Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1) Отработаны методики получения композитных наноструктур кремниевые наночастицы/золото (Au-КНЧ), получены образцы в необходимом количестве. Показана возможность модификации поверхности Au-КНЧ для активации фотолюминесценции (ФЛ) кремниевых нанокристаллов с квантовым выходом более 5%. Проведен детальный анализ структурных, физико-химических и оптических свойств полученных наноструктур: показано, что размер полученных нанокомпозитов составляет около 200 нм, что подтверждено данными динамического рассеяния света и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Изображения ПЭМ в темном поле показали, что размер осажденных наночастиц золота составил 10-50 нм, а сами эти наночастицы имели сферическую или эллиптическую форму. Спектры КРС Au-КНЧ показали, что диаметр нанокристаллов кремния после модификации поверхности наночастиц составляет 3-5 нм, что согласуется с зарегистрированными спектрами ФЛ. 2) Изучены свойства стабильности КНЧ и Au-КНЧ при их хранении в водных суспензиях, а также кинетики их растворения в фосфатном буфере, в том числе при комнатной и биологической температуре. Была показана важная роль предварительной обработки поверхности КНЧ. Так, сверхкритическая сушка приводила к тому, что частицы растворялись в фосфатном буфере при 37 С: на половину — за 1 день, полностью — за 11 дней. КНЧ без предварительной сверхкритической сушки обладали меньшей скоростью растворения и не растворялись полностью в течение 11 дней. Растворение в деионизованной воде происходит медленно по сравнению с PBS – в течение 14 дней инкубации в воде КНЧ фактически не растворялись. Результаты экспериментов в модельных жидкостях подтвердились в экспериментах in vitro, где с помощью конфокальной микро-спектроскопии КРС фиксированных клеток с введенными КНЧ, было установлено, что скорость биодеградации КНЧ зависит от предварительной обработки их поверхности. Так, показано, что подверженные сверхкритической сушке КНЧ полностью растворяются после 24 часов инкубации в клетках, в то время как скорость биорастворения высушенных на воздухе КНЧ существенно ниже. По результатам исследования опубликована статья в журнале Faraday Discussions (Q1). 3) Показано, что при концентрациях наночастиц в пределах диапазона низкой цитотоксичности (до 400 мг/мл), массовая доля золота, размеры пор наночастиц и размеры наночастиц не оказывают существенного влияния на их скорость биодеградации. Вместе с тем обнаружено, что наличие ионного обмена с внешней средой (модель открытой системы), которое достигалось путем помещения наночастиц в диализный мешок, существенно ускоряет процесс их растворения из-за отсутствия насыщения раствора ионами кремниевой кислоты. 4) Выполнено математическое моделирование процессов биодеградации КНЧ, которое позволило получить теоретические кинетики их биодеградации с учетом таких факторов как: диаметр, пористость КНЧ, химический состав их поверхности, наличие полимерного покрытия и загруженного в них лекарства, pH среды, концентрации активных форм кислорода и скорости движения жидкости. Результаты опубликованы в журнале Colloids & Surfaces: Biointerfaces (Q1). 5) Проведен анализ цитотоксических свойств полученных образцов в экспериментах in vitro, в том числе при пролонгированных временах инкубации с клетками. Установлено, что суспензии КНЧ не обладают заметной цитотоксичностью при концентрациях менее 400 мкг/мл, а повышение этой концентрации до 1 мг/мл приводит к гибели 50% клеток суспензионной линии К 562. Также на клетках линии аденокарциномы легкого A 549 было при помощи Вестерн-блот анализа показано, что КНЧ в диапазоне концентраций 100-400 мкг/мл не приводят к клеточной гибели и инициации внутреннего пути апоптоза в клетках. 6) Выполнена визуализация суспензий КНЧ во флуоресцентном томографе, что говорит о возможности выполнения аналогичной визуализации КНЧ в организме животного in-vivo в рамках последующих этапов. 7) Разработаны методы загрузки доксорубицина в КНЧ, а также получены КНЧ, оптимизированные для загрузки паклитаксела. Измерение кинетик выхода доксорубицина из пор наночастиц показало, что половина лекарства выходит в течение 8 часов, а более 95% - в течение 24 часов, что близко к оптимальным значениям, требуемым для успешных in-vivo экспериментов. 8) Выполнено математическое моделирование плазмонных свойств золотых наночастиц в кремниевой матрице, рассчитаны спектры поглощения нанокомпозитов. В качестве инструмента для моделирования процессов рассеяния оптического излучения на частицах (full wave analysis) использовался пакет для численного моделирования COMSOL Multiphysics использующий в своей основе метод конечных элементов (FEM), а также модуль Матлаб SMARTIES использующий формализм T-матриц. В качестве модельной системы рассматривалась золотая наночастица сферической или эллиптической форме в поле плоской электромагнитной волны. Более сложная модель учитывала кремниевую нанонить, на поверхности которой находилась золотая наночастица. Результаты моделирования показали, что при диаметре нанонити 50 нм усиление КРС может достигать 1 млн., а усиление ФЛ — 2 000. Было показано, что диаметр наночастицы золота не оказывает большого влияния на коэффициент усиления.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Комплекс методов флуоресцентной спектроскопии и комбинационного рассеяния света (КРС) использовались для визуализации кремниевых нанокомпозитов (КНК) в клетках, анализа их фазового состава, путем деконволюции спектров и оценки среднего размера кремниевых нанокристаллов, входящих в КНК. Одновременно выполнялась визуализация и количественная оценка загруженного в поры КНК лекарства (доксорубицина). Данные методы позволили осуществить мониторинг выхода лекарства из пор и биодеградации самих наноконтейнеров, которые сперва аморфизовались, а потом полностью растворялись. Помимо визуализации клеточных культур, были выполнены модельные эксперименты с использованием диализных мешков, которые позволяли реализовать открытую систему, максимально приближенную к условиям в клетках. По анализу интенсивностей линий КРС на частотах 400−500, 1180−1230 и 1400−1480 см-1 соответствующих DOX удалось измерить характерное время выхода лекарства из пор: за 7 часов вышло около 50% DOX. Дополнительно была продемонстрирована возможность визуализации КНК в живых клетках с применением методов нелинейной оптики, а именно КАРС (когерентное антистоксово рассеяние света) спектроскопии. К достоинствам КАРС относится большая эффективность рассеяния, что позволяет получать изображения без использования контрастных агентов в сотни тысяч раз быстрее, чем линейными методами. Кроме того, в случае окрашивания цитоплазмы или мембран клеток флуоресцентными красителями, показано, можно совмещать КАРС и флуоресцентную спектроскопию и получать изображение исключительно с помощью обратного рассеяния (одного детектора). С помощью характерной линии КРС с максимумом на 1002 см-1, который соответствует белкам клетки, а именно ароматическому кольцу фенилаланина, была показана эффективная интернализация КНК в течение 6-24 часов инкубации с клетками. Доля растворившихся наночастиц после их интернализации внутри клеток рассчитывалась из значений интегральных интенсивностей сигналов КРС КНК, и после 24 часов инкубации составила 92%. Была значительно доработана и улучшена процедура покрытия поверхности КНК гиалуроновой кислотой (ГК). Новая процедура предотвращает нежелательное окисление образцов в щелочной среде и тушение фотолюминесценции кремниевых нанокристаллов. Разработанная методика окраски гиалуроновой кислоты позволяет измерять ее количество на поверхности КНК. Для проведения контрольных биологических экспериментов была разработана методика покрытия КНК нетаргетной (к рецепторам CD44 — таргетам гиалуроновой кислоты) адипиновой кислотой. Все биологические эксперименты предваряются тщательными оценками цитотоксичности используемых нанокомпозитов применительно к конкретным клеточным линиям. Так методами вестерн-блот анализа и проточной цитофлуориметрии была изучена цитотоксичность КНК, показана полная биосовместимость вплоть до концентраций 500 мкг/мл. Об этом свидетельствует отсутствие расщепления белка PARP и отсутствие накопления каталитически активных фрагментов р19/17 эффекторной каспазы-3. С целью оптимизации внешнего ультразвукового воздействия на КНК, были исследованы факторы, потенциально влияющие на пороги кавитации в суспензиях КНК. Обнаружено, что диаметр пор в КНК на пороги кавитации существенного влияния не оказывает. Это говорит о том, что роль зародыша кавитации играет вся пористая наночастица в целом, а не отдельные поры. Другой фактор – предварительная обработка поверхности с целью создания Si-OH связей, показано влияет существенно. Это приводит к повышению доли поверхности, покрытой гидрофобным октадецилсиланом (ОДС) с 40% до 90%, что снижает пороги примерно на 20-30%. Проведена оценка стабильности гидрофобного покрытия, которая обеспечивает снижение порогов кавитации в суспензиях с амфифильными КНЧ. Показано, что скорость деградации покрытия связана с исходной концентрацией наночастиц и составляет 3-5 дней для низких концентраций (0.1 мг/мл) и до 2 недель для высоких концентраций (1 г/л) КНК. В проекте использовалось математическое моделирование для определения оптимальной морфологии нанокомпозитов. Расчеты показали, что максимальное усиление поля массивом золотых сферических наночастиц достигается для расстояний между наночастицами от 5 до 8 нм. Теоретические спектры рассеяния массивов золотых наночастиц показывают, что наилучшее рассеяние достигается в диапазоне длин волн от 530 до 600 нм. Этот диапазон слабо зависит от размера наночастиц. Уменьшение размера наночастиц приводит к уменьшению сечения рассеяния. По результатам работ на отчетном этапе проекта опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах, и 2 статьи Q1 находятся на стадии рецензирования. Результаты работ представлены в 7 докладах на международных и российских научных конференциях (6 устных и 1 стендовый доклад). К работам активно привлечены студенты и аспиранты.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Разработана методика получения амфифильных наночастиц пористого кремния (аф-PSiNPs), у которых внешняя поверхность — гидрофильная, а внутренняя — гидрофобная. Показано существенное снижение порогов кавитации в суспензиях разработанных наночастицах по сравнению с суспензией гидрофильных наночастиц, которая возникает преимущество вблизи гидрофобных поверхностей. Для мониторинга биораспределения наночастиц в клетках и тканях, в них было активировано свойство фотолюминесценции за счет окисления в растворе тетрабората натрия, в результате чего образовывалась толстая оксидная оболочка, а размер кремниевых нанокристаллов уменьшался до 3-5 нм, что приводило к возникновению квантового размерного эффекта. Показано, что такие частицы можно использовать как для терапии, так и для диагностики с использованием ультразвука. Показано in vitro отсутствие цитотоксических свойств наночастиц вплоть до концентраций 1 мг/мл. Продемонстрирована стабильность их соносенсибилизационных свойств в течение не менее 5 дней, что достаточно для успешных применений в клинике. Показано, что при совместном воздействии на клетки УЗ и аф-PSiNPs происходит механическое разрушение клеточных мембран 95% клеток за счёт механического воздействия схлопывающихся кавитационных пузырьков, т. к. это происходило исключительно при интенсивностях ультразвука, превышающих кавитационный порог, а иные признаки, такие как маркеры некроза и апоптоза, отсутствовали. При воздействии ультразвука с докавитационной интенсивностью клетки полностью сохраняли свою жизнеспособность. Полученные результаты открывают возможность использования разработанных амфифильных наночастиц в сонодинамической терапии рака. Разработана методика загрузки противоракового лекарства сунитиниба (SU) в поры гидрофильных наночастиц пористого кремния (PSiNPs). При этом показан замедленный выход лекарств из пор наноконтейнеров. С помощью методик люминесцентной конфокальной микроскопии и микроспектроскопии КРС доказано эффективное накопление наноконтейнеров в цитоплазме клеток через 24 часа инкубации. В сериях in vitro экспериментов показано, что чистый сунитиниб более эффективно запускает апоптотическую гибель клеток по сравнению с наночастицами с загруженным сунитинибом после 24 часов инкубации, что обусловлено медленным высвобождением данного препарата из наночастиц. Однако после длительной инкубации (в течение нескольких дней) клеточная гибель, индуцированная SU-PSiNPs была сопоставима с цитотоксичностью чистого сунитиниба после 24 часов в тех же концентрациях. Совместно с немецкими коллегами исследовано токсическое воздействие SU-PSiNPs на клетки кардиомиоцитов. На основе представленных данных сделан вывод, что разработанные наноконтейнеры могут быть рассмотрены в качестве перспективного направления стратегии медленного высвобождения лекарственных препаратов, что в дальнейшем может быть использовано для увеличения противоопухолевой активности сунитиниба и предотвращения потенциальных побочных эффектов данного препарата, таких как кардиотоксичность. Показана возможность активации выхода лекарств из пор наноконтейнеров при воздействии ультразвука терапевтических мощностей и интенсивностей. В докавитационном режиме удалось продемонстрировать 50% уничтожение клеток, в то время как без воздействия ультразвука при аналогичных условиях клетки полностью сохраняли свою жизнеспособность. В ходе выполнения проекта была разработана оригинальная методика осаждения золота в поры кремниевых наночастиц. В результате получены нанокомпозиты кремний-золото (Au@PSiNPs), обладающие свойствами усиления сигнала комбинационного рассеяния света (КРС) при возбуждении длинами волн в диапазоне 450-700 нм за счет эффекта плазмонного резонанса в золотых наночастицах. Разработана методика загрузки противоракового лекарства сунитиниба в поры композитных наночастиц. Для количественного объяснения полученных результатов разработана математическая модель в пакете COMSOL Multiphysics. Рассчитанный коэффициент усиления сигнала комбинационного рассеяния света (КРС) от лекарства, загруженного в разработанные композитные наноконтейнеры, показано может достигать 5 порядков. При этом показано можно четко регистрировать спектры гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) от лекарств, доставляемых композитными наноконтейнерами в клетки. Установлено in vitro, что используемые наноконтейнеры не проявляют токсических свойств по отношению к клеткам K562 и 3T3 NIH вплоть до концентраций 1 мг/мл. При этом более 90% клеток сохраняют свою жизнеспособность, никакие маркеры некроза или апоптоза не наблюдаются. Отработаны методики функционализации поверхности композитных наночастиц полиэтиленгликолем (PEG) и гиалуроновой кислотой (HA). Показано эффективное накопление покрытых HA наноконтейнеров в раковых клетках с гиперэкспрессией CD44 рецепторов. Выполнены in vitro эксперименты по ультразвуковой активации выхода лекарств из пор Au@PSiNPs. Показано, что стимулированный ультразвуком выход сунитиниба концентрации 5мкМ приводит к гибели 50% клеток при средних интенсивностях УЗ, а при увеличении концентрации до 30 мкМ, гибель клеток наблюдается и при низких интенсивностях ультразвука. При высоких интенсивностях, превышающих порог кавитации, наблюдалось 100% уничтожение раковых клеток К562. Разработанные нанокомпозиты, обладающие свойствами фотолюминесценции и усиления КРС загруженного лекарства, после введения в кровоток животных существенно замедляли рост раковых опухолей в экспериментах in vivo. В качестве таргетного покрытия использовалась гиалуроновая кислота. Показано, что подавление роста опухоли составило 80%, в то время как введение свободного сунитиниба в тех же количествах приводило лишь к 50% замедлению. При этом сами по себе наночастицы без лекарства не вызывали существенного эффекта. Активация наночастиц ультразвуком приводила к дополнительному подавлению роста опухоли до 60%. Высокая эффективность подавления роста опухоли обусловлена накоплением в ней 40% наночастиц, за счёт высокой аффинности гиалуроновой кислоты и гликопротеиновых рецепторов CD44, которые в избытке имеются на цитоплазматической мембране клеток опухоли. Наночастицы, покрытые нетаргетным покрытием, а именно полиэтиленгликолем, накапливались в опухоли хуже — около 20%. С помощью спектроскопии ГКР удалось детектировать сунитиниб непосредственно внутри клеток и срезов опухолей. При этом из-за высокой интенсивности сигнала не наблюдалось существенного перекрытия полос сунитиниба и биомолекул составляющих основу тканей и клеток. По итогам выполнения проекта, сформулированы основные принципы, которые важно учитывать в дальнейших клинических исследованиях, направленных на разработку конкретной системы доставки лекарств для лечения определенных типов рака. Принципы описывают выбор таргетного покрытия, выбор противоопухолевого препарата и способы имплементации саморапортуемости наночастиц в клинические исследования. Описана необходимость верификации безопасности самих наноконтейнеров без загруженных лекарств на ранних стадиях клинических исследований. По результатам работ в 2021-2022 году опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах Q1. Готовятся к публикации еще две статьи, которые также планируется опубликовать в высокорейтинговых журналах. Результаты работ представлены в 7 устных докладах на международных и российских научных конференциях; освещены в интервью в СМИ. К работам активно привлечены студенты и аспиранты.