Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Определена методология выделения внеклеточных везикул (EVs) из фолликулярной жидкости (ФЖ) коров, позволяющую получать фракцию Evs, представляющую в основном экзосомы (87,9%) и частично микровезикулы. Анализ данных трансмиссионной электронной микроскопии выделенных Evs выявил как единичные везикулы (размером 30-150 нм), так и везикулы агрегированные в сгустки. Протеомный анализ EVs из фолликулов 3-6 мм и соответствующих клеток гранулезы выявил 517 белковых изоформ, представляющих 362 белка. Часть белков были идентифицированы только в EVs (63 белка). В целом, данные протеомного анализа показали, что экзосомы из ФЖ коров могут происходить как за счет секреции клетками гранулезы, так и из кровообращения. Экзосомные белки могут быть вовлечены в различные метаболические процессы, включая трансляцию, биогенез рибонуклеопротеинового комплекса и биогенез рибосом. Гипотетически, рибосомные белки переносимые EVs, могут быть использованы для компактирования и / или разложения РНК или использованы для трансляции клетками-мишенями. Дополнительно представлены сравнительные данные экспрессии генов, кодирующих белки, идентифицированных в составе EVs, в фолликулярных клетках гранулезы, теки, кумулюса и ооцитов. На уровне мРНК были найдены данные экспрессии генов для 181 белка, обнаруженных в препарате внеклеточных везикул из ФЖ коров. Установлено, что большинство генов везикулярных белков экспрессируются соматическими клетками (гранулезы), и также специфично клетками кумулюса и теки. Около 20% генов экспрессируется ооцитом. Кроме того, проведен сравнительный анализ (по концентрации белка и размеру) EVs, выделенных из мелких (3-6 мм) и крупных (8-12 мм) фолликулов. Показано, что на 1 мл ФЖ из мелких фолликулов выделяется больше везикулярного белка, чем из больших фолликулов. Также выявлена разница в распределение размеров EVs в образцах из фолликулов соответствующих размеров. Установлено снижение процента экзосом размером до 50 нм в мелких фолликулах, и значительное возрастание микровезикул размером более 150 нм в фолликулах большего размера. Проведено моделирование условий трансвагинальной аспирации (Ovum pick-up - OPU), а также получены данные о влиянии кратности сессий OPU у животных-доноров на количество и качество получаемых ооцитов. Показано, что проведение процедуры ОPU c интервалом в 3 дня повышало выход морфологически нормальных ооцит-кумулюсных комплексов по сравнению с интервалом в 7 дней. Тем не менее, влияния кратности сессий OPU на долю созревания ооцитов, их дробление после in vitro оплодотворения и развитие до стадии бластоцисты, а также число ядер в эмбрионах выявлено не было. Сделан вывод, что смоделированный способ получения IVP эмбрионов в целом позволяет в условиях лаборатории получать эмбрионы, пригодные для дальнейшего использования (замораживания и/или трансплантации реципиентам).

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проведена оценка влияния внеклеточных везикул из фолликулов коров (FF-EVs) на качество ооцитов в процессе их созревания in vitro (IVM). Показано, что культивирование ооцитов в бессывороточной среде IVM при воздействии FF-EVs обусловливает необходимый уровень ядерного созревания в ооцитах, уменьшает частоту апоптотической дегенерации в созревших яйцеклетках, а также повышает их компетенцию к развитию до стадии поздней морулы/бластоцисты. Полученные результаты позволили сделать вывод о целесообразности применения системы созревания ооцитов коров, содержащей FF-EVs, для повышения эффективности получения IVP эмбрионов у крупного рогатого скота. В целях изучения возможных механизмов действия FF-EVs, проведен анализ инкорпорации фолликулярных FF-EVs в созревшие ооциты и окружающие их клетки кумулюса, посредством культивирования ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) в присутствии флуоресцентно-меченых FF-EVs. Микроскопический анализ показал наличие специфичной флуоресценции в клетках кумулюса, в оболочке ооцитов (zona pellucide) и в их цитоплазме, что свидетельствует о способности FF-EVs проникать как в ооциты, так и окружающими их соматические клетки в процессе совместной инкубации ОКК в культуре IVM (https://doi.org/10.3389/fvets.2020.584948). После in vitro оплодотворения ОКК видимые признаки присутствия поглощенных меченых FF-EVs сохранялись и на стадии зиготы. При дальнейшем развитии наличие специфичной флуоресценции обнаружено не было, в том числе и в раздробившихся ранних эмбрионах. В целях выявления активных молекулярных факторов, переносимых FF-Evs в овоциты, был проведен углубленный анализ данных белкового содержания FF-EVs. В соответствии с идентификацией белков по одному и более валидированым пептидам на каждый белок, всего в образцах, выделенных из FF-EVs, было выявлено 460 белковых изоформ, составляющих 326 белков, 193 из которых были также определены в клетках гранулезы. Впервые определен полный перечень белков, идентифицированных в FF-EVs и отмечены те, которые присутствуют также в клетках гранулезы и в ооцитах. Белки, идентифицированные в FF-EVs, были значительно более вовлечены в биологические процессы включая клеточную адгезию, опосредованную интегринами, активацию комплемента, трансляцию, регуляцию активности эндопептидаз и свертываемость белка. Среди молекулярных функций белков FF-EVs превалируют связывание рРНК, структурная составляющая рибосом, связывание кадгерина, участвующее в межклеточной коммуникации и связывание белков. FF-EVs были значительно обогащены белками, относящиеся к малым и большим субъединицам рибосом, а также к микрочастицам крови, люмену эндоплазматического ретикулума, межклеточноиу матриксу и разного рода мембранам. Анализ in silico данных РНК в FF-EVs показал, что только 18.3% белков имеют кодирующие их транскрипты в составе FF-EVs. Анализ наиболее репрезентативных GO биологических процессов, молекулярных функций и сигнальных путей выявил как различия, так и сходства белков и кодирующих транскриптов, переносимых FF-EVs. Оценена эффективность получения IVP эмбрионов крупного рогатого скота с использованием OPU-ооцитов (прижизненное получение методом Ovum Pick-up, OPU) после гормональной обработки животных-доноров или без нее (натуральный цикл). Показано повышающее влияние стимуляции на развитие оплодотворенных in vitro OPU-ооцитов до стадии бластоцисты и на качество полученных эмбрионов.  

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проведенное исследование белково-пептидного состава внеклеточных везикул фолликулярной жидкости коров (ffEVs) помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF выявило значительные различия между крупными и мелкими везикулами (микровезикулами и экзосомами) по их спектральным профилям. В связи с тем, что именнно экзосомы, а не микровезикулы, обладают регуляторной способностью в межклеточном молекулярном обмене и влияют на способность ооцитов к развитию эмбриона in vitro, был проведен сравнительный анализ белково-пептидных профилей экзосом, выделенных из доминантных фолликулов и из более мелких фолликулов одних и тех же яичников. Анализ основных компонент, проведенный со значениями дифференциальных протеоформ, показал четкую дифференциацию экзосом из фолликулов разного размера по их белково-пептидным профилям. Анализ баз данных низкомолекулярных белков и их фрагментов из репродуктивных тканей человека, овцы и коровы, позволил дать аннотацию около четверти протеоформ, присутствующих в масс-спектральных профилях внеклеточных везикул. Более детальная и обширная аннотация будет возможна после проведения глобального протеомного иследования ffEVs с использованием масс спектрометрии высокого разрешения, учитывая также возможные пост-трансляционные изменения. Нами было показано, что многие белки, связанные с пальмовой кислотой (пальмитойлированные белки), могут быть частью ffEVs, и описаны возможные молекулярные механизмы пальмитации белков в фолликулярных клетках. Такие белки, переносимые внеклеточными везикулами, могут быть ассоциированы с компетентностью ооцитов к эмбриональному развитию. В связи с этим, проведение Top-Down анализа низкомолекулярных белков и их фрагментов, выделенных из внеклеточных везикул ФЖ коров, представляется необходимым для максимального точного определения их белкового состава и аннотации пиков белково-пептидных спектров, различающихся в везикулах из фолликулов разного размера. Комплексное сравнение данных морфофункционального, цитологического и молекулярного анализов, а также эмбрионального развития post mortem ооцитов после оплодотворения in vitro показали, что культивирование ооцитов в присутствие внеклеточных везикул (экзосом) обусловливает повышение ядерного созревания в ооцитах, уменьшает частоту хромосомных аномалий и уровень апоптоза в созревших яйцеклетках, При их воздействии повышается компетенция созревших и оплодотворенных ооцитов к развитию до стадии бластоцисты, а также качество и жизнеспособность полученных IVP эмбрионов. Характер этого эффекта зависит от концентрации внеклеточных везикул в составе среды созревания, который начинает проявляться в количестве эквивалентном содержанию белка в 1 фолликулярной жидкости, то есть в физиологической концентрации и достигает более значимых значений при его двукратном увеличении. В последнем случае положительный эффект усиливается в присутствие гонадотропных гормонов. Не менее выраженный положительный эффект ffEVs обнаружен и в отношении донорских ооцитов полученных от живых животных методом трансвагинальной пункции фолликулов. Культивирование ооцитов в присутствие ffEVs повышает качество созревших яйцеклеток и их способность к эмбриональному развитию, а также повышает полноценность и жизнеспособность полученных эмбрионов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что система созревания ооцитов коров, содержащая внеклеточные везикулы фолликулярного происхождения могут быть потенциально использованы для повышения эффективности получения и полноценности IVM/IVF/IVC эмбрионов крупного рогатого скота, в том числе с использованием донорских ооцитов известной селекции. Тем не менее, остается актуальным изучение механизмов такого воздействия и идентификация факторов, влияющих на его реализацию, а также изучение влияния ffEVs на качество развившихся эмбрионов путем оценки их жизнеспособности после криоконсервации.