Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Поскольку фактор Эпителиально-Мезенхимального Перехода Zeb1 может репрессировать экспрессию онкосупрессора р53 разными механизмами, мы исследовали механизмы ингибирования как на уровне транскрипции, так и на уровне экспрессии белка. Связывание Zeb1 с промотором ТР53 сопровождалось снижением уровня РНК полимеразы 2 на данном промоторе, а также повышением уровня метилирования гистона Н3 по лизину 9 и привличением фермента гистоновой деацетилазы 2ого типа (HDAC2). Эта пост-трансляционная модификация коррелировала со снижением транскрипции гена ТР53. С помощью иммуноблоттинга нами было показано, что уровень экспрессии р53-специфической убиквитин-лигазы MDM2 возрастал при индукции Zeb1. При повышении уровня экспрессии Mdm2 при ЭМП количество р53 в клетках падало. Эти данные свидетельствуют о том, что MDM2 может выполнять функцию убиквитинирования p53 в процессе ЭМП. При этом, в случае, когда экспрессия р53 подавлена, уровень MDM2 также падает, а уровень Pirh2 растет. Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что MDM2, помимо р53, также убиквитинилирует и Pirh2. При активации экспрессии Zeb1 мы наблюдали миграцию клеток РМЖ. Важно отметить, что миграционный потенциал клеток MCF7shp53 Zeb1 tet-on с подавленной экспрессией р53 был выше, чем у контрольных клеток MCF7 Zeb1 tet-on. Этот результат можно объяснить тем, что р53 подавляет подвижность и инвазивность раковых клеток. Активация экспрессии Zeb1 в клетках MCF7 Zeb1 tet-on, подавляет скорость пролиферации клеток как с нормальной, так и с подавленной экспрессией p53 за счет индукции ингибитора циклин-зависимых киназ, белка р27. Обнаружено, что уровень экспрессии микроРНК-203 зависит от экспрессии Zeb1 и p53. Важно отметить, что одной из мишеней этой микро-РНК является ген RNF188, кодирующий убиквитин-лигазу Хакай (CBLL1), которая в свою очередь, вызывает деградацию E-кадгерина, ключевого фактора межклеточных взаимодействий и поддержания эпителиальности клеток. Важно отметить, что в клетках с эндогенным р53, уровень экспрессии CBLL1 падает, что может свидетельствовать о том, что мРНК CBLL пост-транскрипционно репрессируется за счет микро-РНК-203. При этом, уровень экспрессии гена CBLL повышается в клетках MCF7 с подавленной экспрессией р53 в ответ на индукцию ЭМП за счет активации Zeb1. Таким образом, мы открыли новый потенциальный механизм, c помощью которого р53 препятствует утере экспрессии Е-кадгерина за счет микро-РНК-203a-ассоциированной деградации Е3-лигазы CBLL1, убиквитинилирующей Е-кадгерин. Данный механизм может быть реализован в опухолевых клетках, содержащих р53 дикого типа, что может препятствовать возникновению ЭМП. С помощью ПЦР в реальном времени мы показали, что экспрессия убиквитин-лигаз RNF181 и RNF7 при индукции Zeb1 специфически возрастает в тех клетках, в которых отсутствует экспрессия белка p53.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Zeb1 учатсвует в прогрессии рака, в том числе рака молочной железы. Экспрессия Zeb1 регулируется множеством сигнальных путей, в том числе TGF-β, β-катенин, miRNA и тд. На первом этапе реализации данного проекта мы показали, что Zeb1 подавляет пролиферацию клеток рака молочной железы MCF7. Однако оставалось неясно влияние Zeb1 на пролиферацию достигается за счет подавления экспрессии важнейшего оноксупрессора человека p53, или этот процесс протекает по независимым механизмам. Мы подтвердили полученные ранее нами данные, что Zeb1 подавляет пролиферацию клеток. При этом данное подавление наблюдается также в клетках с нокдауном p53. Однако в клеточной линии с нокдауном p53 подавление пролиферации за счет экспрессии Zeb1 по сравнению с контрольными клетками различается не так существенно. Мы предполагаем, что подавление пролиферации за счет Zeb1 происходит параллельно с репрессией p53. Известно, что во многих опухолях p53 мутирован. При этом многие из этих мутаций приводят к потере транскрипционной функции р53, как онкосупрессора. Однако эти мутации могут вызывать аберрантные взаимодействия р53 с другими транскрипционными факторами, приводя к подавлению апоптотических генов и делая клетки резистентными к генотоксической терапии. Также сверхэкспрессия мутантного р53 приводит зачастую к усилению миграционного потенциала клеток и пролиферации. Мы также показали, что при подавлении экспрессии p53mut в клеточной линии MDA-MB-231 наблюдается повышение экспрессии E-кадгерина (маркер ЭМП). Мы показали, что подавление экспрессии p53mut приводит к усилению экспрессии проапоптотических генов Puma и Bax. Из полученных данных мы можем сделать вывод, что подавление экспрессии мутантного р53 в мезенхимных клетках приводит к реактивации экспрессии Е-кадгерина и проапоптотических генов, поэтому клетки с подавленной экспрессией p53mut и Zeb1 будут хуже пролиферировать и будут более чувствительны к воздействию генотоксических препаратов. Клеточное старение (сенесенс) традиционно рассматривается как состояние необратимой остановки клеточного цикла, вызванное репликативным истощением (репликативное старение) или в ответ на различные онкогенные или повреждающие ДНК стрессоры (старение, вызванное онкогенами и преждевременное старение, вызванное стрессом). Важную роль в процессе клеточного старения играет повреждения ДНК, активирующие р53, который, в свою очередь, запускает транскрипцию генов, кодирующих ингибиторы циклин-зависимых киназ cdk2/cdk4, приводящих к остановке клеточного цикла. Мы обнаружили, что активация Zeb1 приводит к гипофосфорилированию и активации регулятора клеточного цикла Rb, а также репрессии циклина D1, что характерно для стареющих клеток. Таким образом, ЭМП-опосредованное снижение экспрессии циклина D1 и гипофосфорилирование Rb, помимо p27Kip1, является еще одним механизмом для активации сенесенсных клеток. Другим характерным свойством сенесенсных клеток является ингибирование апоптоза. Мы показали, что индукция Zeb1 повышает резистентность клеток к действию доксорубицина по сравнению с контрольными клетками за счет репрессии р53-зависимых проапоптотических генов bax и puma. С помощью Comet-assay мы также продемонстрировали, что активация Zeb1 в клетках MCF7 ускоряет репарацию повреждений ДНК под действием доксорубицина. В ходе выполнения проекта мы провели анализ влияния Zeb1 на уровень экспрессии miR-200. Мы показали, что р53 дикого типа препятствует Zeb1-зависимому подавлению miR-200. Мы показали, что p53 дикого типа активирует miR-203, в то время как Zeb1 и мутантная форма p53 вызывают обратный эффект. Важно отметить, что обе микро-РНК (miR-200 и miR-203) препятствуют образованию раковых стволовых клеток (РСК) и активно репрессируются Zeb1 во время этого процесса. Хотя раковые стволовые клетки (РСК) составляют лишь небольшую часть от общей популяции опухолевых клеток, они считаются основными движущими силами онкогенеза и рецидива рака. Все больше литературных данных свидетельствует о том, что ZEB1 способствует образованию РСК в опухолях кишечника, легких и груди. Для изучения роли Zeb1 в регуляции РСК мы создали клеточную линию MCF7/Zeb1-GFP, экспрессирующую индикаторную плазмиду стволовости. Для этого, клетки MCF7/Zeb1-GFP были инфицированы лентивирусной репортерной конструкцией, в которой экспрессия цветного белка mCherry контролировалась шестикратно повторенным консенсуным мотивом для свзязывания транскрипционными факторами стволовости, Oct4 и Sox2. Мы обнаружили, что уровень экспрессии Oct4b и Sox2 в РСК повышался в несколько раз при индукции Zeb1. Мы также изучили влияние р53 на стволовость РСК. Также мы обнаружили, что индукция Zeb1 достоверно повышала подвижность РСК в присутствии р53. Этот факт еще раз подчеркивает взаимосвязь Zeb1 и р53 в регуляции онкогенеза.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
По данным RNAseq в клеточной линии MCF7 мы обнаружили 3,2-кратное подавление экспрессии STEAP3, важного регулятора созревания экзосом, за счет Zeb1. Однако вклад p53 в случае подавлении экспрессии или в случае мутаций в образование экзосом в клеточной линии РМЖ остается по большей части неизвестным. Для того, чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали клеточные линии MCF-7 с индуцибельной экспрессией Zeb1 с нормальным и подавленными уровнями экспрессии р53. Анализ экспрессии STEAP3 c помощью ОТ-ПЦР показал, что в клетках с подавленной экспрессией р53 этот ген экспрессировался в 2,5-3 раза хуже по сравнению с клетками с нормальным уровнем р53. При этом повреждения ДНК усиливало р53-зависимую экспрессию STEAP3. Индуцированный с помощью доксициклина Zeb1 подавлял на 30% активацию экспрессии STEAP3.Также мы обнаружили Zeb1-зависимое снижение экспрессии STEAP3 в клетках РМЖ MDA-231 и Hs578T, в которых экспрессия Zeb1 была подавлена с помощью малых шпилечных РНК. Нужно отметить, что в этих линиях TNBC р53 мутирован, поэтому, скорее всего, репрессия STEAP3 за счет Zeb1 осуществляется не через р53. Таким образом, нам удалось показать, что экспрессия гена STEAP3 зависит от р53 и подавляется с помощью Zeb1 как в р53-зависимой, так и р53 –независимой манере. В рамках исследования методом ультрацентрифугирования были выделены внеклеточные везикулы из модифицированных линий клеток MCF7 с оверэкспрессией гена Zeb1 под контролем доксициклин-зависимого промотора и подавленной экспрессией p53. В качестве контроля выступала линия оверэкспрессией гена Zeb1 и нормальной экспрессией p53. Присутствовала тенденция к падению числа секретируемых везикул при активации Zeb1 по сравнению с контролем. Также мы наблюдали тенденцию снижения числа частиц из клеток с подавленной экспрессией р53. Полученные данные коррелируют с литературными данными о том, что р53, через регуляцию экспрессии STEAP3, регулируют продукцию микровезикул. Результаты ОТ-ПЦР показали, что подавление экспрессии р53 негативно влияло на уровень экспрессии miR200b, c в микровезикулах. Нужно отметить, что эта тенденция прослеживалась для микро-РНК, выделенной как из самих клеток, так и из микровезикул. Активация Zeb1 также снижала экспрессию р53-зависимых микроРНК, но более тщательный анализ miR200b,c показали, что Zeb1 слегка снижал их экспрессию и в клетках с подавленной экспрессией р53, свидетельствуя о том, что Zeb1 репрессирует эти микроРНК и независимо от р53. Таким образом, мы обнаружили, что экзосомы, продуцируемые клетками MCF7/Zeb1, сильнее обеднены по уровню экспрессии членов семейства микроРНК-200 (в 4 раза) относительно внутриклеточного содержания в MCF-7 без экспрессии р53 (в 2,5 раза). Эти эксперименты являются первым шагом для оценки экзосомальных микроРНК семейства mIR-200 в качестве потенциального биомаркера статуса p53 и ЭМП в клетках РМЖ. Для того, чтобы на животных подтвердить роль Zeb1 в активации метастазирования клеток, нами были проведены предварительные эксперименты по трансплантации обогащенной фракции раковых стволовых клеток (РСК) линии МСF7 c активированным и не активированным Zeb1 иммунодефицитным мышам линии NSG-SGM3. Нами были проведены подкожные и внутривенные введения клеток (для анализа метастатического потенциала). После введения клеток за мышами наблюдали в течение 3 месяцев. За это время никаких изменений в поведении или физическом состоянии животных обнаружено не было. Наличие новообразования наблюдалось в течение двух недель, а затем перестало обнаруживаться даже при пальпации. При вскрытии животных ни в одной группе не было обнаружено каких-либо отклонений от нормы во внешнем виде внутренних органов, новообразований и метастазирования также обнаружено не было. Ортопическое введение 5 млн клеток MCF-7/Zeb1 в четвертый сосок мыши вместе с эстрогеном показал неустойчивый рост опухоли (из трех оперированных мышей опухоль появилась только у одной). Таким образом, нами был сделан вывод о том, что клеточная линия MCF7 не пригодна для изучения метастазирования в животных. Мы также сравнили экспрессию микроРНК-200b/c и микроРНК-429 в образцах крови пациентов с РМЖ с различным уровнем экспрессии Zeb-1, депонированных в базе данных TCGA . Биоинформатический анализ корреляций между экспрессией р53, Zeb1 и микроРНК из периферической крови пациентов с РМЖ проводили следующим образом: в базе данных TCGA было найдено 1073 образца с результатами РНК-секвенирования периферической крови больных с РМЖ. Полученные данные свидетельствуют о том, что во всех образцах наблюдается отрицательная корреляция между Zeb1 и микроРНК 200 и 429, что соответствует литературным данным. При этом наблюдалась положительная корреляция между экспрессией Zeb1 и Виментина, маркера мезенхимальных клеток, и актином, который отвечает за формирование цитоскелета. Особенно четко это прослеживалось в образцах с высоким содержанием Zeb1. К сожалению, нам не удалось выявить значимые корреляции между экспрессией р53 и микроРНК. Вероятно, это связано с тем, что ген р53 в этих образцах может нести инактивирующие мутации. Тем не менее, можно сделать вывод о том, что высокая экспрессия Zeb1 в образцах периферийной крови связано с маркерами мезенхимальности. Предыдущие исследования показали, что трансглутаминаза 2 (TG2) индуцирует ЭМП переход (EMT) в различных опухолях. Несколько исследований также продемонстрировали критическую роль микроРНК (миРНК) в регуляции ЭМП различных типов опухолей. Однако взаимосвязь между TG2 и miRNAs изучена недостаточно. Ранее было показано, что экспрессия miR-205 может регулироваться за счет действия р53. В работе Piovan et al (Piovan C. Et al, Molecular oncology, Oncosuppressive role of p53-induced miR-205 in triple negative breast cancer, v.6 (4) 2012) было показано, что опухолевый супрессор p53, мутации и потеря которого представляют собой одно из наиболее распространенных генетических изменений при неоплазиях человека, включая рак груди, является способны положительно модулировать уровни экспрессии miR-205 в различных клеточных моделях, и что этот эффект проявляется через прямое связывание фактора транскрипции с регуляторными последовательностями выше гена, кодирующего микроРНК. В этой связи, мы исследовали, вносит ли miR-205, которая, как известно, ингибирует EMT и регулируется TG2, вклад в регуляцию Zeb1-опосредованного EMT в клетках рака молочной железы человека. Мы проанализировали экспрессию miR-205 в TG2-экспрессирующих и TG2-неэкспрессирующих клетках рака молочной железы с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и экспрессию TG2 и маркеров, связанных с EMT, таких как ZEB1 и Vimentin, с помощью иммуноблоттинга. Мы обнаружили, что в эпителиальных клетках MCF-7 TG2 экспрессируется на очень низком уровне, а в мезенхимальных клетках MDA-231 – на высоком. Уровень экспрессии MiR-205 подавлялся сильнее в клетках рака молочной железы с высокой экспрессией TG2, чем в клетках рака молочной железы с низкой экспрессией TG2. Нам удалось показать, что сверхэкспрессия miR-205 ингибирует подвижность клеток рака молочной железы MDA-MB-231, экспрессирующие TG2. Мы также решили выяснить молекулярный механизм репрессии miR-205 в эпителиальных клетках РМЖ (MCF-7) с индуцибельной экспрессией Zeb1. Ранее нами было показано, что специфическая индукция Zeb1 воспроизводит большинство молекулярных особенностей, характерных для ЕМТ (в частности, снижение экспрессии E-кадгерина, увеличение экспрессии Виментина, усиление подвижности клеток и др. ). При активации экспрессии экзогенного Zeb1 мы обнаружили семикратное снижение экспрессии miR-205. При этом, экзогенная экспрессия TG2 в MCF-7 с одновременной активацией Zeb1 подавляла экспрессию еще сильнее, чем по отдельности. Таким образом, мы выяснили, что TG2 ингибирует экспрессию miR-205 в кооперации с Zeb1. Известно, что помимо ЕМТ, на резистентность раковых клеток к химиотерапии влияет аутофагия (Shim D. Cancer Drug Resist. 2021; 4: 85–95). Аутофагия - это высококонсервативный процесс клеточного самопереваривания, который включает образование аутофагосом для доставки внутриклеточных компонентов и дисфункциональных органелл в лизосомы. Этот процесс вызывается различными сигналами, включая голод, дисфункцию митохондрий и повреждение ДНК. Молекулярная связь между аутофагией и повреждениями ДНК еще недостаточно изучена. Существует целый ряд работ, в которых высказывается гипотеза о том, что ЕМТ и аутофагия являются взаимосвязанными процессами. Важно отметить, что опухолевые клетки используют механизм аутофагии, чтобы справиться с последствиями терапии генотоксическими препаратами. Другой механизм лекарственной устойчивости осуществляется раковыми клетками посредством запуска программы EMT. Одним из критических факторов транскрипции ЕМТ является Zeb1. Мы решили выяснить, участвует ли Zeb1 в регуляции аутофагии в нескольких моделях клеток рака груди (Daks et al 2021 BBRC). Анализ нескольких клеточных линий РМЖ показал, что активация Zeb1 усиливало аутофагию, а подавление экспрессии Zeb1, наоборот, снижало ее. На молекулярном уровне Zeb1, вероятно, способствует аутофагии за счет регуляции аутофагических генов, что приводит к увеличению уровней LC3-II, усиленному окрашиванию Lysotracker и повышенной устойчивости к нескольким генотоксическим препаратам. Ослабление экспрессии Zeb1 в клетках TNBC приводило к обратному эффекту. Поскольку р53 регулирует Zeb1, мы также решили выяснить, участвует ли р53 в регуляции Zeb1-опосредованной аутофагии. Наши данные свидетельствуют о том, что в клетках MCF-7 как c подавленной, так и нормальной экспрессией р53, активация Zeb1 приводила к повышению аутофагии, что свидетельствует в пользу того, что в данном контексте роль р53 была не существенна. При этом, присутствие Zeb1 снижало чувствительность клеток к воздействию генотоксических препаратов. Следовательно, мы предположили, что Zeb1 увеличивает устойчивость клеток рака груди к генотоксическим препаратам, по крайней мере частично, посредством аутофагии. В совокупности мы обнаружили новую функцию Zeb1 в регуляции аутофагии в клетках рака груди.