КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 19-16-00049

НазваниеМетагеномика в оценке экологических функций почв: анализ почвенной микробиоты связанной с феноменом гигантизма растений черневой тайги Сибири

РуководительЛапидус Алла Львовна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет", г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ

2019 г. - 2021 г.

, продлен на 2022 - 2023. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№35 - Конкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-101 - Лесное хозяйство

Ключевые словаметагеномика, микробиота, биоинформатика, черневая тайга, гигантизм растений, повышение урожайности, биологически активные молекулы

Код ГРНТИ68.00.00

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Предметом исследования предлагаемого проекта являются сообщества микроорганизмов, населяющие уникальный тип сибирских лесов – черневую тайгу. Черневые леса представляют собой бореальную лесную формацию, ограниченную в своем распространении гипергумидными секторами Алтае-Саянской горной области. Черневая тайга характеризуется целым рядом экологических особенностей, из которых наиболее важной является феномен гигантизма многолетних травянистых растений, достигающих до 4,5 м. в высоту, и кустарников (Sorbus sibirica, Padus avium, Salix caprea), достигающих в этом регионе 18 метров в высоту и 30 см в диаметре. Травяной покров черневой тайги имеет среднюю высоту 1,5 м, а во многих местах – полностью скрывает, например, всадника на лошади. В черневой тайге практически полностью отсутствует напочвенный моховой покров, а сами почвы показывают исключительно высокий темп разложения растительных остатков и низкое содержание гуминовых кислот. Обильные осадки обуславливают активное вымывание питательных веществ из верхних горизонтов грунта. При этом уровень плодородия почвы очень высок, по имеющимся оценкам – вдвое выше плодородия удобряемых сельскохозяйственных угодий. Эти условия в какой-то степени схожи с условиями дождевого тропического леса. Известно, что основным драйвером почвообразования является группа процессов, связанных с микробиологической трансформацией соединений, содержащих элементы питания. Мобилизация элементов питания во многом зависит от функциональных характеристик и таксономического состава микробиома почв. Однако микробиом почв черневой тайги до сих пор остается практически неисследованным. Из-за этого невозможно построить полноценную модель круговорота вещества и энергии в почвах подобного типа и понять, какие факторы являются ключевыми для ее повышенного плодородия. Данный проект нацелен на выявление и параметризацию главных факторов, обусловливающих отличительные особенности экологических функций почв черневой тайги, таких как аномально повышенное эффективное плодородие и лесорастительные свойства. Научная задача - поиск ответа на вопрос о связи особенностей черневой тайги с химическими показателями почвы, режимом увлажнения, своеобразием состава микробиоты или всех факторов в совокупности. В качестве «рабочей гипотезы» мы полагаем, что аномально высокая продуктивность подобной системы связана со специфическим видовым составом, а также очень высокой скоростью круговорота вещества и энергии, в результате чего биомасса и питательные вещества, создаваемые микрофлорой и микрофауной, потребляются растениями «с колес», не образуя свойственных богатым почвам запасов гумуса и иных питательных веществ. Мы также полагаем, что анализ видового состава и обилия микроорганизмов в ризосфере растений и "фоновой" почве выполненный как классическими микробиологическими и протистологическими методами, так и современными методами метагеномного анализа, вкупе с данными о химических и физических свойствах почвы, позволит оценить вклад микробиоты в продуктивность таких почвенных сообществ и, в конечном итоге, всесторонне описать взаимодействие между этими растениями и микроорганизмами данной экосистемы и определить организмы и процессы, являющиеся ключевыми для возникновения феномена «растительного гигантизма». В рамках проекта впервые будут выполнены комплексные исследования подобных почвенных систем, включая широкомасштабные исследования метагенома почв, изучение видового состава и разнообразия микробиома, агрохимических показателей и других параметров почв. Мы планируем уделить особое внимание изучению метагенома почвы с использованием современных методов высокопродуктивного параллельного секвенирования и биоинформатического анализа полученных данных. Мы планируем провести как натурные исследования и наблюдения, так и лабораторные эксперименты, направленные на изучение физико-химических свойств почв черневой тайги. Предлагаемый проект послужит основой для создания в СПбГУ лаборатории метагеномики почв для проведения масштабных исследований уникальных почв России с применением современных комплексных подходов и методов анализа данных. Результаты таких исследований помимо фундаментального научного значения будут иметь практическое значение в плане поиска микроорганизмов стимулирующих рост растений, организмов – продуцентов антибиотиков, промышленных ферментов, лекарственных препаратов и других биоактивных веществ. Микробиота почв такой удивительной области Сибири как черневая тайга может оказаться уникальным источником таких биологически активных молекул, как антибиотики, витамины, иммуномодуляторы, иммунодепрессанты и другие, а понимание причин гигантизма может быть использовано в целях повышения урожайности сельскохозяйственных культур экологически чистыми методами.

Ожидаемые результаты
Глобальные изменения в окружающей среде и климате, нехватка продовольствия и энергии, потеря биоразнообразия и устойчивость экосистем являются одними из наиболее важных проблем текущего столетия. Как следствие, современное человечество должно заниматься сохранением и защитой почв, поскольку почвенные ресурсы являются основой продовольственной и экологической безопасности нации. Длительное использование почв в сельскохозяйственном производстве имеет широкий спектр негативных последствий для почвенных свойств, среди них: деградация органического вещества, увеличение эмиссии парниковых газов, изменение кислотности почвы, истощение почвы и т. д. Применение агротехнологий (вспашка и рыхление, применение минеральных и органических удобрений и т. д.) вызывает значительное изменение биогеохимических циклов, проводимых комплексом почвенных микроорганизмов. Почвы черневой тайги в этом смысле представляют собой уникальную площадку, отличающуюся исключительно высоким плодородием, реализованным за счет внутренних биотических и абиотических ресурсов, а не за счет агротехнических приемов, и при этом сохранившей «до-сельскохозяйственный» микробиом, не затронутый негативными последствиями многолетней сельскохозяйственной практики. Почвенная микробиота играет определяющую роль в поддержании гомеостаза почвенной экосистемы, выполняя ключевые функции в обеспечении роста и развития растений и активно участвуя в круговороте углерода. В рамках существующей научной парадигмы, почвенное органическое вещество имеет преимущественно микробное происхождение и состоит из индивидуальных химических веществ, объединенных нековалентными связями в гуминовые ансамбли (Семенов и др., 2013; Kleber, Johnson, 2010; Lehmann et al, 2008; Piccolo, 2002; Schmidt et al, 2011; Simpson et al, 2007; Von Lützow et al., 2006; Von Lützow et al., 2007; Von Lützow et al., 2008). Изучение кинетики и динамики процессов микробной трансформации органических веществ в условиях различных почв является основой в решении проблемы рационального использования плодородия почв и ограничения эмиссии CO2 в атмосферу при сельскохозяйственном использовании почв (Janzen, 2006). Понимание механизмов преобразования органического вещества в почве и управление балансом почвенного углерода является приоритетной задачей современных систем земледелия и агротехнологий, поскольку именно органическое вещество ответственно за многочисленные свойства почвы, среди которых функционирование агроэкосистем и продуктивность сельскохозяйственных культур (Gattinger et al, 2012; Powlson et al, 2011). Применение метагеномных подходов для мониторинга почвенной экосистемы существенно изменит наши представления о разнообразии и функциональной роли микробиома в поддержании здоровья почвы. Изменение запасов органического углерода является одним из наиболее важных показателей жизнедеятельности экосистемы (Orr, 2007; Janzen et al., 2011). Даже небольшие изменения запасов органического углерода могут привести к непропорционально большим положительным или отрицательным последствиям для ключевых свойств почвы. В данном случае особенности почвенного микробиома – основного драйвера процессов транформации и минерализации органики, могут служить универсальным и очень чувствительным индикатором состояния почвы, в том числе при оптимизации и биологизации систем земледелия (Pershina et al., 2018, Ivanova et al., 2017, Pershina et al., 2015, Чирак и др., 2013). Разработка новых подходов оценки влияния агробиотехнологий на здоровье и качество почвы в сочетании с метагеномной характеристикой и индикацией процесса трансформации органического вещества в почве – одно из наиболее перспективных направлений диагностики состояния потока органического углерода в наземных экосистемах, а, следовательно, и состояния почв в целом. В последнее десятилетие было инициировано несколько мировых проектов, направленных на исследования почвенных микробиомов, наиболее известным из которых является «Earth Microbiome project» (http://www.earthmicrobiome.org/). Одной из особенностей этого проекта является отсутствие образцов почв России. Стоит признать, что, несмотря на важность исследований микробиома во всех областях фундаментальной и прикладной биологии, Россия, по общему признанию, еще не находится на сколь бы то ни было приемлемых позициях в области метагеномных исследований. В рамках настоящего проекта предполагается кардинально улучшить сложившуюся ситуацию путем разработки новейших исследовательских программ изучения микробиот, которые будут заполнять пробелы в понимании важных процессов, осуществляемых микроорганизмами. Значительную помощь в реализации данного проекта окажет использование беспрецедентного многообразия российских почв, зачастую сформированных в уникальных природных условиях и имеющих большое сельскохозяйственное и экологическое значение. Основной целью проекта является не копирование или конкуренция с существующими метагеномными проектами, осуществляемыми в Северной Америке или Европе, а разработка и внедрение оригинальных подходов к исследованию метагеномов почвы, которые позволят получить качественно новые и практически значимые биологические знания. С этой точки зрения получение данных секвенирования с использованием современных высокопроизводительных технологий является лишь отправной точкой и основой для дальнейшего анализа. Результаты этого анализа должны быть практически значимы и поддержаны соответствующими агрохимическими, геологическими и биохимическими анализами, а также сопровождаться дальнейшими экспериментальными исследованиями. Как уже было отмечено, отставание отечественной науки в области метагеномики весьма велико, поэтому достижение соответствия мировому уровню, высокая научная и общественная значимость могут быть достигнуты за счет использования в проекте уникальных объектов. Без сомнения, таким объектом является почва черневой тайги. Анализ особенности почв, высота разнотравья в которых без использования каких-либо удобрений или агротехнических мероприятий, может достигать 2 м, безусловно вызовет общественный интерес. А если основы таких свойств (предположительно, коренящихся в таксономической и функциональной структуре микробиома) будут основательно изучены и поняты, то в перспективе можно рассчитывать на получение специфических микробных препаратов, способных хотя бы частично внедрять уникальные свойства почв черневой тайги в практику традиционного земледелия. Особенно это может быть актуальным для таких агротехник, как "нулевая обработка", во многом типологически сходной с условиями вегетации черневой тайги. Потенциал микробиот черневой тайги может оказать неоценимое влияние на процессы создания препаратов нового типа, обеспечивающих быстрое и эффективное разложение пожнивных остатков. В свою очередь, значение анализа ранее не изученных уникальных почв на предмет поиска новых биологически активных соединений трудно переоценить. В основе многих современных антибиотиков лежат биологически активные соединения природного происхождения. Так как основными продуцентами таких молекул являются растения и микроорганизмы, то анализ образцов почвы с широким видовым разнообразием живущих в них бактерий имеет огромный потенциал для обнаружения новых биологически активных веществ. Результаты данного исследования будут актуальны не только с точки зрения создания новых лекарственных препаратов, но и для фундаментального научного понимания процесса синтеза подобных соединений в организмах бактерий. Таким образом, реализация скрытого потенциала уникальных объектов - одно из перспективнейших направлений в российских метагеномных исследованиях. (Список литературы в приложении)

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проект «Метагеномика в оценке экологических функций почв: анализ почвенной микробиоты связанной с феноменом гигантизма растений черневой тайги Сибири» посвящен исследованию сообществ микроорганизмов, населяющих уникальный тип сибирских лесов – черневую тайгу. Научной задачей проекта является поиск ответа на вопрос о связи особенностей черневой тайги с химическими показателями почвы, режимом увлажнения, своеобразием состава микробиоты и/или всех факторов в совокупности. Все задачи, намеченные в рамках проекта на 2019 год, выполнены. Для сбора метаданных, включающих географические, климатические, геоботанические и агрохимические данные, а также данных о естественной продуктивности биотопов за прошедший год проведено 2 летние (середина июля) и 2 осенние (конец сентября-начало октября) экспедиции в районы черневой тайги Новосибирской, Томской и Кемеровской областей. При определении конкретных точек сбора проб мы ориентировались на разные типы почв, чтобы максимально охватить почвенное и растительное разнообразие исследуемых ареалов. Исследования проводились путем сравнения характеристик почв черневой тайги и обычных почв прилегающих регионов. Всего было отобрано 275 образцов почв и ризосферы (почвы с корней) Crepis sibirica, Aconitum septentrionale. Из которых 140 были отобраны для анализа таксономического разнообразия бактерий, архей, грибов и протистов с использованием методов NGS секвенирования. Все полученные характеристики и метаданные образцов, собраны в единую таблицу аналитических данных, которая даст начало базе данных черневой тайги. Для анализа продуктивности почв черневой тайги был проведен вегетационный опыт по оценке плодородия 2-х типов почв, используемых в данной работе. По результатам анализа агрохимических показателей было выявлено, что в почве черневой тайги по сравнению с ее олиготрофным вариантом наблюдается более благоприятная величина рН, больше обменных оснований, более высокое содержание общего углерода и общего азота, а также подвижного фосфора, что свидетельствует о высоком плодородии черневой почвы и существенном статистически-достоверном превосходстве над контрольным вариантом (опыты с контрольными растениями). Также в лабораторном эксперименте подтвердилась высокая целлюлозолитическая активность почвы черневой тайги, которая в значительной степени определяет одно из важных свойств данной почвы – высокую скорость разложения растительных остатков, которое, является одним из ключевых факторов поддержания почвенного плодородия. Почвенно-гидрологические константы почв так же оказались заметно выше в почвах черневой тайги, чем в почвах относительно олиготрофных экосистем, что подтверждает еще одну нашу начальную гипотезу о том, что повышенное содержание углерода микробной биомассы обусловлено формированием благоприятных температурно-влажностных условий. Данные о разнообразии микробного сообщества почв биотопов различной трофности, полученные для 140 проб методами NGS секвенирования, показали, что - среди классифицируемых фил в образцах почвы черневой тайги преобладают Proteobacteria, Acidobacteria и Verrucomicrobia; - наблюдается заметное уменьшение относительного числа протеобактерий с увеличением глубины; - по таксономической структуре микробиоты верхнего слоя почвы черневой тайги из различных регионов сходны друг с другом; - обнаружено значительное число неклассифицируемых операционнo-таксономическиx единиц (OUT), требующих дальнейшего изучения в связи с тем, что они могут принадлежать ранее не охарактеризованным микроорганизмам. Анализ разнообразия амебоидных протистов показал, что исследуемые почвы достаточно богаты видами, в том числе редкими видами голых амеб. На морфологическом уровне были обнаружены представители 12 родов амеб, что больше нежели найдено в большинстве доступных фаунистических исследований. Кроме того, что выявлены представители всех трех крупных классов амеб (Discosea, Tubulinea и Variosea), нами обнаружены амебы рода Thecochaos - крайне редкого рода амеб, последний раз изолированного более 100 лет назад. Подобные находки редких видов говорят о достаточно высоком уровне микробного богатства изучаемых почв. В ходе дальнейшей работы над проектом мы планируем подробнее изучить различия в видовом составе и структуре микробных сообществ черневой тайги. По результатам работ по разработке алгоритмов и созданию программных продуктов для анализа данных настоящего проекта, опубликовано 4 статьи, 3 из которых в изданиях, входящих в первый квартиль (Q1) по базе данных http://www.scimagojr.com/, и двое тезисов (одни из которых так же опубликованы в журнале Q1 – BMCBioinformatics). Все публикации содержат ссылку на финансовую поддержку гранта РНФ и ссылку на СПбГУ. Web СТРАНИЦА ПРОЕКТА http://cab.spbu.ru/grant/rsf-19-16-00049/

Публикации

1. Антипов Д., Райко М., Лапидус А., Певзнер П. Plasmid detection and assembly in genomic and metagenomic data sets Genome Research, 2019 Jun; 29(6):961-968. (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1101/gr.241299.118

2. Бушман Т.Дж., Акоб Д.М., Боху Т., Бейер А., Войке Т., Шапиро Н., Лапидус А., Кленк Л.П., Кюсель К. Draft Genome Sequence of Mn(II)-Oxidizing Bacterium Oxalobacteraceae sp. Strain AB_14 Microbiology Resource Announcements, 2019, Oct 24; 8 (43). pii: e01024-19 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1128/MRA.01024-19

3. Тагирджанов А., Шлемов А., Гуревич А. NPS: scoring and evaluating the statistical significance of peptidic natural product–spectrum matches Bioinformatics, Volume 35, Issue 14, July 2019, Pages i315–i323 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btz374

4. Цао L., Гуревич A., Александр KL., Наман CB., Леао T., Глухов E., Луццатто-Кнаан T., Варгас F., Куинн К., Буслимани A., Нотия LF., и др MetaMiner: A Scalable Peptidogenomics Approach for Discovery of Ribosomal Peptide Natural Products with Blind Modifications from Microbial Communities Cell Systems, Oct 10. pii: S2405-4712(19)30312-6 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1016/j.cels.2019.09.004

5. Кондратенко Ю.Д., Коробейников А.И., Лапидус А.Л. CDSnake: Snakemake pipeline for retrieval of annotated OTUs from paired-end reads using CD-HIT utilities BMC Bioinformatics, 20(Suppl 17):516 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1186/s12859-019-3122-9

6. Лапидус А.Л. Биоинформатика микромира 2-й Российский Микробиологический Конгресс. МАТЕРИАЛЫ КОНГРЕССА, - (год публикации - 2019)

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Научной задачей междисциплинарного проекта «Метагеномика в оценке экологических функций почв: анализ почвенной микробиоты связанной с феноменом гигантизма растений черневой тайги Сибири» является поиск ответа на вопрос о связи особенностей черневой тайги с химическими показателями почвы, режимом увлажнения, уникальной флорой, своеобразием состава микробиоты и/или всех факторов в совокупности с точки зрения возможного применения полученных знаний для повышения плодородия почв. Для решения столь сложной задачи научный коллектив проекта объединяет специалистов с обширными знаниями в области почвоведения и экологии, геоботаники и лесной экологии, микробиологии и протистологии, молекулярной биологии и биоинформатики. Современные методы анализа генетической и геномной информации в настоящее время оперируют огромными массивами данных, обработка которых напрямую зависит от программного обеспечения. В связи с этим в рамках проекта решаются в том числе и задачи создания новых и усовершенствования уже существующих биоинформатических подходов и программ, направленных на всесторонний анализ особенностей уникальных, ранее неописанных, микробиот (микроорганизмов, составляющих то или иное микробное сообщество) и их микробиомов (совокупного генома рассматриваемого сообщества). В течение отчетного периода было проведено исследование агрохимических параметров почв с использованием традиционных методов. Определены содержание общего органического углерода и азота, подвижные формы соединений фосфора и калия, а также содержание аммонийных и нитратных форм азота. Интерпретация данных агрохимического анализа позволила установить, что, темно-серые почвы черневой тайги представляют собой своеобразный вариант текстурно-дифференцированных почв, отличающихся от европейских аналогов из нечерневых лесов развитостью гумусового профиля и повышенным содержанием элементов питания, что способствует формированию особого трофического статуса с выраженным феноменом гигантизма. Формирование экосистем черневой тайги определяется климатическими условиями и географическим положением. Так, низкие горные хребты выступают барьерами для воздушных масс и концентрируют влагу на склонах западной экспозиции, что приводит к выпадению большого количества осадков, формированию влажного климата, наличию мощного снежного покрова. Все это приводит к специфике гидрологического режима почв и создает в почвенном профиле набор уникальных термических условий, способствующих небольшой глубине промерзания, либо к отсутствию промерзания вообще. В ходе выполнения работ по проекту были заложены несколько экспериментов с разложением целлюлозосодержащих субстратов в почвах черневой тайги. Данные эксперименты были призваны дать информацию о таксономическом составе и динамике микробных сообществ почвы в ходе разложения. При этом исследовалось разложение листового опада и соломы овса в почвах черневой тайги в обеих локациях; при отборе на двух сроках (4 и 8 мес.); при добавлении и в отсутствии дополнительных элементов питания (NPK). Результаты предварительного мониторинга скорости разложения субстратов и, в том числе, индикаторных полос бумажных фильтров, показал, что более высокие темпы разложения характерны для листового опада, чем для соломы, а для Томской почвы темпы разложения выше, чем для Новосибирской. В связи с этим наиболее перспективными для дальнейшей разработки микробных препаратов для сельского хозяйства, вероятнее всего, являются томские почвы. Этот результат будет дополнительно проверяться. Для ответа на вопрос смогут ли микробные сообщества черневой тайги проявлять свои свойства в других условиях, были поставлены два «трансплантационных» эксперимента. Один с использованием салата, семена, которого перед посадкой вымачивали в суспензии почвы черневой тайги (Томск) и высаживали в олиготрофную зональную почву (Томск). В качестве контроля, для исключения действия питательных веществ, находящихся в суспензии, для инокуляции использовали точно такую же суспензию, но приготовленную из почвы, прошедшей электронно-лучевую стерилизацию, причем полнота стерилизации контролировалась с помощью посева на питательные среды. Второй аналогичный опыт был поставлен с редисом и дерново-подзолистой почвой с опытного поля ВНИИСХМ. Как в случае салата, так и корнеплодов редиса отмечен статистически значимый положительный эффект инокуляции, являющийся, вероятно, следствием имплантации микробиома черневой тайги в ризосферу растений. Для более детального анализа этого феномена были отобраны почвенные и ризосферные образцы для дальнейшего исследования. При этом в поставленном эксперименте выявлена следующая проблема – и олиготрофная почва из Томска, и дерново-подзолистая почва опытного поля ВНИИСХМ оказались чрезвычайно бедны питательными веществами и, как следствие, продемонстрировали очень низкую продуктивность, поэтому полученные данные, хотя и демонстрируют эффект инокуляции на фоне очень низкой продуктивности, тем не менее, требуют повторения с использованием более плодородных образцов почв, тем более, что речь идет о таком необычном феномене. В ходе экспедиций в черневую тайгу в 2020 году было собрано 110 образцов, из которых в последствии была выделена ДНК. Выделенная ДНК была использована для подготовки библиотек для секвенирования для анализа таксономического разнообразия бактерий, архей, грибов и протистов:- для 90 образцов проб почв горизонта А и образцов ризосферы Crepis sibirica и Aconitum septentrionale созданы 16S библиотека и проведено их секвенирование; - секвенирование района малой субъединицы 18S рРНК проб почв горизонта А, проведено для 60 образцов;- библиотека для секвенирования внутреннего транскрибируемого района ITS 1f-ITS2 грибов была создана и просеквенирована для 90 образцов проб почв горизонта А, а также для образцов ризосферы Crepis sibirica и Aconitum septentrionale. При сравнении проб верхнего слоя почвы черневой тайги и контрольных образцов в обеих локациях были определены бактериальные таксоны, наиболее отличающиеся по представленности. Среди проб образцов осени 2019 было обнаружено 11 значимо отличающихся таксономических групп, тогда как в весенних пробах 2020 года, несмотря на в целом меньшее разнообразие в каждой пробе по сравнению с весной, было обнаружено 72 отличающихся группы. Таблица с перечнем таксонов представлена в отчете. Особый интерес среди обнаруженных таксонов вызывает бактерия, относящаяся к некультивируемому классу OM190, тип Planctomycetes. Она присутствует в значительных количествах только в образцах почв черневой тайги из Новосибирска во всех сезонах, и по результатам таксономической классификации относится к новому семейству. Для данного таксона по результатам биннинга гибридных полногеномных сборок данных секвенирования второго и третьего поколения удалось получить практически полный геном общая длина которого примерно 4.7 Мб.Помимо класса OM190 (тип Planctomycetes со способностью к анаммоксу - анаэробному окислению аммония) было выявлено несколько видов бактерий, специфичных для почв черневой тайги, и, возможно, влияющих на ее высокую продуктивность. К ним относятся некультивируемые виды LD1-PA13 (фила WS3, Latescibacteria, описанный как компонент морских осадочных сообществ, также осуществляющих анаммокс), и один из видов семейства Saprospiraceae, способных к гидролизу и утилизации сложных источников углерода и являющихся важным компонентом активного ила. В ходе дальнейшей работы планируется оценить обогащенность этих бактерий и их роль в продуктивности почвы по результатам трансплантационных экспериментов.В ходе анализа альфа-разнообразия верхнего почвенного слоя показано, что пробы из Новосибирска по внутреннему видовому разнообразию превосходят пробы из Томска, и в каждом случае пробы почвы черневой тайги показывают большее разнообразие, чем контрольные. При сравнении сезонной динамики мы наблюдаем уменьшение разнообразия весной - вероятнее всего, за счет сокращения доли разлагателей листового опада. В отчетном году доисследован и описан вид Thecochaos fibrillosum, выделенный в 2019 году из почв района Новосибирска. Этот вид был последний раз отмечен в 1913 году и с тех пор никогда не попадал в поле зрения исследователей, а само его существование, равно как и существование многоядерных текамебид, неоднократно подвергалось сомнению. Проведенный морфологический и молекулярный анализ показал, что этот вид относится к отряду Thecamoebida и представляет собой первого многоядерного представителя класса Discosea. Для трех точек сбора почв в Новосибирской локации проведено полногеномное секвенироание микробиот с последующей сборкой полученных данных и анализом их на предмет поиска биосинтетических генных кластеров (БГК) вторичных метаболитов с потенциальной биологической активностью. Было показано, что в пробе черневой тайги наблюдается значительно больше БГК по целому ряду важных классов вторичных метаболитов, известных своими биологическими активностями широкого спектра (к ним относятся многие антибиотики, токсины, противоопухолевые агенты): нерибосомные пептиды (NRPS), поликетиды (PKS), терпены (бактериоцины) и арилполиены (arylpolyene). Сравнение найденных БГК с крупнейшей базой известных БГК MIBiG не показала ни одного существенного совпадения, что может означать наличие большего числа неизвестных прежде БГК и, как следствие, новых вторичных метаболитов в черневой тайге. В 2021 году планируется более детальный анализ полногеномных сборок данных из обеих локаций, которые будут закончены до конца 2020 года. На основании проведенных к настоящему времени исследований можно сделать вывод о том, что черневая тайга является уникальной экосистемой Западной Сибири, почвы которой могут представлять собой фрагменты «скрытой продовольственной корзины» России. Эта «корзина» – не собственно источник новых пахотных почв, а совокупность данных о причинах повышенной продуктивности почв, образующихся в уникальной комбинации биоклиматических, геогенных и микробиологических факторов почвообразования. Как подчеркнул Президент России В. В. Путин (https://nauka.tass.ru/nauka/4940904) "отечественные ученые сделали значительный шаг вперед в относительно новых междисциплинарных областях, таких как наука о жизни, где исследования ведутся на стыке биологии, химии, генетики, медицины, биоинформатики, физики". Наш проект ставит своей целью внести свой посильный вклад в новые междисциплинарные исследования, направленные на решение актуальных задач сельского хозяйства.

Публикации

1. Абакумов Е., Лойко С., Лащинский Н., Истигечев А., Кулемзина А., Смирнов А., Райко М., Лапидус А. Highly productive boreal ecosystem Chernevaya taiga-unique rainforest in Siberia Preprints, 2020090340 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.20944/preprints202009.0340.v1

2. АБАКУМОВ Е.В., ЛОЙКО С.В., ИСТИГЕЧЕВ Г.И., КУЛЕМЗИНА А.И., ЛАЩИНСКИЙ Н.Н., АНДРОНОВ Е.Е., ЛАПИДУС А.Л. ПОЧВЫ ЧЕРНЕВОЙ ТАЙГИ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ — МОРФОЛОГИЯ, АГРОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, МИКРОБИОТА Сельскохозяйственная биология, том 55, номер 5, с. 1018-1039 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.15389/agrobiology.2020.5.1018rus

3. Гуревич А.А., Райко М.П. metaFlye: scalable long-read metagenome assembly using repeat graphs Nature methods, 17, 1103–1110 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1038/s41592-020-00971-x

4. Кондратенко Ю., Крорбейников А., Лапидус А. CDSnake: Snakemake pipeline for retrieval of annotated OTUs from paired-end reads using CD-HIT utilities BMC Bioinformatics, 21, 362 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1186/s12859-020-03709-w

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В ходе 3-его этапа проекта «Метагеномика в оценке экологических функций почв: анализ почвенной микробиоты связанной с феноменом гигантизма растений черневой тайги Сибири» были выполнены все поставленные задачи. Впервые за время изучения растительности черневой тайги получены количественные характеристики различий в высоте генеративных побегов между сообществами черневой тайги и травяными лесами подтайги. Показано, что эти различия существенны, статистически достоверны и не связаны с систематическим положением сравниваемых видов. Для условий черневой тайги среднемаксимальные высоты генеративных побегов составили: Aconitum septentrionale 241,2±3,78 см Crepis sibirica 209,1±2,87 см Heracleum dissectum 241,9±3,36 см Bupleurum aureum 212,2±8,29 см Cirsium helenioides 212,5±4,30 см В подтаежной зоне аналогичный показатель для тех же видов растений Aconitum septentrionale 193,7±5,93 см Crepis sibirica 180,6±4,81 см Heracleum dissectum 209,5±3,54 см Bupleurum aureum 133,7±2,90 см Cirsium helenioides 168,6±7,28 см Для всех исследованных в Новосибирском регионе видов разница среднемаксимальной высоты генеративных побегов между двумя местообитаниями оказалась статистически значимой и составила от 28,5 до 78,5 см. Поскольку в анализ были включены представители трех различных семейств, различия между местообитаниями нельзя трактовать как специфическую реакцию отдельного вида или систематической группы. При определении почвенно-гидрологических констант для почв черневой тайги и для почв олиготрофных местообитаний были выявлены существенные различия между исследуемыми объектами. Прежде всего, они определены гранулометрическим составом и содержанием гумуса в мелкоземе. Величины полной влагоемкости органогенных горизонтов почв черневой тайги составляли до 95%, в то время как в почвах олиготрофных местообитаний полная влагоемкость составляла всего 60%. Величины наименьшей влагоемкости показали такие же тренды изменений между сравниваемыми объектами. В случае гигроскопической влаги различия были еще более выражены. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что почвы черневой тайги являются более влагоемкими по всем показателям гидрологических констант, что неизбежно сказывается на их плодородии и потенциальной продуктивности, а также на составе микробиоты. Полученные данные по 13-С ЯМР спектроскопии гуминовых кислот (ГК), показавшие, что степень ароматичности в ГК почв черневой тайги повышена, подтверждаются полученными данными о доминировании этих компонентов в составе низкомолекулярной фракции ГК. Показано, что в почвах черневой тайги накапливаются низкомолекулярные ароматические компоненты, в то время, как, в почвах со сниженной микробиологической активностью и наличием трудно трансформируемой хвойной подстилки наблюдается накопление высокомолекулярной разветвленной алифатической фракции в составе ГК. Поскольку гуминовые вещества обладают биопротекторной и физиологической активностью, они могут быть причиной повышенной продуктивности черневой тайги. Несмотря на то, что мощность подстилок в почвах черневой тайги меньше, чем в почвах олиготрофных лесов, они могут удерживать большее количество влаги, что важно для формирования почвенного климата. В отчетном году были получены данные эксперимента с инокуляцией почв с использованием более плодородной дерново-подзолистой почвы и проанализированы микробиоты почвы черневой тайги в ризосфере инокулированных растений. Также исследовалось влияние инокуляции компонентов микробиоты почвы черневой тайги на микробиоту ризосферы инокулированных растений. В результате таксономического анализа было выявлено около 20 тыс. сиквенс-вариантов (ASV), относящихся к 24 прокариотическим филам. Доминантами, как это характерно для микробных сообществ почвы, были представители Proteobacteria, Firmicutes, Verrucomicrobiota, Bacteroidota, Actinobacteriota, Acidobacteriota и неклассифицируемых вариантов. Во всех образцах были выявлены представители архей. Оценивались также различия между ризосферными микробиотами у растений, инокулированных «живым» экстрактом и ризосферными микробиотами, инокулированными стерильными экстрактами. Нас в первую очередь интересовали таксоны, которые присутствуют в «живых» и отсутствуют в стерильных ризоферных вариантах, так как именно они могут обуславливать стимуляцию роста растений. Для выяснения роли 9 самых дифференциально представленных сиквенс-вариантов был проведен поиск в базе PubMed соответствующих публикаций. Анализ литературных источников показал, что бактерии вида Lysinibacillus участвуют в как собственно стимуляции в обычных и стрессовых условиях, так и в защите растений от грибных фитопатогенов, а также повышенных концентраций цинка и кадмия. Chitinophagaceae – довольно большое семейство почвенных микроорганизмов, среди которых, по литературным данным, встречаются и рост стимулирующие микроорганизмы, и микроорганизмы, подавляющие грибные патогены растений. В семействе Sphingobacteriaceae выявлены микроорганизмы с большим потенциалом синтеза биоактивных компонентов, а также супрессии грибных патогенов. Из полученных данных также видно, что две трети выявленных таксонов относятся к неклассифицируемым даже на уровне типа прокариотам. С целью оценить участие грибного компонента микробных сообществ в процессах разложения целлюлозосодержащих субстратов для образцов, изучаемых в рамках проекта, были проведены лабораторные исследования микроскопических грибов. Видовой состав микроскопических грибов, обнаруженных в почвах черневой тайги, заметно отличается от комплексов микромицетов референсных почв олиготрофных сосняков. Показано, что большая часть изолятов, выделенных из почв черневой тайги, принимает участие в утилизации листового опада. В целом, полученные данные согласуются с представлениями о высокой активности микробных сообществ почв черневой тайги. Высокие показатели биомассы, численности, разнообразия и биохимической активности почвенных микромицетов очевидно свидетельствуют о том, что, наряду с другими микроорганизмами, грибы оказывают заметное влияние на высокую продуктивность растений в уникальных биоценозах черневой тайги Западной Сибири. Изучение таксономического состава грибной микробиоты в разные сезоны и в разных точках отбора показало, что наиболее распространенными таксонами являются типы Mortierellomycota, Basidiomycota и Ascomycota. Предполагается, что представители Ascomycota преимущественно участвуют в ранних стадиях разложения листового опада, а затем вытесняются представителями Basidiomycota, особенно базидиомицетовыми дрожжами. В целом аналогичная тенденция наблюдалась как для бореальной, так и для небореальной тайги. В то же время самый многочисленный класс грибов в образцах черневой тайги представлен Mortierellomycetes - сапротрофами, обнаруживаемыми в почве на гниющих листьях и другом органическом материале. Всего несколько видов составляют почти половину генетического материала грибов в почвах образцов. Виды Mortierella могут служить очень ценными разложителями, увеличивая эффективность поглощения питательных веществ, используя источники углерода (включая полимеры, такие как целлюлоза или хитин) и способствуя росту растений. Среди наиболее дифференциально многочисленных таксонов мы также обнаружили представителей отдела Glomeromycota - арбускулярных микоризных (АМ) симбиотрофов. Ранее было показано, что они способны увеличивать количество питательных веществ, доступность воды, обеспечивать гормональная регуляцию и индуцированную микоризой устойчивость растений-хозяев. АМ грибы могут создавать гифы, которые соединяют корни многих растений. Эти сети позволяют перераспределять питательные вещества между растениями, в результате чего одни растения растут лучше, а другие - хуже. Мы считаем, что в уникальных условиях бореальных лесов избыток питательных веществ приводит к гигантскому росту одних растений и нормальному развитию других из-за доступности питательных веществ. Таким образом, говоря о потенциальном применении наших результатов в сельском хозяйстве, мы можем рассматривать арбускулярную микоризу (AM) как усилитель доступности питательных веществ для растений-хозяев. Из этого можно сделать вывод, что традиционные методы внесения удобрений (farmer fertilization practices - FFP), основанные на добавлении питательных веществ, могут быть оптимизированы с точки зрения их воздействия на микоризные грибы, тем самым увеличивая богатство и разнообразие грибных сообществ и через них влияя на продуктивность почвы. Анализ бета-разнообразия грибных и прокариотных сообществ, развившихся в почве черневой тайги под влиянием трех целлюлозосодержащих субстратов-соломы ячменя, сосновых опилок и чистой целлюлозы (фильтровальная бумага) – показал, что на каждом из проанализированных субстратов развивается весьма специфическое грибное и прокариотное сообщество с очевидными доминантами, такими как например, грибной род Cirennalia в случае опилок или в случае соломы – грибной род Lecythjphora. Детальный анализ дифференциально представленных таксонов показал, что таксонов, строго специфичных для определенного типа субстрата, не так уж много. Специфичным является, скорее, сам набор таксонов и их пропорции в каждом из субстратов. Следующим шагом в наших исследованиях мы считаем выделение из ризосферы растений, инокулированных суспензиями почвы черневой тайги (в стерильном вегетационном опыте) штаммов-микроорганизмов в чистые культуры. Но для реализациии потенциала микробных сообществ почв черневой тайги в качестве агентов разложения целлюлозосодержащих растительных остатков нужны, скорее всего, не отдельные микроорганизмы, а их ассоциации, исследования их целлюлозолитического потенциала и перспектив их использования для создания микробных препаратов. В рамках проекта было оценено обилие и разнообразие видов голых лобозных амеб в почвенных пробах из черневой тайги, взятых в районе города Томска в 2020 и 2021 годах, идентифицированы наиболее часто встречающиеся виды, получены морфологические и молекулярные данные для описания 3 новых для науки видов - 2-х видов, принадлежащих к описанным ранее родам, и 1 нового рода. В отношении обилия и видового разнообразия голых лобозных амеб отмечено различие между пробами из черневой тайги и образцами олиготрофной почвы (T3 2021 г.) из того же региона С помощью технологий секвенирования второго и третьего поколений получены полногеномные данные почвенных микробиот изучаемых локаций. Самые протяженные фрагменты в полученных нами сборках соизмеримы с длинами бактериальных геномов. Так в пробе N2_SP длина такого фрагмента составила 6 620 245 пар оснований (при средней длине бактериального генома 5 Мб) – результат, недостижимый при использовании только технологий второго поколения (454, Illumina). Определена таксономическая принадлежность МАG (Metagenome Assembled Genome) в самых протяженных контигах. Один их них - unclassified Pseudomonas (taxid 2583993) – был восстановлен благодаря использованию секвенирования третьего поколения. При сборке коротких ридов Illumina этот MAG не выявлен. В каждой из проанализированных проб удалось собрать схожие по длине фрагменты. Для каждой из описанных выше проб были также получены гибридные сборки данных полногеномного секвенирования, полученных с использованием как технологии Illumina, так и ONT. Необходимо отметить, что сборка некоторых проб (N3_SU и T3_SP) требовала более чем 512 Gb оперативной памяти, делая невозможным завершение процедуры сборки с учетом доступных ресурсов. Чтобы снизить потребление памяти, была выполнена процедура фильтрации прочтений, в результате которой были убраны все прочтения, с медианным покрытием 1, что заметно уменьшило требования к памяти за счет уменьшения сложности входных данных. На первый взгляд, гибридные сборки привели к получению несколько более коротких фрагментов, чем в случае использования только данных ONT, но полученные в этом случае последовательности контигов отличаются более высоким качеством. Полногеномные сборки также были использованы для оценки разнообразия биосинтетических генных кластеров биологически активных молекул в исследуемых почвах. С использованием инструмента antiSMASH 5.2.0 были выявлены вероятные биосинтетические генные кластера (БГК) биологически активных молекул в метагеномных сборках из локаций в Новосибирске (N1, N3, летние пробы) и Томске (T1, T3, весенние пробы). Было показано, что использование двух библиотек секвенирования (illumina+ONT), особенно для образцов из Черневой Тайги, существенно улучшает сборку с точки зрения количества найденных БГК (в 2-10 раз в зависимости от класса БГК). Более 80% предсказанных БГК в образцах черневой тайги относятся к синтезирующим молекулы четырех классов: нерибосомные пептиды, поликетиды, терпены, рибосомные пептиды с пост-трансляционными модификациями (RiPP). Сопоставление обнаруженных БГК с базами известных кластеров биологически активных молекул различных классов MIBiG и известных нерибосомных пептидов не выявило значимых совпадений. Для широкомасштабного сопоставления обнаруженных БГК с крупнейшей публичной базой известных белков NCBI nr был разработан специализированный набор скриптов. Сопоставление показало, что только 15% из открытых БГК представлены в NCBI nr, а остальные являются вероятно новыми и требуют дальнейшего изучения. Полученные данные метагеномных последовательностей и связанные с ними метаданные депонированы в Европейский нуклеотидный архив (ENA, (https://www.ebi.ac.uk/submission/) для анализа с помощью вычислительной аналитической цепочки MGnify (Study: PRJEB38410. Accession numbers: ERZ3996211, ERZ3987161, ERZ3979537, ERZ3979533), а также в аналитическую базу метагеномных данных IMG/M (http://img.jgi.doe.gov/m - Accession numbers 3300045982, 3300045956, 3300048540, 3300045726). GenBank accession numbers изолятов грибов: Таблица 2 в приложении. По итогам этапа 2021 года мы показали, что в системе “климат-почва-микробиота-растения” бактерии и грибы являются важной составляющей гигантизма. Выделенные виды-кандидаты в дальнейшем планируется использовать в коллаборации с коллегами-биотехнологами для разработки и применения биоудобрений в системе экологически чистого земледелия. Информация о публикациях в СМИ, посвященных результатам проекта, с упоминанием Фонда: 1 Российский научный фонд (https://rscf.ru/news/agriculture/uchyenye-vyyasnyat-prichiny-gigantizma-rasteniy-v-sibirskikh-dzhunglyakh/) 2. Научная Россия - электронное периодическое издание (https://scientificrussia.ru/articles/issledovateli-vyyasnyat-prichiny-gigantizma-rastenij-v-sibirskih-dzhunglyah?utm_source=yxnews&utm_medium=desktop&utm_referrer=https%3A%2F%2Fyandex.com%2Fnews%2Fsearch%3Ftext%3D) 3. Взгляд - деловая газета https://vz.ru/news/2021/4/7/1093402.html?utm_source=yxnews&utm_medium=desktop&utm_referrer=https%3A%2F%2Fyandex.com%2Fnews%2Fsearch%3Ftext%3D 4. ПОИСК https://poisknews.ru/themes/biologiya/sibirskie-dzhungli-uchyonye-vyyasnyat-prichiny-gigantizma-rastenij/ 5. Год науки и технологий 2021 https://xn--80afdrjqf7b.xn--p1ai/news/640/ 6. Большая Азия https://bigasia.ru/content/news/science_and_education/uchyenye-rf-ishchut-prichiny-poyavleniya-gigantskikh-rasteniy-v-sibirskoy-tayge/ 7. Рамблер https://news.rambler.ru/science/46171689-rossiyskie-uchenye-reshili-raskryt-taynu-chernevoy-taygi/ WEB страницы проекта: http://cab.spbu.ru/grant/rsf-19-16-00049/ https://github.com/alexeigurevich/rsf-19-16-00049_bgc_analysis

Публикации

1. Глотова А. А., Лойко С.В., Истигичев Г.И., Кулемзина А.И., Абакумов Е.В., Лапидус А.Л., Смирнов А.В. Description of Leptomyxa silvatica n. sp. (Amoebozoa, Tubulinea, Leptomyxida), a new soil amoeba species from Chernevaya taiga soil of West Siberia, Russia Protistology, - (год публикации - 2021) https://doi.org/10.21685/1680-0826-2021-15-4-7

2. Гуревич А.А. A Multi-Omics Characterization of the Natural Product Potential of Tropical Filamentous Marine Cyanobacteria Marine Drugs, 19, 1, 20. (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/md19010020

3. Ирина Кравченко, Екатерина Тихонова, Алексей Конопкин, Алла Лапидус Study of soil rhizobacteria from Chernevaya Taiga in Western Siberia and their potential effect on plant growth Nexo Revista Científica, - (год публикации - 2022) https://doi.org/10.5377/nexo.v35i02.14637

4. КИРЦИДЕЛИ И.Ю., ВЛАСОВ Д.Ю., ИЛЬЮШИН В.А., АБАКУМОВ Е.В. ЛАПИДУС А.Л. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ В ПОЧВАХ ЧЕРНЕВОЙ ТАЙГИ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ МИКОЛОГИЯ И ФИТОПАТОЛОГИЯ, - (год публикации - 2022) https://doi.org/10.31857/S0026364822020076

5. Поляков В., Лойко С., Истигечев Г., Лапидус А., Абакумов Е. Elemental and Molecular Composition of Humic Acids Isolated from Soils of Tallgrass Temperate Rainforests (Chernevaya taiga) by 1H-13C HECTCOR NMR Spectroscopy Agronomy, 11(10), 1998 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/agronomy11101998

6. Райко М., Сокорнова С., Лапидус А. Fungal metagenome of Сhernevaya taiga soils: Taxonomic composition, differential abundance and factors related to plant gigantism Journal of Fungi, номер 7, том 11, выпуск 908 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/jof7110908

7. Абакумов Е., Лойко С., Истигечев Г., Лапидус А. Physical properties as a key factor in the soil functioning in Chernevaya Taiga (Western Siberia) IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, Том 862, Выпуск 118 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1088/1755-1315/862/1/012036

8. - Учёные выяснят причины гигантизма растений в «сибирских джунглях» Российский научный фонд, - (год публикации - )

9. - ИССЛЕДОВАТЕЛИ ВЫЯСНЯТ ПРИЧИНЫ ГИГАНТИЗМА РАСТЕНИЙ В «СИБИРСКИХ ДЖУНГЛЯХ» «Научная Россия» - электронное периодическое издание, 12.04.2021 11:34 1585 (год публикации - )

10. - Российские ученые решили раскрыть тайну черневой тайги Взгляд - деловая газета, 7 апреля 2021 (год публикации - )

11. - “Сибирские джунгли”. Учёные выяснят причины гигантизма растений ПОИСК, 07.04.2021 (год публикации - )

12. - Ученые выяснят причины гигантизма растений в «сибирских джунглях» Год науки и технологий, 07.04.2021 (год публикации - )

13. - УЧЁНЫЕ РФ ИЩУТ ПРИЧИНЫ ПОЯВЛЕНИЯ ГИГАНТСКИХ РАСТЕНИЙ В СИБИРСКОЙ ТАЙГЕ Большая Азия, 07.04.2021 (год публикации - )

14. - Российские ученые решили раскрыть тайну черневой тайги Об этом сообщает "Рамблер". Далее: https://news.rambler.ru/science/46171689/?utm_content=news_media&utm_medium=read_more&utm_source=copylink Рамблер, 07.04.2021 (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
не указано