КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-16-00108

НазваниеРазработка экспрессных иммуноаналитических и молекулярно-генетических методов с целью количественного определения маркерных белков при контроле мясной продукции

РуководительЖердев Анатолий Виталиевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2019 г. - 2021 г.  , продлен на 2022 - 2023. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№35 - Конкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-301 - Технология пишевых продуктов

Ключевые словаПереработка мяса, мясопродукты, контроль состава пищевых продуктов, качество пищи, тест-методы, идентификация сырья, видоспецифичные биомаркеры, иммунохроматография, иммуноферментный анализ, молекулярная диагностика, гистология, двумерный электрофорез

Код ГРНТИ65.59.03


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В современном обществе количество и качество потребляемых мясных продуктов рассматривается как фактор, оказывающий существенное влияние на состояние здоровья населения. Принципиальное значение имеет достоверная информация об источниках сырья при производстве мясопродуктов, поскольку многие технологии предусматривают замену части собственно мясного сырья (мышечной ткани) белок-содержащими добавками различного животного или растительного происхождения. Кроме того, распространенными становятся случаи фальсификации продуктов с использованием мяса других видов животных, не предусмотренного технологией. Особенно актуален этот аспект в условиях импортозамещения продукции. Для эффективного контроля состава мясных продуктов на всех стадиях производства необходимы как высокочувствительные и специфичные методы анализа, реализуемые в специальных лабораториях, так и экспрессные тест-системы, позволяющие проводить быстрое тестирование без использования специального оборудования. Задачей планируемого исследования является разработка новых тест-систем для экспрессного контроля мясопродуктов, обеспечивающих подтверждение соответствия продуктов заявленным параметрам по составу. Будут разработаны и апробированы тест-системы, характеризующиеся экспрессностью, минимальной трудоемкостью и высокой информативностью (получение в ходе одного анализа сведений как о наличии контаминант, так и об их содержании). Проект направлен на реализацию новых методических решений, которые при проведении характеристики состава мясопродуктов исключают необходимость в стационарном приборном обеспечении и в сложных, продолжительных методиках пробоподготовки и анализа. Предлагаемая система объединяет методики, основанные на принципах иммуноферментного (ИФА) и иммунохроматографического анализа (ИХА), а также системы молекулярно-генетического анализа в мембранном формате. Достоверность интерпретации результатов тестирования и возможность количественного определения содержания аналита обеспечивается за счет применения оптических видеоцифровых детекторов (специализированных портативных устройств или серийно производимых средств мобильной коммуникации). Принципиальное значение имеет реализация модульного принципа анализа, позволяющего с учетом специфики решаемой задачи использовать рецепторные молекулы разной специфичности, не прибегая к дополнительной модификации системы. Система разрабатываемых методик позволит решить следующие задачи: 1. Определение доли в продукте основного мясного источника - мышечной ткани определенного животного. 2. Определение суммарного содержания в продукте мясного сырья из разных источников. 3. Контроль отсутствия в составе продукта запрещенных видов мясного сырья. 4. Определение доли в продукте основных добавок немясного происхождения. Результатами выполнения проекта станут иммунохимические (ИФА и ИХА) и молекулярно-генетические аналитические методики, позволяющие получать следующую информацию о составе мясопродуктов: - содержание в продукте мышечной ткани определенного животного (ИФА и ИХА с видеоцифровой регистрацией); - суммарное содержание в продукте мясного сырья (ИФА и ИХА с видеоцифровой регистрацией); - наличие либо отсутствие в составе продукта запрещенных видов мясного сырья (качественный ИХА, компонуемый отдельным раствором антител требуемой специфичности + качественный ИХА без внешних реагентов, молекулярно-генетический анализ в мембранном формате); - содержание в продукте основных добавок немясного происхождения (ИФА и ИХА с видеоцифровой регистрацией). Задача достоверной идентификации видовой принадлежности мясного сырья будет решаться посредством использования специально выбираемых белков-маркеров и антител определенной селективности, а также видоспецифических олигонуклеотидных зондов. При этом использование термостабильных белков обеспечит сохранение конформации распознаваемых структур, а с учетом существующих данных о видоспецифических отличиях аминокислотных последовательностей белков и локализации антигенных эпитопов будут выбраны антитела необходимой специфичности как для распознавания определенных источников сырья, так и для оценки суммарного содержания мяса из систематически близких источников (мясо млекопитающих, мясо птицы и др.). С учетом предшествующего опыта исполнителей и анализа литературных данных в качестве биомаркеров рассматриваются такие мышечные и сывороточные термостабильные белки, как тропонин, кальдесмон, триозофосфатизомераза и др. Исполнители располагают соответствующими охарактеризованными антителами либо данными по специфичности коммерчески доступных антител, использовавшихся в аналогичных исследованиях. На начальном этапе проекта будет проведена дополнительная биоинформатическая характеристика кандидатных белков с учетом их гомологии и профилей антигенности для выбора наиболее эффективной панели биомаркеров. При необходимости будут дополнительно получены антитела к определенным пептидам, соответствующим отобранным линейным антигенным детерминантам (заказ у специализированных лабораторий). Проект сочетает решение фундаментальных проблем, связанных с изучением закономерностей биорецепторного распознавания, и формирование основы для практико-ориентированных разработок. При реализации тест-систем будет изучена специфичность антител к структурно близким соединениям, обеспечивающая возможность видовой идентификации сырья. Будут изучены структурные измерения белков-биомаркеров, происходящие при различной обработке мясного сырья, и проведена оценка их влияния на антигенное распознавание. Панируется изучение доступности распознаваемых в ходе анализа антигенных детерминант и выбор наиболее эффективных процедур пробоподготовки, разрушающих экранирующие детерминанты межмолекулярные комплексы. Будут охарактеризованы структурно-функциональные взаимосвязи для конъюгатов специфических антител с маркерами и выбраны протоколы получения конъюгатов оптимального состава, обеспечивающие максимальную чувствительность и точность детекции. Для молекулярно-генетического анализа на основании имеющегося задела процессы формирования комплементарных комплексов нуклеиновых кислот будут перенесены в формат тест-полоски, что обеспечит простоту и экспрессность тестирования. Будет охарактеризована эффективность выделения и степень сохранения иммунореактивности антигенами при разных способах пробоподготовки тестируемых проб мясной продукции. В рамках многофакторной оптимизации условий проведения иммуноанализа будут обоснованы режимы, для которых достигается максимальная достоверность измеряемых параметров. Новые аналитические системы будут апробированы на широкой панели мясопродуктов, получаемых по разным технологиям, и сопоставлены с референтными аналитическими методами. В соответствии с существующей практикой двухуровневого скринингового и подтверждающего контроля будут разработаны подтверждающие аналитические методы, дополняющие скрининговые тестирования и основанные на количественном гистологическом анализе и двумерном электрофорезе. Сочетание этих методов минимизирует риски при экспертизе мясопродуктов и обеспечит доказательную базу для арбитражных заключений. Существующие на сегодняшний день разработки экспрессных иммунохимических и молекулярно-генетических средств контроля мясопродуктов ограничиваются единичными методическими решениями для выявления индивидуальных параметров (например, подтверждение халяльности пищи, оценка добавок растительного сырья). Разработка комплекса средств тестирования, охватывающих основной спектр задач технологического и потребительского контроля, будет осуществлена в рамках проекта впервые. Особенно актуально внедрение предлагаемой разработки в практику полевых и производственных лабораторий на этапе входного контроля сырья. Методические решения, разрабатываемые в рамках проекта, рассматриваются как основа для широкого применения подходов экспрессного анализа для контроля качества пищевой продукции, предотвращения рисков, защиты здоровья и безопасности населения, что и определяет значимость и масштаб планируемых исследований.

Ожидаемые результаты
В результате работ по проекту будет проведен выбор приоритетных биомаркеров, обеспечивающих достоверность выводов о видовой принадлежности используемого мясного сырья, оптимальных форматов проведения анализа и режимов пробоподготовки мясного сырья. Выбор будет основан на результатах уже проведенного предварительного экспериментального скрининга кандидатных термостабильных белков мышечной ткани и сыворотки крови животных и уточнен по результатам биоинформатического анализа с целью выбора наиболее эффективных эпитопов для специфического распознавания. Степень сохранения аффинности используемых в анализе модифицированных препаратов иммунореагентов будет контролироваться с помощью таких взаимодополняющих методов, как фотометрические, флуориметрические, атомно-силовая микроскопия, регистрация поверхностного плазмонного резонанса (с использованием системы Biacore). Будет изучена стабильность антигенных детерминант при разных процедурах обработки мясного сырья, выбраны и обоснованы оптимальные режимы пробоподготовки. Исходя из свойств синтезированных иммунореагентов, будет проведено изучение образования иммунных комплексов в различных форматах анализа, выбор и обоснование оптимальных схем проведения анализа для каждого контролируемого антигена. Планируется охарактеризовать влияние компонентов реакционной среды на эффективность выявления целевых аналитов, выбрать и обосновать наиболее эффективные способы экспрессной пробоподготовки мясного сырья. Результатом выполнения проекта будет разработка и апробация тест-систем, обеспечивающих: - качественный контроль отсутствия в мясопродукте неразрешенных фальсифицирующих добавок; - количественный контроль соответствия мясопродукта заявленному составу по содержанию мясного сырья регламентированной видовой принадлежности. В тест-системах будет реализован модульный принцип, позволяющий с учетом специфики решаемой задачи использовать рецепторные молекулы разной специфичности, не прибегая к дополнительным синтезам и модификациям тест-системы. Методы должны быть пригодны для контроля мясопродуктов с пробоподготовкой не более 30 мин., продолжительность анализа должна составлять 30-40 мин для ИФА и 10-15 мин для мембранных тестов. Точность количественного определения должна быть в диапазоне 7-10% для ИФА и 10-15% для мембранных тестов с видеоцифровой регистрацией. Преимущества разрабатываемых тест-систем: • Сокращение продолжительности анализа с нескольких часов до 10-40 минут. • Снижение требований к уровню подготовки и квалификации технических специалистов (применение иммунохроматографических тестов не требует даже минимального лабораторного опыта). • Низкая стоимость в расчете на одно определение. • Высокая производительность тестирования. В комплекс разрабатываемых и апробируемых методов контроля состава мясной продукции будут, наряду со скрининговыми методами, входить подтверждающие методы анализа: - методика для идентификации источников мясного сырья, основанная на детекции биомаркеров с помощью двумерного электрофореза; - методика для характеристики компонентного состава мясопродуктов, основанная на оценке содержания различных видов сырья с помощью количественного гистологического анализа. Разрабатываемые в проекте системы, сочетающие высокие аналитические характеристики, новые методические решения и высокую производительность, будут обладать серьёзными конкурентными преимуществами по сравнению с существующими средствами контроля качества и безопасности продуктов питания. Полезный (научный, технический, технологический, социальный) эффект разработки состоит в следующем: - Разрабатываемые решения позволят проводить комплексную оценку сырья и продуктов питания, сократив тем самым экономические издержки, связанные с реализацией традиционных аналитических решений, и снизив риски негативного воздействия производимой мясной продукции на население. - Разрабатываемые подходы могут быть реализованы на имеющемся в большинстве аналитических лабораторий оборудовании и, таким образом, не потребуют переоснащения и замены приборов, используемых в повседневных операциях. - Создание экспрессных форматов анализа, независимых от приборного обеспечения, позволит использовать разрабатываемые аналитические системы в качестве единого средства мониторинга в пищевых цепях производства и потребления. - Предложенные в рамках проекта решения могут быть перенесены на другие контролируемые соединения и другие технологические процессы, способствуя тем самым развитию отечественной биотехнологии и пищевой безопасности. Установленные в ходе выполнения работ закономерности иммунного распознавания белковых биомаркеров в составе нативного и термообработанного сырья сформируют основу для применения иммуноаналитических методов при решении различных контрольных и диагностических задач. Планируемые способы обнародования результатов, полученных в ходе выполнения проекта, включают: - подготовку и публикацию научных статей – не менее 12 статей, из них не менее 9 – в изданиях, индексируемых базами данных Web of Science или Scopus; при этом для обеспечения высокого уровня представления результатов и расширения круга знакомящихся с ними специалистов не менее 5 статей будут опубликованы в журналах, относящихся к первой или второй квартилям Scopus SJR; - патентование новых методических решений, связанных с новыми способами получения реагентов для анализа и/или новыми способами детекции (заявка на патент на изобретение либо полезную модель); - экспериментальные образцы новых тест-систем, доступные для проведения совместных испытаний с организациями - потенциальными конечными пользователями; - популярные тексты для потенциальных конечных пользователей тест-систем, публикуемые в отраслевых бумажных изданиях или интернет-ресурсах.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Выполняемый проект направлен на разработку новых экспрессных иммуноаналитических и молекулярно-генетических методов для контроля состава мясопродуктов и выявления случаев нарушения установленных рецептур. Выявляемые нарушения могут быть связаны с заменой части собственно мясного сырья (мышечной ткани) белок-содержащими добавками животного или растительного происхождения, а также с использованием мяса других видов животных, не предусмотренного технологией при производстве продуктов питания. Разработки 2019 г. включали выбор и обоснование приоритетных биомаркеров для эффективной иммунодетекции с помощью антител, а также нуклеотидных зондов для молекулярно-генетической детекции мясного сырья в готовых продуктах, характеристику иммунореагентов, сравнительную оценку различных форматов иммуноанализа и пробоподготовки и разработку систем иммуноферментного и иммунохроматографического анализа для выбранных пилотных объектов. Определен набор требований для выбора молекулярного идентификатора, контролируемого с помощью разрабатываемых аналитических методов. Проведен анализ кандидатных биомаркеров, в том числе методами биоинформатики. В качестве биомаркеров были охарактеризованы белки мышечной ткани тропонин I (ТНI), тропонин Т, миоглобин (МГ), мышечная енолаза, а также соевый ингибитор трипсина (СИТ) как маркер добавляемого в мясопродукты соевого сырья. Для генетической диагностики отобран участок генов atp8–atp6 и цитохром b, а также специфичные повторы Bov-tA SINE, SINE PRE-1, LINE CR-1 как индикаторы для групп-специфического анализа. Для детекции каждого из дискриминируемых видов – источников мясного сырья, а также групп видов были выбраны праймеры с учетом наиболее вариабельных участков, оптимальной температуры отжига, длины амплифицированного фрагмента. С учетом особенностей технологических процессов получения мясопродуктов охарактеризована стабильность и сохранение антигенных свойств выбранных биомаркеров при разных температурных воздействиях. Показано, что увеличение температуры до 80°С не приводит к существенным изменениям антигенных свойств ТНI и снижение аналитического сигнала при фиксированной концентрации ТНI не превышает 15%. Однако после инкубации ТНI при 90°С наблюдалось существенное падение аналитического сигнала – на 40%. При более интенсивной обработке дальнейшей инактивации не наблюдалось; сохранялось 60% иммунореактивности образцов ТНI, что позволит использовать биомаркер для характеристики готовых мясопродуктов, но с учетом предварительной калибровки. Образцы МГ показали чувствительность к нагреванию при температуре выше 80°С. Так, например, при температуре 80°С остаточный аналитический сигнал составлял 30%, а при температуре 90°С – 5%. Образцы СИТ характеризовались стабильностью при нагревании. При увеличении температуры инкубации до 90°С падение аналитического сигнала не превышало 25%. Для извлечения биомаркеров из мясного сырья или готового продукта были разработаны процедуры пробоподготовки, направленные как на максимальное извлечение аналита, так и на нивелирование влияния сопутствующих соединений. Кроме того, особое внимание уделялось снижению числа операций и времени пробоподготовки. Так, например, термостабильность ТНI позволила интенсифицировать его экстракцию из образцов мясного сырья и готовых продуктов введением стадии двухминутной инкубации при 100°С, во время которой часть белков выпадала в осадок. Образцы измельчали, гомогенизировали с использованием фосфатно-солевого раствора, содержащего 0.5М КCl, инкубировали при 100°С в течение двух минут и центрифугировали. На основании результатов тестирования были предложены оптимальные методики пробоподготовки при анализе ТНI, МГ, СИТ. Проведен предварительный скрининг препаратов антител – кандидатных компонентов разрабатываемых тест-систем. Отобраны наиболее аффинные препараты антител, охарактеризованные по способности к связыванию антигена в разных форматах иммуноанализа. Для иммуноферментного анализа показано, что сокращение продолжительности конкурентной стадии и стадии взаимодействия с антивидовыми антителами, меченными пероксидазой, с часа до 15 минут, не приводит к потере чувствительности и амплитуды детектируемого сигнал, что позволяет сократить общую продолжительность анализа с 2 ч 30 мин до 1 часа. Предел обнаружения СИТ составил 3.5 нг/мл, диапазон определяемых концентраций – 7.7-110 нг/мл. Показана возможность использования разработанной методики ИФА для определения наличия препаратов сои в мясных продуктах. При разработке ИХА были использованы препараты коллоидного золота (КЗ), которые характеризовались средним значением размера наночастиц КЗ 38.1±5.8 нм. Электронная микроскопия показала высокую степень однородности частиц по размерным характеристикам. Получены конъюгаты КЗ со специфическими антителами к ТНI. Выбор условий конъюгирования антител с КЗ проводили на основании фотометрических данных, отражающих агрегацию продукта данной реакции при высокой ионной силе раствора. Для ИХА ТНI был использован «сэндвич»-формат анализа, позволивший достигнуть максимальной чувствительности определения. Разработка анализа включала оптимизацию концентраций иммунореагентов, состава мультимембранного композита, режимов предобработки и сушки мембран. На основе результатов оптимизации были изготовлены тест-полоски и проведены эксперименты по иммунохроматографическому определению ТНI в стандартных растворах и экстрактах, полученных из препаратов мяса различных видов животных. Методика ИХА ТНI характеризуется пределом обнаружения 50 нг/мл при диапазоне определяемых концентраций 120-500 нг/мл. Показано, что разработанные тест-системы специфически взаимодействуют с ТНI из мяса млекопитающих (говядина, свинина). При этом ТНI, присутствующий в мясе птицы (курица, индейка), разработанная система не детектирует. Разработанный протокол был применен для характеристики разных сортов колбас. Для выполнения проекта в ФНЦ пищевых систем им. Б.М. Горбатова получены образцы мясопродуктов, содержащих известные количества биомаркеров и подвергнутые технологической обработке. Разработанные тест-системы позволяют специфически детектировать ТНI в образцах, полученных после термообработки, что позволяет проводить оценку содержания мышечной ткани млекопитающих в различных мясных продуктах. Сформированная реагентная база и результаты методических разработок обеспечивают перехода к следующему этапу работ – расширению ряда разрабатываемых иммуноаналитических систем для других выбранных биомаркеров и разработке тест-систем для экспрессного контроля специфических олигонуклеотидов, сочетающих их амплификацию и выявление продукта по формированию окрашенных комплексов на тест-полоске.

 

Публикации

1. Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Конъюгаты наночастиц и рецепторных молекул: получение, характеристика и применение в экспрессных аналитических системах Химия биологически активных веществ. "ХимБиоАктив-2019", Межвузовский сборник научных трудов, стр. 17-19 (год публикации - 2019)

2. Смирнова Н.И., Зверева Е.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Разработка иммуноферментного анализа для определения соевого сырья в продуктах питания Прикладная биохимия и микробиология, - (год публикации - 2020)

3. Хвостов Д.В. , Вострикова Н.Л., Жердев А.В., Зверева Е.А., Курзова А.А. Идентификация и количественное определение мышечной ткани на основе контроля прототипических пептидов с использованием метода мониторинга заданных реакций Аналитика и контроль, Т. 23, № 4. С. 20-25 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.15826/analitika.2019.23.4.012

4. Чернуха И.М., Вострикова Н.Л., Хвостов Д.И., Зверева Е.А., Таранова Н.А., Жердев А.В. Methods of identification of muscle tissue in meat products prerequisites for creating a multi–level control system Theory and practice of meat processing, V. 4, № 3, p. 32–40 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.21323/2414–438X–2019–4–3–32–40

5. Жердев А.В., Вострикова Н.Л. Detection of protein biomarkers in meat products for control of their authenticity and composition Program book of the 16th ASEAN Food Conference, October 15-18, 2019, Bali, Indonesia, Program book of the 16th ASEAN Food Conference, October 15-18, 2019, Bali, Indonesia, p. 69 (год публикации - 2019)

6. Жердев А.В., Зверева Е.А., Смирнова Н.И., Дзантиев Б.Б. Immunochemical assays of protein biomarkers for authenticity and composition control of meat and dairy foodstuffs XX Euroanalysis Conference. Abstracts & Proceedings. September 1-5, 2019. Istanbul, Turkey, XX Euroanalysis Conference. Abstracts & Proceedings. September 1-5, 2019. Istanbul, Turkey, p. 215-216 (год публикации - 2019)

7. Зверева Е.А., Поправко Д.С., Хвостов Д.В., Вострикова Н.Л., Жердев А.В., Чернуха И.М., Дзантиев Б.Б. Development of immunoassays for troponin I to control content and source of raw meat in products of its processing Abstracts of the 9th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA 2019). November 5-8, 2019. Prague, Czech Republic, Abstracts of the 9th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA 2019). November 5-8, 2019. Prague, Czech Republic, p. 258 (год публикации - 2019)

8. Зверева Е.А., Смирнова Н.И., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Immunochemical control of raw materials’ sources in the production of meat and dairy food IMA-2019. 11th International Conference on Instrumental Methods of Analysis. Modern Trends and Applications. Abstract Book. September 22-25, 2019. Ioannina, Greece, IMA-2019. 11th International Conference on Instrumental Methods of Analysis. Modern Trends and Applications. Abstract Book. September 22-25, 2019. Ioannina, Greece, p. 52 (год публикации - 2019)


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проект направлен на решение задачи создания экспрессных и методически простых тест-систем для подтверждения состава мясных пищевых продуктов. Существующие разнообразные лабораторные методы характеризуется значительной стоимостью тестирования и большими временными интервалами между пробоотбором и получением информации о результатах, а имеющиеся разработки экспресс-тестов ограничены минимальным числом контролируемых компонентов (например, для подтверждения халяльности) и пр. Основные разработки 2020 года были направлены на создание иммунохроматографических тест-систем разной специфичности и оценку их эффективности при контроле исходного сырья и конечных пищевых продуктов, в том числе для количественной оценки содержания контролируемых компонентов. Принципиальное значение для проведения тестирования имеет выбор распознаваемого антителами молекулярного идентификатора. Такой биомаркер должен быть уникальным для контролируемых видов сырья, характеризоваться стабильным высоким содержанием в мышечной ткани, иметь отличия в строении антигенных детерминант у разных животных. Кроме того, требуется стабильность или как минимум сохранение антигенных свойств маркера при различных видах обработки, которым подвергается мясное сырье. Для выбора наиболее перспективных биомаркеров были использованы данные протеомного анализа белков мышечных тканей животных разных видов и сопутствующих компонентов мясопродуктов, проводившегося в совместных работах ФИЦ Биотехнологии РАН и ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН. С учетом установленных критериев в качестве биомаркеров были выбраны скелетный тропонин I, миоглобин и иммуноглобулины. В качестве основного формата проведения иммунохроматографического анализа (ИХА) был реализован «сэндвич»-формат с формированием комплексов (антитело – антиген (биомаркер) – антитело). Для «сэндвич»-иммуноанализа с помощью мембранных тест-полосок в тестовой зоне на поверхности рабочей мембраны иммобилизовали антитела, а на отдельную мембрану наносили антитела, конъюгированные с наночастицами золота. На основании проведенного скрининга отобраны пары антител, характеризующиеся максимальными амплитудами аналитического сигнала (интенсивностями окрашивания в тестовой зоне) и минимальными пределами обнаружения биомаркеров. Определены концентрации иммунореагентов, наносимых на тест-полоску, состав реакционной среды, время инкубации и другие параметры, обеспечивающие воспроизводимый высокочувствительный анализ с минимальным уровнем неспецифического связывания окрашенной метки. Для проведения иммунохроматографического тестирования в продуктах питания разработана простая пробоподготовка, которая заключалась в гомогенизации проб, экстракции белка-биомаркера буфером специально подобранного состава и центрифугировании. Для термостабильных белков как одна из стадий пробоподготовки использовалась быстрая – 2-3 мин. – тепловая денатурация неспецифических белковых компонентов матрикса пробы. В результате проведенных исследований разработаны иммунохроматографические тест-системы для детекции скелетного тропонина I, миоглобина и иммуноглобулина. Скелетный тропонин I, термостабильный биомаркер мышечных тканей, детектировался с пределом выявления 25 нг/мл. Показано, что использование моноклональных антител определенной специфичности позволяет с близкой эффективностью выявлять тропонин I в пробах мяса млекопитающих (говядина, свинина, баранина, конина). При этом тропонин I, присутствующий в мясе птицы (курица, индейка), разработанная система не детектирует, исключая тем самым из рассмотрения добавки дешевого сырья, часто наблюдаемые при фальсификации мясопродуктов. Тест-система позволяет количественно оценивать содержание говядины в курином фарше, начиная с 1%-ной добавки и сохраняет свою эффективность при тестировании пищевых продуктов, подвергнутых термообработке (в частности, разных видов колбас). Общее время анализа – 20 мин. Миоглобин, несмотря на меньшую термостабильность как нативного белка, сохраняет антигенные свойства при температурной и ферментативной обработке, являясь тем самым эффективным альтернативным биомаркером для селективной оценки разных видов мясного сырья. ИХА миоглобина характеризовался пределом определения 5 нг/мл (до 0.01% мясных добавок). Реализованная тест-система специфически выявляет свиной миоглобин и не взаимодействует с миоглобинами других видов млекопитающих и птиц. Продолжительность тестирования – 15 мин. Эффективным подходом для распознавания источников и оценки общего содержания мясного сырья является также обнаружение иммуноглобулинов, которые присутствуют в плазме всех позвоночных и могут быть легко экстрагированы из мышечной ткани. Предел обнаружения иммуноглобулинов G свиньи в оптимизированном ИХА составил 9.8 нг/мл, что соответствует выявлению до 0.1% свинины. При другой комплектации иммунореагентов обеспечивается селективное выявление иммуноглобулинов Y курицы. Рассмотрены возможности количественной оценки содержания контролируемого мясного сырья на основании видеоцифровой регистрации интенсивности окрашивания аналитической зоны тест-полоски в результате проведения тестирования. Средствами такой регистрации могут быть портативные оптические детекторы, в том числе видеокамеры серийных коммуникационных устройств, а также стандартные офисные сканеры. Измерения характеризуются среднеквадратичным отклонением определяемой концентрации биомаркера, не превосходящим 10%. Эффективность разработанных тест-систем подтверждена в ходе их испытаний на примерах пищевых мясных продуктов известного состава, подготовленных и предоставленных ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН. Полученные результаты позволяют рассматривать иммунохроматографические тест-системы как эффективное средство проверки аутентичности и заявленного состава мясных продуктов. Рассмотрены возможности интеграции разрабатываемых средств экспрессного тестирования с системами подтверждающего анализа. Сформирован атлас 2D-электрофореграмм белков, экстрагированных из образцов основных видов мясного сырья (говядина, свинина, баранина, мясо кролика, курицы и индейки) и мясопродуктов, проведена идентификация и характеристика отобранных биомаркеров (тропонин I, миоглобин). Разработана методика количественной гистологической оценки содержания компонентов в мясных продуктах, основанная на обработке гистологических препаратов с помощью адаптированных компьютерных программ анализа изображений. В рамках подготовки к планируемой на 2021 г. разработке тест-систем, интегрирующих амплификацию специфических участков нуклеиновых кислот и выявление образующихся продуктов с помощью мембранных тест-полосок (т.е. перевод молекулярно-генетической диагностики во внелабораторные форматы анализа), определены и синтезированы меченные биотином и флуоресцеином праймеры для эффективной детекции мяса свиньи и курицы методом рекомбиназной полимеразной амплификации, проверена их реакционная способность. Изготовлены тест-полоски с использованием стрептавидина и антител к флуоресцеину как средства детекции продуктов изотермической амплификации.

 

Публикации

1. Вострикова Н.Л., Жердев А.В., Зверева Е.А., Чернуха И.М. Quality and safety of meat products in Russia: Results of monitoring samples from manufacturers and evaluation of analytical methods. Current Research in Nutrition and Food Science, V. 08, N. 1, P. 41-47 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.12944/CRNFSJ.8.1.04

2. Гендриксон О.Д., Зверева Е.А., Вострикова Н.Л., Чернуха И.М., Дзантиев Б.Б., Жердев А.В. Lateral flow immunoassay for sensitive detection of undeclared chicken meat in meat products Food Chemistry, article 128598 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.128598

3. Гендриксон О.Д., Зверева Е.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Sensitive lateral flow immunoassay of undeclared chicken ingredient in meat products NANOCON 2020 Conference proceedings, - (год публикации - 2021)

4. Зверева Е.А., Бызова Н.А., Гендриксон О.Д., Поправко Д.С., Беличенко К.А., Дзантиев Б.Б., Жердев А.В. Immunochromatographic detection of myoglobin as a specific biomarker of porcine muscle tissues in meat products. Applied Sciences, V. 10, N. 21, article 7437, p. 1-13 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/app10217437

5. Зверева Е.А., Поправко Д.С., Гендриксон О.Д., Вострикова Н.Л., Чернуха И.М., Дзантиев Б.Б., Жердев А.В. Lateral Flow Immunoassay to Detect the Addition of Beef, Pork, Lamb, and Horse Muscles in Raw Meat Mixtures and Finished Meat Products Foods, V. 9, N. 11, article 1662, p. 1-13 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/foods9111662

6. Вострикова Н.Л., Жердев А.В., Зверева Е.А., Чернуха И.М. Формирование комплекса методик для двухуровневой системы скринингового и арбитражного контроля состава мясопродуктов, направленного на выявление случаев нарушения установленных рецептур Сборник тезисов Всероссийской с международным участием онлайн-конференции "Современная биотехнология: актуальные вопросы, инновации и достижения", Стр. 40-42 (год публикации - 2020)

7. Гендриксон О.Д., Зверева Е.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммунохроматографические тест-системы для проверки халяльности продуктов Актуальная биотехнология, N 3 (34), стр. 102-103 (год публикации - 2020)

8. Зверева Е.А. , Гендриксон О.Д. , Смирнова Н.И., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммунохимический анализ белковых биомаркеров для контроля подлинности и состава мясных продуктов Актуальная биотехнология, N 3 (34), стр. 112-113 (год публикации - 2020)


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Выполняемый проект направлен на разработку новых экспрессных иммуноаналитических и молекулярно-генетических методов для контроля состава мясопродуктов и выявления случаев нарушения установленных рецептур, связанных с заменой мышечной ткани белоксодержащими добавками растительного или животного происхождения, а также использованием мяса других видов животных, не предусмотренного технологией. В ходе выполнения работ первых этапов проекта были выбраны эффективные молекулярные идентификаторы и нуклеотидные зонды для проведения детекции компонентов сырья в готовых пищевых продуктах и разработаны аналитические системы для выявления отобранных маркеров. С целью подтверждения эффективности идентификации состава мясных продуктов с помощью разработанных методик были изготовлены образцы мясных продуктов в условиях, обеспечиваемых технологическим стендом ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН, а также мясные смеси, состоящие из свинины, говядины и куриного мяса в разном соотношении. Характеристика полученных образцов по структуре и составу проводилась с помощью микроструктурного анализа, двумерного электрофореза, метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Проведенный анализ показал, что использование индивидуальных методик не позволяет дать однозначное заключение о составе мясного продукта, поэтому использование иммунохимических методов контроля является необходимым условием получения достоверной информации о качественном и количественном составе мясного продукта. При выполнении работ первых этапов были обоснованы основные форматы проведения анализа, а именно конкурентный и «сэндвич»-формат иммуноферментного анализа (ИФА) и «сэндвич»-формат иммунохроматографического анализа (ИХА). Основываясь на полученных результатах, были разработаны аналитические системы для детекции немясных добавок (соединительная ткань животных, яйца, соя, молочные белки) в формате ИФА и иммунохроматографические тест-системы для детекции свиных иммуноглобулинов, а также одновременного выявления куриных иммуноглобулинов (IgY) и овальбумина. Разработана молекулярно-генетическая тест-система для быстрой идентификации куриных и свиных примесей в мясных продуктах. Иммунохроматографическая тест-система для одновременного определения овальбумина и куриных IgY характеризовалась инструментальным пределом обнаружения IgY и овальбумина 24.8 и 20 нг/мл, соответственно. Время тестирования составило 18 мин. Анализ позволил определить овальбумин и IgY в сырых мясных смесях, содержащих куриное мясо и сухой яичный белок с визуальными порогами детекции 0.125% и 0.0001% (w/w), соответственно. Разработаны методики ИФА для детекции соевого ингибитора трипсина, овальбумина и желатина с чувствительностью 0.001, 0.012, 0.025 мкг/мл, соответственно. Методики были применены для анализа мясных экстрактов, содержащих известные количества определяемых антигенов. Полученные результаты отражают высокую степень выявления аналитов — от 98 до 110% и подтверждают возможность использования предложенных методик ИФА для определения соевого ингибитора трипсина, овальбумина и желатина в пищевых продуктах. Разработана молекулярно-генетическая тест-система для быстрой идентификации примесей куриного мяса и свинины в мясных продуктах, которая включала экстракцию ДНК (3 мин), стадию рекомбиназной полимеразной амплификации (РПА) при 39°C (20 мин) и ИХА продуктов реакции (10 мин). Для идентификации мясного сырья методом РПА впервые был использован ген цитохрома b. Выбранные праймеры обеспечивали проведение специфической РПА без ДНК-нуклеазы и дополнительного олигонуклеотидного зонда. В результате РПА-ИХА на основе разработанных праймеров, меченных флуоресцеином и биотином, выявляет до 0.2 пг общей ДНК на мкл, что обеспечивает идентификацию до 0.001% (масс) целевого мясного компонента в мясном продукте. РПА-ИХА были успешно применены для идентификации куриного мяса и свинины в обработанных мясных продуктах или в мясе после нагревания. Использование быстрой экстракции в протоколе РПА-ИХА снизило чувствительность анализа, но сократило подготовку образца до 3 мин. Таким образом, разработан не только тест РПА-ИХА, но и быстрый 33-минутный метод полного цикла для контроля фальсификация мяса. Экспериментальная характеристика стабильности во времени параметров разработанных аналитических наборов показала, что снижение детектируемого сигнала при хранении тест-систем в течение 1 месяца (30 дней) при 37°С, которое соответствует сроку годности тест-систем 12 месяцев, составляет не более 15% и согласуется с общепринятыми требованиями производства и хранения иммунохроматографических тест-систем. В работе были использованы искусственно фальсифицированные образцы мяса (смеси говядины и свинины, содержащие куриное мясо в качестве фальсифицирующей добавки), для определения состава которых были применены индивидуальные методики – ИХА, ИФА, ПЦР, микроструктурный анализ и масс-спектрометрическая идентификация. Проведенные исследования показали, что использование отдельной методики для определения состава продукта не всегда позволяет однозначно классифицировать продукт как контрафакт. Поэтому совместно с ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН была предложена многоуровневая система контроля многокомпонентных мясных продуктов, основанная на комплексном использовании скрининговых методов и подтверждающих исследований, что позволит оптимизировать систему контроля качества мясных продуктов. Предполагается использование на первом этапе скрининговых методик ИФА/ИХА (недорогие методы, с высоким уровень надежности), которые позволят проводить тестирование в рамках производственного контроля для быстрого принятия решений. В рамках подтверждающего (арбитражного) контроля предполагается использовать ИФА / ИХА / масс-спектрометрическую идентификацию / микроструктурный анализ / 2D-электрофорез. Разработанные методические решения для организации многоуровневого контроля должны отразиться в разработке стандартов на продукцию и методики ее тестирования. Задачи этапа выполнены полностью. Проведена характеристика чувствительности и точности разработанных аналитических систем. Подготовлены методические рекомендации по выявлению фальсификации и контроля состава мясных продуктов. Охарактеризована стабильность разработанных аналитических наборов при разных режимах хранения. Результатами выполнения проекта стали иммунохимические (ИФА и ИХА) и молекулярно-генетические аналитические методики, пригодные для контроля мясных продуктов с пробоподготовкой не более 30 мин и точностью определения 7-10% для ИФА и 10-15% для мембранных тестов.

 

Публикации

1. Вострикова Н.Л., Хвостов Д.В., Жердев А.В., Минаев М.Ю., Зверева Е.А. Development of a two-level control system for the analysis of the composition of meat products Potravinarstvo Slovak Journal of Food Sciences, V. 15, p. 1005-1017 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.5219/1632

2. Вострикова Н.Л., Чернуха И.М., Хвостов Д.В., Жердев А.В. Strategy for the study of the proteome in animal muscle tissue IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, V. 854, article 012105 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1088/1755-1315/854/1/012105

3. Гендриксон О.Д., Зверева Е.А., Дзантиев Б.Б., Жердев А.В. Sensitive lateral flow immunoassay for the detection of pork additives in raw and cooked meat products Food Chemistry, V. 359, article 129927, p. 1-9 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129927

4. Гендриксон О.Д., Зверева Е.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Double qualitative immunochromatographic test for simultaneous control of chicken muscles and eggs in food Journal of Food Composition and Analysis, article 104324 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1016/j.jfca.2021.104324.

5. Зверева Е.А., Гендриксон О.Д., Поправко Д.С., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Мембранные тесты для идентификации сырья в мясопродуктах Информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: материалы Международной конференции NT + M&Ec`2021, Весенняя сессия, с. 194-198 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.47501/978-5-6044060-1-4.32

6. Иванов А.В., Поправко Д.С., Сафенкова И.В., Зверева Е.А., Дзантиев Б.Б., Жердев А.В. Rapid full-cycle technique to control adulteration of meat products: Integration of accelerated sample preparation, recombinase polymerase amplification, and test-strip Ddtection Molecules, V. 26, article 6804, p. 1-17 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/molecules26226804

7. Ковалёв Л.И., Ковалёва М.А., Новикова Л.А., Чернуха И.М. Протеомная идентификация белков – потенциальных биомаркеров немясных компонентов в мясной продукции Прикладная биохимия и микробиология, Т. 57, N. 6, с. 621-628 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.31857/S0555109921060076

8. Смирнова Н.И., Зверева Е.А., Гендриксон О.Д., Дзантиев Б.Б., Жердев А.В. Разработка иммуноферментных аналитических систем для контроля содержания основных немясных добавок в мясных продуктах Биотехнология, Т. 37, N. 5, с. 117-122 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.21519/0234-2758-2021-37-5-117-122

9. Гендриксон О.Д., Зверева Е.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Multiplex lateral flow immunoassay for the determination of meat products adulteration Abstracts of the 6th International ISEKI-Food Conference (ISEKI-Food 2021), Р. 81 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.34623/9hhy-1y83

10. Жердев А.В. Rapid control of undeclared sources of meat in foods: Recombinase polymerase amplification with test strip detection to identify presence of chicken and pig meat Abstracts of the 7th International Conference on Food Chemistry & Technology (FCT-2021), P. 15 (год публикации - 2021)

11. Жердев А.В., Зверева Е.А., Гендриксон О.Д., Поправко Д.С., Дзантиев Б.Б. Разработка иммунохимических систем для контроля подлинности и состава мясных продуктов Материалы международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», с. 308-310 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.37747/2312-640X-2021-19-308-310

12. Зверева Е.А., Гендриксон О.Д., Поправко Д.С., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Sensitive lateral flow test strips for rapid on-site control of authenticity and composition of meat products Abstracts of the 67th International Congress of Meat Science and Technology (ICoMST), Р. 265 (год публикации - 2021)

13. Зверева Е.А., Смирнова Н.И., Гендриксон О.Д., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммуноферментный анализ белков молока как биомаркеров при контроле состава молочных и мясных продуктов Актуальная биотехнология, N. 1 (35), c. 111 (год публикации - 2021)

14. Поправко Д.C., Иванов А.В., Зверева Е.А., Сафенкова И.В., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Разработка экспрессной изотермической системы ДНК-детекции для выявления фальсифицированных мясных продуктов Тезисы VII Съезда биохимиков и молекулярных биологов России, Т. 2, с. 191 (год публикации - 2021)

15. Смирнова Н.И., Зверева Е.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Разработка иммуноферментных аналитических систем для контроля содержания основных немясных добавок в мясопродуктах Материалы международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», с. 322-324 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.37747/2312-640X-2021-19-322-324


Возможность практического использования результатов
Разработка непосредственно связана с обеспечением качества и безопасности пищевой продукции, оперативным выявлением фальсификации, тем самым способствуя повышению качества жизни населения. Результатами исследований являются экспериментальные образцы биоаналитических систем, предназначенных для использования участниками коммерческих и технологических цепочек при производстве мясной продукции, контролирующими органами, крупными торговыми организациями. Заявитель имеет опыт разработки и внедрения в практику тест-систем для экспрессной иммунодиагностики, в том числе в рамках партнерства с основанным ФИЦ Биотехнологии РАН малым предприятием по производству тест-систем. Это отлаженное взаимодействие обеспечивает возможность оперативного масштабирования и технологической реализации новых тест-систем. Партнерство с ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова, реализуемое в рамках проекта, является основой для расширенной апробации аналитических разработок и совместной подготовки документации для включения новых методик в официально рекомендуемые процедуры контроля.