения. Данный подход возможно исследовать на модельном растении, табаке, который КЖ не предпочитает. Методом модификации генома, получена линия табака, пригодная для питания личинок КЖ. Третьим методом доставки РНК интерферирующих продуктов в организм насекомых является непосредственное скармливание насекомым. Отработана методика принудительного скармливания точных доз дцРНК личинкам КЖ. С целью поиска штаммов бактерий БТ, потенциально перспективных для совместного использования с модифицированными симбионтными микроорганизмами, был проведен поиск и тестирование штаммов БТ, продуцирующих экзотоксин, на личинках мух и паутинном клеще. Продолжена работа по поиску целевых генов для РНК интерференции в организм КЖ. Подобраны праймеры на целевые гены для блокирования их активности в организме КЖ. Подобраны конструкции для блокирования эндонуклеаз в кишечнике насекомых, с целью повышения стабильности и эффективности РНК интерференции, за счет снижения уровня деградации РНК конструкции. Для расширения спектра целевых генов для РНК интерференции, на модельной системе, представителе отряда жесткокрылых, мучном хруще Tenebrio molitor проведен анализ функционального значения ювенильного гормона при инфекциях. На модельной системе - вощинной огневке Galleria mellonella установлено, что инъекция дцРНК, направленной на подавление уровня экспрессии одного гена, изменяла экспрессию нескольких нецелевых генов в кожных покровах и жировом теле. Полученные данные позволяют скорректировать протокол испытаний дцРНК на колорадском жуке, а именно необходим анализ системного ответа различных генов и учет рисков активации/блокирования нецелевых генов, особенно в части контакта насекомых с различными патогенами и стрессирующими факторами.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Для трансформации и использования в качестве продуцента дцРНК (РНК-интерференции) была выбраны бактерии Pseudomonas synxantha (геном: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP074078) и охарактеризованы их инсектицидная активность, антагонистическая активность по отношению к другим представителям микробиоты, устойчивость к антибиотикам. Получены клоны трансформированных бактерий, продуцирующих дцРНК. Заражение насекомых штаммом бактерий P. synxantha, продуцирующим РНК-интерферирующие продукты гена Актина, приводило к достоверному увеличению процента смертности (70-80%) личинок колорадского жука (КЖ) по сравнению с исходным штаммом бактерий. РНК-интерференция считается достаточно специфическим процессом, направленным на подавление определенных генов конкретного вида организма. Мы успешно подавили экспрессию IMPI в Galleria mellonella с помощью РНК-интерференции, и, как следствие насекомые в два раза больше погибали от грибной инфекции. Наше исследование показывает, насколько важны металлопротеиназы для грибного патогенеза, внося значительный вклад в вирулентность. Изучая уровни экспрессии генов, не являющихся мишенями, в присутствии дцРНК, разработанной для IMPI, мы отмечаем существенное увеличение экспрессии генов насекомых, связанных с иммунитетом и детоксикацией - что, как мы думаем, является компенсаторным механизмом потери IMPI. Наши данные подтверждают важную роль IMPI в локальной защите насекомых от грибковых протеаз, а также что РНК-интерференция может использоваться в сочетании с энтомопатогенными агентами в защите растений. Кишечник насекомых является первым и наиболее важным барьером против бактериальной инфекции Bacillus thuringiensis (Bt). Мы обнаружили, что воздействие токсинов Cry приводит к нарушению регуляции перекисного окисления липидов на поверхности эпителиальных клеток средней кишки личинок КЖ и к увеличению продукции АКМ. Мы установили, что окислительно-восстановительный баланс средней кишки личинок КЖ, обработанных только токсинами Cry в сублетальных дозах, успешно нейтрализуется неферментативными тиоловыми антиоксидантами. Это привело к нормализации уровня генерации АКМ до контроля уже через 48 часов после обработки. Тиолы имеют решающее значение для контроля окислительно-восстановительного баланса, потому что они являются одними из основных антиоксидантов насекомых, которые контролируют образование АКМ во время инфекций. Однако споры, добавленные к токсинам Cry, привели к критическому окислительно-восстановительному дисбалансу в средней кишке через 12–48 часов после обработки. Насекомые продемонстрировали высокий уровень продукции АКМ и перекисного окисления липидов при низкой тиоловой антиоксидантной активности. В совокупности эти результаты свидетельствуют об «окислительном стрессе» (сдвиге баланса между оксидантами и антиоксидантами) в средней кишке личинок КЖ. Поддержание оптимального окислительно-восстановительного баланса в средней кишке личинок КЖ, инфицированных Bt, модулируемых антиоксидантной системой, вероятно, имеет решающее значение как для реакций антибактериальной защиты насекомых, так и для защиты собственных клеток от АКМ. В развитии патогенеза в присутствии спор Bt и токсинов Cry сохраняется дисбаланс системы АКМ-антиоксидант, что, вероятно, способствует синергетическому действию клеток / спор бактерий и токсинов Cry. Личинки КЖ демонстрируют сложные локальные защитные реакции в средней кишке при заражении Bt, их спорами и / или токсинами Cry3A. Антиоксиданты средней кишки, ферменты детоксикации и реакции иммунитета используются для противодействия патогенезу, вызванному токсином Bt. Споры Bt синергетически усиливают токсичность токсинов Cry, что приводит к более высокому уровню смертности и скорости смерти насекомых. Нарушение регуляции АКМ и перегруженная антиоксидантная система, по-видимому, являются ключевыми особенностями патофизиологии бактериальной инфекции Bt.