Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Выполняемый проект направлен на разработку новых экспрессных иммуноаналитических и молекулярно-генетических методов для контроля состава мясопродуктов и выявления случаев нарушения установленных рецептур. Выявляемые нарушения могут быть связаны с заменой части собственно мясного сырья (мышечной ткани) белок-содержащими добавками животного или растительного происхождения, а также с использованием мяса других видов животных, не предусмотренного технологией при производстве продуктов питания. Разработки 2019 г. включали выбор и обоснование приоритетных биомаркеров для эффективной иммунодетекции с помощью антител, а также нуклеотидных зондов для молекулярно-генетической детекции мясного сырья в готовых продуктах, характеристику иммунореагентов, сравнительную оценку различных форматов иммуноанализа и пробоподготовки и разработку систем иммуноферментного и иммунохроматографического анализа для выбранных пилотных объектов. Определен набор требований для выбора молекулярного идентификатора, контролируемого с помощью разрабатываемых аналитических методов. Проведен анализ кандидатных биомаркеров, в том числе методами биоинформатики. В качестве биомаркеров были охарактеризованы белки мышечной ткани тропонин I (ТНI), тропонин Т, миоглобин (МГ), мышечная енолаза, а также соевый ингибитор трипсина (СИТ) как маркер добавляемого в мясопродукты соевого сырья. Для генетической диагностики отобран участок генов atp8–atp6 и цитохром b, а также специфичные повторы Bov-tA SINE, SINE PRE-1, LINE CR-1 как индикаторы для групп-специфического анализа. Для детекции каждого из дискриминируемых видов – источников мясного сырья, а также групп видов были выбраны праймеры с учетом наиболее вариабельных участков, оптимальной температуры отжига, длины амплифицированного фрагмента. С учетом особенностей технологических процессов получения мясопродуктов охарактеризована стабильность и сохранение антигенных свойств выбранных биомаркеров при разных температурных воздействиях. Показано, что увеличение температуры до 80°С не приводит к существенным изменениям антигенных свойств ТНI и снижение аналитического сигнала при фиксированной концентрации ТНI не превышает 15%. Однако после инкубации ТНI при 90°С наблюдалось существенное падение аналитического сигнала – на 40%. При более интенсивной обработке дальнейшей инактивации не наблюдалось; сохранялось 60% иммунореактивности образцов ТНI, что позволит использовать биомаркер для характеристики готовых мясопродуктов, но с учетом предварительной калибровки. Образцы МГ показали чувствительность к нагреванию при температуре выше 80°С. Так, например, при температуре 80°С остаточный аналитический сигнал составлял 30%, а при температуре 90°С – 5%. Образцы СИТ характеризовались стабильностью при нагревании. При увеличении температуры инкубации до 90°С падение аналитического сигнала не превышало 25%. Для извлечения биомаркеров из мясного сырья или готового продукта были разработаны процедуры пробоподготовки, направленные как на максимальное извлечение аналита, так и на нивелирование влияния сопутствующих соединений. Кроме того, особое внимание уделялось снижению числа операций и времени пробоподготовки. Так, например, термостабильность ТНI позволила интенсифицировать его экстракцию из образцов мясного сырья и готовых продуктов введением стадии двухминутной инкубации при 100°С, во время которой часть белков выпадала в осадок. Образцы измельчали, гомогенизировали с использованием фосфатно-солевого раствора, содержащего 0.5М КCl, инкубировали при 100°С в течение двух минут и центрифугировали. На основании результатов тестирования были предложены оптимальные методики пробоподготовки при анализе ТНI, МГ, СИТ. Проведен предварительный скрининг препаратов антител – кандидатных компонентов разрабатываемых тест-систем. Отобраны наиболее аффинные препараты антител, охарактеризованные по способности к связыванию антигена в разных форматах иммуноанализа. Для иммуноферментного анализа показано, что сокращение продолжительности конкурентной стадии и стадии взаимодействия с антивидовыми антителами, меченными пероксидазой, с часа до 15 минут, не приводит к потере чувствительности и амплитуды детектируемого сигнал, что позволяет сократить общую продолжительность анализа с 2 ч 30 мин до 1 часа. Предел обнаружения СИТ составил 3.5 нг/мл, диапазон определяемых концентраций – 7.7-110 нг/мл. Показана возможность использования разработанной методики ИФА для определения наличия препаратов сои в мясных продуктах. При разработке ИХА были использованы препараты коллоидного золота (КЗ), которые характеризовались средним значением размера наночастиц КЗ 38.1±5.8 нм. Электронная микроскопия показала высокую степень однородности частиц по размерным характеристикам. Получены конъюгаты КЗ со специфическими антителами к ТНI. Выбор условий конъюгирования антител с КЗ проводили на основании фотометрических данных, отражающих агрегацию продукта данной реакции при высокой ионной силе раствора. Для ИХА ТНI был использован «сэндвич»-формат анализа, позволивший достигнуть максимальной чувствительности определения. Разработка анализа включала оптимизацию концентраций иммунореагентов, состава мультимембранного композита, режимов предобработки и сушки мембран. На основе результатов оптимизации были изготовлены тест-полоски и проведены эксперименты по иммунохроматографическому определению ТНI в стандартных растворах и экстрактах, полученных из препаратов мяса различных видов животных. Методика ИХА ТНI характеризуется пределом обнаружения 50 нг/мл при диапазоне определяемых концентраций 120-500 нг/мл. Показано, что разработанные тест-системы специфически взаимодействуют с ТНI из мяса млекопитающих (говядина, свинина). При этом ТНI, присутствующий в мясе птицы (курица, индейка), разработанная система не детектирует. Разработанный протокол был применен для характеристики разных сортов колбас. Для выполнения проекта в ФНЦ пищевых систем им. Б.М. Горбатова получены образцы мясопродуктов, содержащих известные количества биомаркеров и подвергнутые технологической обработке. Разработанные тест-системы позволяют специфически детектировать ТНI в образцах, полученных после термообработки, что позволяет проводить оценку содержания мышечной ткани млекопитающих в различных мясных продуктах. Сформированная реагентная база и результаты методических разработок обеспечивают перехода к следующему этапу работ – расширению ряда разрабатываемых иммуноаналитических систем для других выбранных биомаркеров и разработке тест-систем для экспрессного контроля специфических олигонуклеотидов, сочетающих их амплификацию и выявление продукта по формированию окрашенных комплексов на тест-полоске.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проект направлен на решение задачи создания экспрессных и методически простых тест-систем для подтверждения состава мясных пищевых продуктов. Существующие разнообразные лабораторные методы характеризуется значительной стоимостью тестирования и большими временными интервалами между пробоотбором и получением информации о результатах, а имеющиеся разработки экспресс-тестов ограничены минимальным числом контролируемых компонентов (например, для подтверждения халяльности) и пр. Основные разработки 2020 года были направлены на создание иммунохроматографических тест-систем разной специфичности и оценку их эффективности при контроле исходного сырья и конечных пищевых продуктов, в том числе для количественной оценки содержания контролируемых компонентов. Принципиальное значение для проведения тестирования имеет выбор распознаваемого антителами молекулярного идентификатора. Такой биомаркер должен быть уникальным для контролируемых видов сырья, характеризоваться стабильным высоким содержанием в мышечной ткани, иметь отличия в строении антигенных детерминант у разных животных. Кроме того, требуется стабильность или как минимум сохранение антигенных свойств маркера при различных видах обработки, которым подвергается мясное сырье. Для выбора наиболее перспективных биомаркеров были использованы данные протеомного анализа белков мышечных тканей животных разных видов и сопутствующих компонентов мясопродуктов, проводившегося в совместных работах ФИЦ Биотехнологии РАН и ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН. С учетом установленных критериев в качестве биомаркеров были выбраны скелетный тропонин I, миоглобин и иммуноглобулины. В качестве основного формата проведения иммунохроматографического анализа (ИХА) был реализован «сэндвич»-формат с формированием комплексов (антитело – антиген (биомаркер) – антитело). Для «сэндвич»-иммуноанализа с помощью мембранных тест-полосок в тестовой зоне на поверхности рабочей мембраны иммобилизовали антитела, а на отдельную мембрану наносили антитела, конъюгированные с наночастицами золота. На основании проведенного скрининга отобраны пары антител, характеризующиеся максимальными амплитудами аналитического сигнала (интенсивностями окрашивания в тестовой зоне) и минимальными пределами обнаружения биомаркеров. Определены концентрации иммунореагентов, наносимых на тест-полоску, состав реакционной среды, время инкубации и другие параметры, обеспечивающие воспроизводимый высокочувствительный анализ с минимальным уровнем неспецифического связывания окрашенной метки. Для проведения иммунохроматографического тестирования в продуктах питания разработана простая пробоподготовка, которая заключалась в гомогенизации проб, экстракции белка-биомаркера буфером специально подобранного состава и центрифугировании. Для термостабильных белков как одна из стадий пробоподготовки использовалась быстрая – 2-3 мин. – тепловая денатурация неспецифических белковых компонентов матрикса пробы. В результате проведенных исследований разработаны иммунохроматографические тест-системы для детекции скелетного тропонина I, миоглобина и иммуноглобулина. Скелетный тропонин I, термостабильный биомаркер мышечных тканей, детектировался с пределом выявления 25 нг/мл. Показано, что использование моноклональных антител определенной специфичности позволяет с близкой эффективностью выявлять тропонин I в пробах мяса млекопитающих (говядина, свинина, баранина, конина). При этом тропонин I, присутствующий в мясе птицы (курица, индейка), разработанная система не детектирует, исключая тем самым из рассмотрения добавки дешевого сырья, часто наблюдаемые при фальсификации мясопродуктов. Тест-система позволяет количественно оценивать содержание говядины в курином фарше, начиная с 1%-ной добавки и сохраняет свою эффективность при тестировании пищевых продуктов, подвергнутых термообработке (в частности, разных видов колбас). Общее время анализа – 20 мин. Миоглобин, несмотря на меньшую термостабильность как нативного белка, сохраняет антигенные свойства при температурной и ферментативной обработке, являясь тем самым эффективным альтернативным биомаркером для селективной оценки разных видов мясного сырья. ИХА миоглобина характеризовался пределом определения 5 нг/мл (до 0.01% мясных добавок). Реализованная тест-система специфически выявляет свиной миоглобин и не взаимодействует с миоглобинами других видов млекопитающих и птиц. Продолжительность тестирования – 15 мин. Эффективным подходом для распознавания источников и оценки общего содержания мясного сырья является также обнаружение иммуноглобулинов, которые присутствуют в плазме всех позвоночных и могут быть легко экстрагированы из мышечной ткани. Предел обнаружения иммуноглобулинов G свиньи в оптимизированном ИХА составил 9.8 нг/мл, что соответствует выявлению до 0.1% свинины. При другой комплектации иммунореагентов обеспечивается селективное выявление иммуноглобулинов Y курицы. Рассмотрены возможности количественной оценки содержания контролируемого мясного сырья на основании видеоцифровой регистрации интенсивности окрашивания аналитической зоны тест-полоски в результате проведения тестирования. Средствами такой регистрации могут быть портативные оптические детекторы, в том числе видеокамеры серийных коммуникационных устройств, а также стандартные офисные сканеры. Измерения характеризуются среднеквадратичным отклонением определяемой концентрации биомаркера, не превосходящим 10%. Эффективность разработанных тест-систем подтверждена в ходе их испытаний на примерах пищевых мясных продуктов известного состава, подготовленных и предоставленных ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН. Полученные результаты позволяют рассматривать иммунохроматографические тест-системы как эффективное средство проверки аутентичности и заявленного состава мясных продуктов. Рассмотрены возможности интеграции разрабатываемых средств экспрессного тестирования с системами подтверждающего анализа. Сформирован атлас 2D-электрофореграмм белков, экстрагированных из образцов основных видов мясного сырья (говядина, свинина, баранина, мясо кролика, курицы и индейки) и мясопродуктов, проведена идентификация и характеристика отобранных биомаркеров (тропонин I, миоглобин). Разработана методика количественной гистологической оценки содержания компонентов в мясных продуктах, основанная на обработке гистологических препаратов с помощью адаптированных компьютерных программ анализа изображений. В рамках подготовки к планируемой на 2021 г. разработке тест-систем, интегрирующих амплификацию специфических участков нуклеиновых кислот и выявление образующихся продуктов с помощью мембранных тест-полосок (т.е. перевод молекулярно-генетической диагностики во внелабораторные форматы анализа), определены и синтезированы меченные биотином и флуоресцеином праймеры для эффективной детекции мяса свиньи и курицы методом рекомбиназной полимеразной амплификации, проверена их реакционная способность. Изготовлены тест-полоски с использованием стрептавидина и антител к флуоресцеину как средства детекции продуктов изотермической амплификации.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Выполняемый проект направлен на разработку новых экспрессных иммуноаналитических и молекулярно-генетических методов для контроля состава мясопродуктов и выявления случаев нарушения установленных рецептур, связанных с заменой мышечной ткани белоксодержащими добавками растительного или животного происхождения, а также использованием мяса других видов животных, не предусмотренного технологией. В ходе выполнения работ первых этапов проекта были выбраны эффективные молекулярные идентификаторы и нуклеотидные зонды для проведения детекции компонентов сырья в готовых пищевых продуктах и разработаны аналитические системы для выявления отобранных маркеров. С целью подтверждения эффективности идентификации состава мясных продуктов с помощью разработанных методик были изготовлены образцы мясных продуктов в условиях, обеспечиваемых технологическим стендом ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН, а также мясные смеси, состоящие из свинины, говядины и куриного мяса в разном соотношении. Характеристика полученных образцов по структуре и составу проводилась с помощью микроструктурного анализа, двумерного электрофореза, метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Проведенный анализ показал, что использование индивидуальных методик не позволяет дать однозначное заключение о составе мясного продукта, поэтому использование иммунохимических методов контроля является необходимым условием получения достоверной информации о качественном и количественном составе мясного продукта. При выполнении работ первых этапов были обоснованы основные форматы проведения анализа, а именно конкурентный и «сэндвич»-формат иммуноферментного анализа (ИФА) и «сэндвич»-формат иммунохроматографического анализа (ИХА). Основываясь на полученных результатах, были разработаны аналитические системы для детекции немясных добавок (соединительная ткань животных, яйца, соя, молочные белки) в формате ИФА и иммунохроматографические тест-системы для детекции свиных иммуноглобулинов, а также одновременного выявления куриных иммуноглобулинов (IgY) и овальбумина. Разработана молекулярно-генетическая тест-система для быстрой идентификации куриных и свиных примесей в мясных продуктах. Иммунохроматографическая тест-система для одновременного определения овальбумина и куриных IgY характеризовалась инструментальным пределом обнаружения IgY и овальбумина 24.8 и 20 нг/мл, соответственно. Время тестирования составило 18 мин. Анализ позволил определить овальбумин и IgY в сырых мясных смесях, содержащих куриное мясо и сухой яичный белок с визуальными порогами детекции 0.125% и 0.0001% (w/w), соответственно. Разработаны методики ИФА для детекции соевого ингибитора трипсина, овальбумина и желатина с чувствительностью 0.001, 0.012, 0.025 мкг/мл, соответственно. Методики были применены для анализа мясных экстрактов, содержащих известные количества определяемых антигенов. Полученные результаты отражают высокую степень выявления аналитов — от 98 до 110% и подтверждают возможность использования предложенных методик ИФА для определения соевого ингибитора трипсина, овальбумина и желатина в пищевых продуктах. Разработана молекулярно-генетическая тест-система для быстрой идентификации примесей куриного мяса и свинины в мясных продуктах, которая включала экстракцию ДНК (3 мин), стадию рекомбиназной полимеразной амплификации (РПА) при 39°C (20 мин) и ИХА продуктов реакции (10 мин). Для идентификации мясного сырья методом РПА впервые был использован ген цитохрома b. Выбранные праймеры обеспечивали проведение специфической РПА без ДНК-нуклеазы и дополнительного олигонуклеотидного зонда. В результате РПА-ИХА на основе разработанных праймеров, меченных флуоресцеином и биотином, выявляет до 0.2 пг общей ДНК на мкл, что обеспечивает идентификацию до 0.001% (масс) целевого мясного компонента в мясном продукте. РПА-ИХА были успешно применены для идентификации куриного мяса и свинины в обработанных мясных продуктах или в мясе после нагревания. Использование быстрой экстракции в протоколе РПА-ИХА снизило чувствительность анализа, но сократило подготовку образца до 3 мин. Таким образом, разработан не только тест РПА-ИХА, но и быстрый 33-минутный метод полного цикла для контроля фальсификация мяса. Экспериментальная характеристика стабильности во времени параметров разработанных аналитических наборов показала, что снижение детектируемого сигнала при хранении тест-систем в течение 1 месяца (30 дней) при 37°С, которое соответствует сроку годности тест-систем 12 месяцев, составляет не более 15% и согласуется с общепринятыми требованиями производства и хранения иммунохроматографических тест-систем. В работе были использованы искусственно фальсифицированные образцы мяса (смеси говядины и свинины, содержащие куриное мясо в качестве фальсифицирующей добавки), для определения состава которых были применены индивидуальные методики – ИХА, ИФА, ПЦР, микроструктурный анализ и масс-спектрометрическая идентификация. Проведенные исследования показали, что использование отдельной методики для определения состава продукта не всегда позволяет однозначно классифицировать продукт как контрафакт. Поэтому совместно с ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН была предложена многоуровневая система контроля многокомпонентных мясных продуктов, основанная на комплексном использовании скрининговых методов и подтверждающих исследований, что позволит оптимизировать систему контроля качества мясных продуктов. Предполагается использование на первом этапе скрининговых методик ИФА/ИХА (недорогие методы, с высоким уровень надежности), которые позволят проводить тестирование в рамках производственного контроля для быстрого принятия решений. В рамках подтверждающего (арбитражного) контроля предполагается использовать ИФА / ИХА / масс-спектрометрическую идентификацию / микроструктурный анализ / 2D-электрофорез. Разработанные методические решения для организации многоуровневого контроля должны отразиться в разработке стандартов на продукцию и методики ее тестирования. Задачи этапа выполнены полностью. Проведена характеристика чувствительности и точности разработанных аналитических систем. Подготовлены методические рекомендации по выявлению фальсификации и контроля состава мясных продуктов. Охарактеризована стабильность разработанных аналитических наборов при разных режимах хранения. Результатами выполнения проекта стали иммунохимические (ИФА и ИХА) и молекулярно-генетические аналитические методики, пригодные для контроля мясных продуктов с пробоподготовкой не более 30 мин и точностью определения 7-10% для ИФА и 10-15% для мембранных тестов.