Аннотация результатов, полученных в 2019 году
С использованием уникального объекта инфраструктуры мирового уровня Курчатовского источника синхротронного излучения проведена серия экспериментов по регистрации синхротронных данных спектроскопии ближней тонкой структуры края рентгеновского поглощения (X-ray absorption near edge structure, XANES) и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (X-ray photoelectron spectroscopy, XPS). Определен набор калибровочных структур систем железо-кислород и кремний-кислород, ряда иных, в качестве основных. Выбор калибровочных структур обусловлен их фазовой и структурной стабильностью при длительном хранении в лабораторных условиях и многократной полной воспроизводимостью. Основываясь на выбранных методических условиях и их подтверждению измерениями калибровочных структур проведена регистрация синхротронных XANES и XPS данных для всех эталонных структур. Проведен детальный анализ электронного строения и специфики локального атомного окружения атомов железа и кремния, а также в ряде случаев кислорода и иных, детально изучены данные о физико-химическом состоянии эталонных объектов, сделаны выводы о специфике окисления наночастиц железа и его оксидов (гидроксидов) в свободном состоянии и в различных средах, в том числе при взаимодействии с водой и рядом основных рабочих растворов, используемых при подготовке клеточных культур, а также наночастиц кремния и его оксидов. Показаны изменения в составе, структуре, специфике локального атомного окружения и электронном спектре, а также иных свойств (морфология, субструктура, кластеризация, формирование и перестройка границ раздела фаз и зерен, и др.) как результат процессов естественного окисления и стимулированного термически в различных режимах. Установлены режимы профилирования фокусированным ионным пучком с оценочной скоростью профилирования от 1 А до 1 нм в минуту. Установлены временные калибровочные критериальные уровни, позволяющие стабилизировать физико-химические свойства профилируемой поверхности, включающей соединения систем железо-кислород или кремний-кислород. Зарегистрированные результаты аттестации калибровочных и эталонных структур систематизированы и собраны в предметно-тематические последовательности. Обобщены и систематизированы результаты, полученные методом растровой электронном микроскопии (Scanning Electron Microscopy, SEM, включая данные микроанализа), рентгеновской дифракции, и, безусловно, данные методов XANES и XPS, в том числе после компьютерного моделирования, полученные с использованием синхротронного излучения ОИ КИСИ НИЦ "Курчатовский институт". Оптическими методами (например, при контроле оптической плотности для клеточной культуры E.coli) установлены и проконтролированы процессы количественного накопления клеточных клеток, показаны стадии роста и насыщения, необходимые для подготовки гибридных структур. Показана общая морфологическая устойчивость массивов клеточных культур к излучению ряда источников электромагнитного излучения: ртутная лампа (энергия квантов ~ 5 эВ), рентгеновская трубка (1486.61 эВ), высокоинтенсивное синхротронное излучение (80 - 1200 эВ). Сохраняющийся органический каркас нечувствителен к облучению фокусированными пучками электронов (пробы подвергались многочисленным исследованиям методом растровой электронной микроскопии) с энергиями 2-20 кВ. Такая картина наблюдается даже после стимулированного вакуумного высушивания, включая объекты, содержащие интегрированные неорганические частицы железо-кислород или кремний-кислород в концентрациях исходных образцов гибридных материалов. Метод фотоэмиссионной электронной микроскопии, примененный впервые в мировой практике для клеток E.coli (исходные пробы) в сочетании с XPS и SEM исследованиями, подтвердил этот факт. Показано лишь крайне частичное и фрагментарное разрушение мембраны (поверхности) клеток при интеграции с частицами, а также при их длительном облучении. Проведен комплексный анализ данных синхротронных XANES и XPS исследований исходных гибридных наноматериалов на основе клеточных культур E.coli со сверхмалыми наночастицами оксидов железа. Показано, что культуры E.coli в исходном состоянии не содержат заметных следов железа и его оксидов, получаемых одноклеточными из естественной среды роста и нахождения. Этот факт может быть свидетельством того, что даже в условиях суперпродукции белка Dps клетками, накопление неорганических частиц происходит крайне фрагментарно и не обязательно на внешней поверхности клеточной мембраны. Однако даже небольшое добавление источника ионов железа в виде растворенной соли Мора приводит к появлению следов оксидов железа на поверхности культур, что отмечалось лишь при насыщенном наслаивании, когда по данным SEM клетки составляют плотный микронный слой, формируемый на подложке. Причем по данным набора положений 2р уровня железа показан широкий ряд различных оксидов и гидроксидов, существующих на поверхности проб, включая даже остаточные следы соли Мора. Однако XPS данные положения 2р уровня железа и тонкая структура L2,3 спектров XANES железа, включая положение главного резонанса, свидетельствует об отсутствии металлического железа. В целом показана эффективность использования соли Мора (FeSO4*(NH4)2SO4*6H2O) в качестве источника ионов железа. Спектроскопия К края поглощения кислорода и детальное рассмотрение совместно с математическим моделированием данных XPS по O1s и C1s остовным уровням в целом подтверждают результаты спектроскопии XANES: при совмещении с поверхностью клеток образуется широкий набор состояний атомов железа с различным характером локального окружения атомами кислорода: от традиционного и ожидаемого Fe2O3 до сохраняющегося на протяжении всех экспериментов FeO. Сделан вывод о необходимости оптимизации процесса промывки проб для удаления остаточных солей, фрактальными структурами, покрывающих всю поверхность пробы при отсутствии промывки. Полное удаление солей необходимо проводить с целью выделения соединений железа в составе гибридных наночастиц, при аккумуляции в самой клетке, выполняющей роль фабрики, продуцирующей сферические наномолекулы Dps (около 10 нм) с неорганическим наноядром железа и его соединений во внутренней полости (не более 6 нм). Определены критериальные условия подготовки и наслаивания гибридного наноматериала на основе клеточных культур E.coli со сверхмалыми наночастицами оксидов железа на используемые типы подложек и режимы надежного детектирования рентгеноспектральных сигналов с применением синхротронного излучения ОИ. Проведен всесторонний детальный анализ рентгеноспектральных данных синхротронных методов XANES и XPS высокого разрешения для исходных порошков кремния различных способов формирования, состоящих из наночастиц системы кремний-кислород, а также исходных гибридных наноматериалов на основе клеточных культур млекопитающих, декорированных наночастицами кремния и его оксидов. Состав и структура наночастиц кремния находятся в существенной зависимости от технологии формирования, сушки и хранения порошков перед их интеграцией с клеточной культурой. Состав исходных порошков однозначно включает покрытие, в пределах 5 нм, естественного оксида кремния, однако различного характера плотности упаковки кремний-кислородных тетраэдров. Лиофильная сушка приводит к более плотной упаковке с толщиной слоя оксид менее 3 нм. Cтандартная сушка на воздухе приводит к менее плотному оксиду, толщинами до примерно 4 нм. Атомы кремния находятся в разупорядоченном состоянии в поверхностных нанослоях, однако ряд особенностей XANES Si L2,3 и О К спектров может свидетельствовать о частичном сохранении локального порядка. Отмечается наличие ряда субоксидов кремния, распределенных в поверхностном слое частиц порошков, не превышающем 5 нм, при степенях окисления SiOx со значениями х от 1 до 2. Толщина переходного слоя также существенно зависит от способа подготовки частиц к интеграции с клеточными культурами. Совмещение частиц с культурами клеток млекопитающих 3T3NIH (линия эмбриональных фибробластов мыши) изменяет физико-химическое состояние поверхности наночастиц системы кремний кислород. Химические сдвиги 2р уровня кремния и 1s уровня кислорода подтверждают трансформацию физико-химического состояния частиц порошков при интеграции с клетками и стабильность их состава во время продолжительного хранения в лабораторных условиях, и показано частичное увеличение толщины слоя оксидов кремния. Наклон и положение основных характерных особенностей тонкой структуры спектров Si L2,3 и О К XANES также говорит о широком ряде оксидов кремния с нарушенной степенью окислением и локального окружения атомов кремния кислородом. Достаточная толщина предполагаемой оболочки оксидов является причиной стабильности их состава при интеграции в клетки при отмеченном частичном доокислении. Как и в случае гибридных наноматериалов на основе культур E.coli, существенным вопросом является очистка поверхности от солей рабочих растворов, что является краеугольным камнем для получения наиболее достоверных данных. Определены критериальные уровни концентраций наночастиц кремния и его оксидов при интеграции с клеточной культурой, режимы наслаивания на используемые типы подложек и режимы надежного детектирования рентгеноспектральных сигналов с применением синхротронного излучения ОИ. Проведена подготовка к проведению первопринципного моделирования основных фаз изучаемых неорганических соединений. Выполнены расчеты зонной структуры, спектров полной и парциальных плотностей состояний стишовита - тетрагональной сверхплотной модификации SiO2. Исследовано влияние выбора обменно-корреляционного потенциала на получаемую электронную структуру кристаллического кремния. Были использованы три различных приближения: LDA, GGA и mBJ (использование обменно-корелляционного потенциала mBJ в качестве поправки к GGA для кремния дало результат близкий к экспериментальному). Показана принципиальная возможность совмещения неорганических наночастиц на основе оксидов железа с культурами клеток E.coli или неорганических наночастиц на основе оксидов кремния с клеточными культурами млекопитающих (3T3NIH). Установлена стабильность создаваемых гибридных наноматериалов, способных даже в атмосферных условиях выступать носителями (контейнерами) наночастиц, сохраняя их свойства длительное время. Показано влияние совмещения природных клеточных культур на трансформацию локального атомного и электронного строения и на физико-химическое состояние неорганических частиц при их успешном формировании и/или интеграции. Для двух типов гибридных наноматериалов показана связь размерно-структурных свойств развитой поверхности со спецификой локального окружения атомов, составляющих неорганические наночастицы. Наночастицы железа способны длительное время сохранять стабильный состав, отличный от ожидаемого для развитой поверхности (внешней части клеточной мембраны) оксида железа Fe2O3. Материалы FexOy(H) сохраняются длительное время, за счет образования структур ядро-оболочка или нанокластерных структур в пределах неорганических ядер белковых молекул Dps формируемых E.coli. При этом в условиях суперпродукции белка клеткой по данным оптических исследований, и на этапе длительного хранения мембрана не испытывает структурно-фазовой трансформации, агрегируя в то же время железосодержащие наночастицы. Наночастицы кремния и его оксидов при интеграции с клетками млекопитающих после успешного совмещения также стабильны и способны длительное время сохранять размерно-структурные свойства, включающие установленные субоксиды кремния. Показана, однако, активность клеточной культуры 3T3NIH по отношению к составу наночастиц, которая проявляется в их доокислении.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
С использованием уникального объекта инфраструктуры мирового уровня Курчатовского источника синхротронного излучения проведена серия экспериментов по регистрации синхротронных данных спектроскопии ближней тонкой структуры края рентгеновского поглощения (X-ray absorption near edge structure, XANES) и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (X-ray photoelectron spectroscopy, XPS). Проведены исследования перестройки атомного и электронного строения при стимулированном росте содержания неорганических частиц в гибридных наноматериалах на основе клеточных культур: E.coli со сверхмалыми наночастицами оксидов железа; млекопитающих, декорированных наночастицами кремния и его оксидов. Выполнены компьютерное моделирование, включая ab-initio расчеты. Проведены исследования свойств подготовленных проб методами оптической микроскопии (конфокальной и флуоресцентной) при стимулированном росте содержания неорганических частиц в гибридных наноматериалах. Показано, что примененные режимы насыщения клеточных культур наночастицами оксидов железа, кремния и его оксидов не приводят к разрушению целостности (конформации) клеточных структур, в особенности внешних сторон клеточных мембран. Методом высокоразрешающего микроанализа в совокупности с селективным картированием поверхности установлена эффективность процессов интеграции ионов железа, образующихся в растворах с клеточным материалом на основе E.coli. Установлено значительное проникновение атомов (ионов) железа вглубь слоя клеточного материала. Данные метода растровой электронной микроскопии показали возможное проявление клеточных визикул при насыщении частицами железа в молекулах dps при суперпродукции белка. В этом случае детектируются отдельные нарушения в области клеточных мембран, по нашему мнению, с возможным механизмом образования и разрушения визикулярных образований, что сопровождается выходом молекулярно-гибридного материала во внеклеточное пространство. Количество частиц, внесенных в культуральную среду для интеграции наночастиц Si с клетками млекопитающих 3T3NIH и MCF-7, варьировалось при внесении и при вариации времени инкубации. Микроскопические исследования показали эффективность интеграции наночастиц без потерь при выбранных режимах роста, насыщения, интеграции (инкубации) и последующей фиксации. Проведена отдельная дополнительная серия экспериментов по уточнению выбора подложек для нанесения/наслаивания/инкубации проб. Показано, что использование фольг титана освобождает от многочисленных методических трудностей, делает процесс регистрации синхротронных спектров эффективным, пробы, сформированные на поверхности, стабильны, результаты синхротронных исследований воспроизводимы. Синхротронные экспериментальные данные высокого разрешения метода XANES об атомном и электронном строении при стимулированном росте содержания неорганических частиц в гибридных наноматериалах на основе клеточных культур E.coli со сверхмалыми наночастицами оксидов железа показали следующее, основываясь на данных изучения L2,3 краев железа и частично К краев кислорода. Увеличение содержания наночастиц в целом не приводит к заметным изменениям интенсивности сигнала XANES Fe L2,3. По нашему мнению, это связано с преимущественным формированием наночастиц во всем объеме клетки (по толщине в пределах 1 мкм), в то время как с внешней стороны мембраны процесс устойчиво происходит за счет наличия определенного количества белка Dps, которое можно принять неизменным, либо изменяющимся незначительно по сравнению с вариациями количества предполагаемо участвующих в процессе (на мембране и внутри клетки) ионов железа 2+. Отмечается сохранение конформации в структуре клеток. В целом анализ тонкой структуры спектров L2,3 железа показал отсутствие полного перехода к оксиду Fe2O3 в формируемых наночастицах даже при их стимулированном росте. Это происходит за счет формирования агломератов кластерного типа с уравновешенным составом FexOy(Н), где стехиометрия будет определяться размерами и природой самой частицы (молекулы, в полости которой происходит накопление кластера) и вероятностью образования структуры типа ядро-оболочка в пределах одной частицы и их сверхмалых агломератов, размерами, не превышающими сотни нанометров. В то же время привнесение связей с атомами водорода при образовании гидроксидных групп также приводит к детектируемой перестройке спектров Fe L2,3 XANES с характерными изменениями в распределении их тонкой структуры и энергетическими положениями основных особенностей. Результаты проведенного математического моделирования XANES Fe L2,3 спектров по эталонным данным подтверждают это. Показано, что эти процессы идут независимо от количества привносимых извне ионов железа и определяются спецификой функционирования клеток и входящих в их состав белков Dps. Так при суперпродукции белка Dps наблюдается увеличение относительной интенсивности сигнала при регистрации синхротронных спектров XANES, однако тонкая структура этих спектров заметных изменений не проявляет. Установлены критериальные условия проведения экспериментов и совместимости клеточных культур с неорганическими наночастицами на основе системы железо-кислород. Синхротронные и лабораторные экспериментальные данные обзорных спектров и спектров высокого разрешения метода XPS (Fe 2p, O1s, C1s и др. остовных уровней) об атомном и электронном строении при стимулированном росте содержания неорганических частиц в гибридных наноматериалах на основе клеточных культур E.coli со сверхмалыми наночастицами оксидов железа подтверждают в целом выводы, сделанные на основании анализа результатов синхротронного метода XANES. Однако следует отметить, что глубина информативного слоя для всех XPS исследований составляла по нашим данным 2-3 нм. Это позволило провести исследования реальных поверхностей мембран клеток. Соответственно и количество наночастиц, формирующихся в таком зондируемом слое, оценивается нами как на порядок меньшее, с учетом толщины (ширины) клетки, данных электронной микроскопии и т.д. В результате этого при разрешении ~ 0.1 эВ при подробной регистрации химических сдвигов остовных уровней требуемое время составляло свыше десяти часов. Спектры тонкой структуры 2p 1/2 2p 3/2 железа показывают набор вкладов компонент 2- и 3-х валентного железа, металлического железа, в ряде случаев протонирования, подтверждая состав FexOy(Н). Установлены критериальные условия проведения экспериментов. Синхротронные экспериментальные данные высокого разрешения метода XANES (Si L2,3, O K, иные при необходимости) об атомном и электронном строении при стимулированном росте содержания неорганических частиц в гибридных наноматериалах на основе клеточных культур млекопитающих, декорированных наночастицами кремния и его оксидов, показали следующее, основываясь на данных изучения L2,3 краев кремния и частично К краев кислорода. В отличие от гибридных материалов на основе клеток E.coli, в которых формирование наночастиц происходит "изнутри" в полостях сферических наномолекул dps, клетки 3T3 NIH фибробластов мыши и MCF-7 рак груди человека насыщались "извне" непосредственно добавлением суспензии кремниевых наночастиц в культуральную среду. За счет этого количественный фактор безусловно сказывался на интеграцию с клеточными культурами, в первую очередь, при деградации наночастиц с течением времени инкубации в клетках. При стимулированном росте содержания наночастиц кремния в клеточной среде показана существенная зависимость относительного вклада и состава этих наночастиц от значения времени инкубации от 7 до 72 часов и исходного количества введенных наночастиц 50 - 500 мкг/мл. Показано, что на начальных этапах инкубации с клеточными культурами происходит частичное удаление слоя естественного оксида с поверхности наночастиц. Такая деградация является результатом начала процессов растворения наночастиц кремния при физико-химическом взаимодействии с внутриклеточной средой. При этом с течением времени инкубации происходит общее ослабление сигнала от атомов кремния: до 4 раз. Относительная интенсивность оксидной части спектра по отношению к кремнию с течением времени инкубации растет, свидетельствуя о том, что процесс реформирования оксидного покрытия частиц сопровождается его постепенным растворением внутриклеточной средой. Установлены критериальные условия проведения экспериментов и совместимости клеточных культур с неорганическими наночастицами на основе системы кремний-кислород. Синхротронные экспериментальные данные, обзорные и высокого разрешения метода XPS (Si 2p, O1s, C1s и др. остовных уровней) об атомном и электронном строении при стимулированном росте содержания неорганических частиц в гибридных наноматериалах на основе клеточных культур млекопитающих, декорированных наночастицами кремния и его оксидов, в целом подтверждают выводы, сделанные по результатам синхротронного метода XANES. Увеличение относительной интенсивности вклада 2p состояний атомов кремния сопровождает рост количества вводимых наночастиц пропорционально. Это говорит об эффективности процессов поглощения клеточными культурами наночастиц Si. Рост времени инкубации показывает снижение вклада кремния в состав поверхности гибридных материалов, подтверждая протекающие процессы растворения. Тонкая структура Si 2p линий показывает динамическое увеличение вклада оксидов и постепенное исчезновение вклада от элементарного кремния с увеличением времени интеграции. Установлены критериальные условия проведения экспериментов и совместимости клеточных культур с неорганическими наночастицами на основе системы кремний-кислород. По нашему мнению, в случае всех гибридных материалов измерения происходят практически на пределе чувствительности методов XANES и XPS, несмотря на использование высокоинтенсивного синхротронного излучения. Получены компьютерные модели электронной структуры нанопленок кремния толщиной от 1 до 10 элементарных ячеек. Анализ трансформации спектра полной плотности электронных состояний при увеличении толщины нанопленки показал, что для пленки толщиной в 1 ячейку спектр кардинально отличается от объемного кристалла, с увеличением толщины пленки эта разница постепенно уменьшается, и спектры пленок толщиной в 6 и более ячеек демонстрируют основные особенности электронной структуры объемного кристалла. Реализован метод декомпозиции экспериментальных XANES L2,3-спектров на L2- и L3-компоненты. С помощью предложенного метода выполнено разложение экспериментального XANES L2,3-спектра кремния на L2- и L3-компоненты. При этом все спин-дублеты оказались разделенными и отнесенными к разным спектрам. Вычислен теоретический XANES L3 спектр кремния и получены вклады в расчетный спектр от состояний s- и d-симметрии. На основе расчета дана интерпретация особенностей экспериментального спектра. Показано, что вблизи края спектра в области энергий шириной ~2 эВ s- и d-состояния вносят в спектр сопоставимый вклад, а при больших энергиях перехода XANES L3 спектр кремния формируется главным образом состояниями d-симметрии. Все данные экспериментальных измерений (полученные с использованием синхротронного излучения ОИ КИСИ НИЦ "Курчатовский институт") и теоретических расчетов и моделирования для методов XANES и XPS обобщены и собраны в отдельные тематические сборки по типу измеренных спектров или по типу изученных объектов. При условиях стимулированного роста наночастиц гибридных материалов показана общая морфологическая устойчивость массивов клеточных культур к накапливаемой дозе облучения ряда источников электромагнитного излучения, в том числе в течение длительного времени облучения: рентгеновская трубка (1486.61 эВ), высокоинтенсивное синхротронное излучение (80 - 1200 эВ). Также сохраняющийся органический каркас нечувствителен к облучению фокусированными пучками электронов (пробы подвергались многочисленным исследованиям методом растровой электронной микроскопии) с энергиями 2-20 кВ.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Перед проведением ионного профилирования проведена серия повторной регистрации данных спектроскопии XPS (при необходимости с контролем XANES) для калибровочных структур. Выбор калибровочных структур обусловлен их фазовой и структурной стабильностью при длительном хранении в лабораторных условиях и многократной полной воспроизводимостью состава по данным тонкой структуры регистрируемых спектров. При регистрации данных XPS, там, где это представляется возможным, нами принято использовать "внутреннюю" калибровку на 1s уровень углеводородных загрязнений, приведенный к 285 эВ. Однако при работе с материалами природного происхождения это не всегда представляется возможным. Нами проводилась калибровка на остовные уровни Au 4f 7/2, Cu 2p 3/2, а также ряда иных. Проведена повторная регистрация XPS данных исходных эталонных структур основных соединений, планируемых к обнаружению в функциональных неорганических наночастицах, в том числе с учетом ионного профилирования. Проводилось ионное профилирование для всех калибровочных и эталонных материалов. При понимании порядка толщин слоев естественного оксида, известных толщин пленок, уровня углерод-содержащих загрязнений было принято использовать два базовых значения ускоряющих напряжений в 1 и 3 кВ с временами травления от 1 минуты до получаса, их ступенчатые комбинации с регистрацией проверочных данных, или полного цикла XPS эксперимента после каждого этапа травления. Были экспериментально проверены скорости травления. Напряжение в 1 кВ было выбрано как наименьшее по значению стабильное ускоряющее напряжение, обеспечивающее мягкое удаление сверхтонких слоев поверхности. Однако с целью минимизации фазовых превращений при длительных временах профилирования единичный шаг травления составлял не более 10 минут. Напряжение в 3 кВ использовалось для понимания и уточнения возможных фазовых превращений при существенном увеличении скорости профилирования, что значительно для неорганических наночастиц и их био-окружения. Для тонкого профилирования, практически исключающего межатомное перемешивание в результате облучения ионным пучком, предпочтительным является режим в 1 кВ, а также пошаговое травление с контролем обзорных спектров XPS, для регистрации которых достаточно шага в 1 эВ. Вновь полученные пробы гибридных материалов прошли аттестацию методами оптической и растровой электронной микроскопии, включая вариативность содержания неорганических частиц в гибридных наноматериалах. Результаты контроля методом растровой электронной микроскопии за точечным ионным профилированием показали следующее. Морфология клеточных культур и гибридных наноструктур на их основе претерпевает значительные изменения, вызванные профилированием в локальной области, подвергнутой воздействию ионов аргона. Геометрия расположения ионного источника позволила подвергнуть все клетки, находящиеся в области травления (профилирования), частичному разрушению. Скорости удаления при этом показаны различными. Так для гибридных наноматериалов на основе клеточных культур: E.coli со сверхмалыми наночастицами оксидов железа показано частичное отсутствие части вакуумированных клеток после порядка 10 шагов последовательного воздействия ионным пучком при энергии 1 кВ и длительности шага 5 минут (удаление верхней части мембраны). С учетом того, что профилирование проходит под углом по отношению к общей поверхности пробы, часть клеточной стенки, противоположная источнику ионов, частично сохраняет свою форму даже после 10 шагов профилирования. Таким образом, внутренняя часть клетки в условиях сохранения сверхвысокого вакуума становится доступной зондированию методом XPS. Иначе выглядит ситуация с профилированной фокусированным ионным пучком поверхностью гибридных наноматериалов на основе клеточных культур млекопитающих, декорированных наночастицами кремния и его оксидов. При выбранных концентрациях наночастиц изменения в форме клеток могут происходить в области мембраны (декорирование) и при проникновении наночастиц внутрь. Профилирование, при выбранных значениях ускоряющих напряжений и времен, в первую очередь приводит к удалению поверхности наночастиц кремния (а точнее core-shell кремний – оксид кремния). Наблюдаемые при этом скорости формирования профиля существенно ниже, особенно при высоких концентрациях наночастиц и малых временах инкубации. Таким образом, в случае гибридных наноматериалов на основе клеточных культур млекопитающих, декорированных наночастицами кремния и его оксидов в первую очередь представляется возможным получить профиль покрывающих (декорирующих) наночастиц кремния, а лишь при увеличении количества сканирований изучить физико-химическое состояние тех частиц, которые проникли вглубь клеток при инкубации. Для времени не более 3 минут возможно профилирование при энергии 3 кВ, что позволяет эффективнее преодолеть «внешний», декорирующий слой наночастиц. Синхротронные и лабораторные экспериментальные данные обзорных спектров и спектров высокого разрешения метода XPS (Fe 2p, O1s, C1s и др. остовных уровней, при необходимости c контролем XANES) об атомном и электронном строении гибридных наноматериалов на основе клеточных культур E.coli со сверхмалыми наночастицами оксидов железа показали следующее. Наночастицы системы железо-кислород локализованы в области клеточной мембраны. Минимальная интенсивность сигнала на первых шагах профилирования связана с преимущественным формированием наночастиц во всем объеме клетки. Однако данные, полученные от внешней поверхности мембраны, и на первых шагах профилирования (частичное уделение мембраны) показали отсутствие полного перехода к оксиду Fe2O3 в формируемых наночастицах. Частичное удаление объема клетки при дальнейшем увеличении шагов профилирования показывает относительное увеличение количества наночастиц, формирующихся в зондируемом слое внутренней части клетки. Тонкая структура спектров практически не менялась, указывая на постоянство состава и физико-химического состояния наночастиц внутри клеток и на поверхности мембраны. Спектры тонкой структуры 2p 1/2 2p 3/2 железа показывают набор вкладов компонент 2- и 3-х валентного железа, металлического железа, в ряде случаев протонирования, подтверждая состав FexOy(Н). Наблюдаемый вклад спектральных компонент в общем подтверждает формирование агломератов кластерного типа с уравновешенным составом FexOy(Н), где стехиометрия будет определяться размерами и природой самой частицы (молекулы, в полости которой происходит накопление кластера) и вероятностью образования структуры типа ядро-оболочка в пределах одной частицы и их сверхмалых агломератов, размерами, не превышающими сотни нанометров. Установлены и уточнены критериальные условия проведения экспериментов и совместимости клеточных культур с неорганическими наночастицами на основе системы железо-кислород. Отсутствие линии 2p состояний железа на обзорных спектрах может наблюдаться и при точечном профилировании ионным пучком, что не доказывает реального отсутствия сигнала от атомов Fe. Для достоверного подтверждения наличия сигнала от атомов железа и его регистрации необходима запись соответствующего интервала области 2p состояний железа с бОльшими накоплениями. Пятиступенчатого травления с последовательным воздействием ионным пучком при энергии 1 кВ и длительности шага 5 минут достаточно для удаления достаточной части мембраны и повышения эффективности накопления слабого сигнала от наночастиц системы железо-кислород. Показано успешное формирование гибридной структуры, аккумуляция наночастиц в самой клетке, выполняющей роль фабрики, продуцирующей наномолекулы dps с неорганическим наноядром железа и его соединений во внутренней полости (не более 6 нм). В отличие от гибридных материалов на основе клеток E.coli, в которых формирование наночастиц происходит "изнутри" в полостях сферических наномолекул dps, клетки 3T3 NIH фибробласт мыши и MCF-7 рак груди человека "насыщались извне" (декорирование). По XPS данным (Si 2p, O1s, C1s и др. остовных уровней) наблюдалась деградация наночастиц, в том числе при профилировании. Показаны различия в соотношении поверхностного оксида, покрывающего наночастицы, и неокисленного кремния в зависимости от способа формирования и хранения, в том числе при точечном ионном травлении. Проведенное профилирование подтвердило, что в целом структуры имели тип "ядро-оболочка" для наночастиц Si, а толщины естественного оксида кремния SiO2 и переходного слоя субоксидов кремния являлись в первую очередь функциями режима подготовки. Отмечено существенное увеличение степени доокисления тех частиц, которые декорируют клетку в отличие от частиц, находящихся внутри клетки. Поверхностный слой оксида «внешних», декорирующих частиц составлял согласно нашим данным около 10 нм. Подтверждена деградация состава и структуры наночастиц в результате процессов растворения кремния при физико-химическом взаимодействии с внутриклеточной средой. Увеличение количества частиц приводит к замедлению этих процессов, однако их течение подтверждено изучением «внутренней» части клеток. Для надежного детектирования XPS данных, в том числе при ионном профилировании, требуется увеличение времен накопления, особенно при понижении количества наночастиц кремния, интегрируемых с клеточной культурой. Установлены и уточнены критериальные условия проведения экспериментов и совместимости клеточных культур с неорганическими наночастицами на основе системы кремний-кислород. Применение точечного ионного профилирования позволило изучить состав частиц, декорирующих клетку, для которых показано значительное доокисление поверхности как результат взаимодействия с окружающей средой при формировании и последующем хранении. Ступенчатое точечное травление при вариации количества шагов и увеличении до 3 кВ ускоряющих напряжений позволяет получить данные от внутренних для клетки наночастиц, имеющих иной состав, подтверждая процессы активного и деструктивного по отношению к наночастицам кремния взаимодействия с внутриклеточной средой при формируемом in vitro гибридном материале. Реализован метод декомпозиции XANES L2,3-спектров на L2- и L3-компоненты, выполнено разложение экспериментальных XANES L2,3-спектров кристаллического кремния, диоксида кремния и образца Si, покрытого слоем естественного оксида, на L2- и L3-компоненты. Вычислены теоретические эталонные XANES L3 спектры кремния и диоксида кремния. Проведена оценка вклада каждой из эталонных фаз в результирующем экспериментальном XANES спектре многофазной системы и определение вклада в поглощение слоя естественного оксида. Получены вклады в расчетные XANES спектры от состояний s- и d-симметрии. Показано, что в кристаллическом кремнии вблизи края спектра в области энергий шириной ~2 эВ s- и d-состояния вносят в спектр сопоставимый вклад, а при больших энергиях перехода XANES L3 спектр кремния формируется главным образом состояниями d-симметрии. В диоксиде кремния края поглощения состояниями s- и d-симметрии разнесены по энергии на ~2.5 эВ, при этом самый нижний по энергии максимум формируется почти целиком s- состояниями, а отстоящий от него на ~2.5 эВ в направлении больших энергий поглощения более широкий главный максимум спектра обусловлен поглощением главным образом состояниями d-симметрии. Получены компьютерные модели зонной структуры, полной и локальных парциальных плотностей электронных состояний, а также XANES K-спектров железа в моносилициде железа. На основе расчетов показано, что край поглощения находится при энергии ~7110 эВ, за которым следует локальный максимум при энергии ~7124 эВ. Главный максимум находится при энергии ~7140 эВ. При энергиях выше ~7145 эВ в спектр поглощения наряду с XANES дает заметный вклад другой механизм рассеяния – EXAFS (протяженная тонкая структура рентгеновского поглощения). Изучение взаимосвязей свойств, в первую очередь морфологии, гибридных материалов подвергнутых контролируемому фокусированному ионному травлению (профилированию) с данными по атомному и электронному строению, показали существенные различия в ходе профилирования для гибридных наноматериалов на основе клеточных культур: E.coli со сверхмалыми наночастицами оксидов железа; млекопитающих, декорированных наночастицами кремния и его оксидов. Мягкие режимы профилирования найдены наиболее эффективными для изучения клеточных культур E.coli со сверхмалыми наночастицами оксидов железа. Декорирование клеточных культур млекопитающих наночастицами оксида кремния делает необходимым увеличение количества шагов профилирования.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Пробы гибридных материалов были получены по установленным и проверенным протоколам формирования предыдущих этапов. Все пробы до и после термических модификаций были изучены методами оптической и растровой электронной микроскопии. Подтверждена целостность внешних сторон клеточных мембран, клеточных структур в целом, при температурах не превышающих диапазон от 25 до 200-250 С при краткосрочных (не более 20 минут) температурных воздействиях в атмосфере воздуха (или проточном воздействии аргона) и при in-situ отжигах в сверхвысоком вакууме. В целом превышение указанных длительностей отжигов даже при температурах 200-250 C, и при увеличении температур, приводят к нарушению целостности структур клеток, распределенных по поверхности подложек. Термическое воздействие в Ar-H среде приводит практически сразу к частичному, а затем, по истечении 30 минут, к заметному разрушению целостности клеток. Увеличение температуры и времени воздействия приводит к разрушению структур гибридного материала. Для клеточных культур на основе E.coli показана устойчивость процессов интеграции ионов Fe при температурах воздействий до 300 С и при продолжительности воздействия в 40 минут. Увеличение температуры и времени воздействия приводит к разрушению структур этого гибридного материала. Структуры с наночастицами пористого Si интегрированные с клетками млекопитающих претерпевают значительные изменения после термических воздействий. Полученные данные оптической и электронной микроскопии говорят о частичном разрушении гибридных структур при температурах еще до 250 С и практически полном удалении структур при значениях свыше 350 С. Основываясь на данных изучения Fe L2,3 краев и частично O К и C K синхротронные данные XANES об атомном и электронном строении при in situ/ex situ термических трансформациях неорганических частиц в гибридных наноматериалах на основе клеточных культур E.coli со сверхмалыми наночастицами Fe – O показано следующее. Малые времена (до 15 минут) и температуры воздействий до 250 С в атмосфере воздуха, аргона или в сверхвысоком вакууме при in-situ отжигах не приводят к трансформациям локального окружения атомов железа наночастиц в клетках. В «восстанавливающей» атмосфере Ar-H изменения существенны в сторону увеличения вклада FeO. Увеличение времен (до 40 минут) и/или температуры воздействий до 350 С в атмосфере воздуха, Ar или при in-situ отжигах приводит к изменению белкового «матрикса», вплоть до разрушения. Восстановления Fe не происходит даже при атмосфере Ar-H. Наибольший интерес для трансформаций гибридных наноматериалов на основе клеточных культур E.coli со сверхмалыми наночастицами оксидов железа представляет возможность восстановления наночастиц до металлического состояния и удаление углеродного «матрикса» (как контейнера для доставки наночастиц). Увеличение времени воздействий (до 40 минут), температуры (до 500 С) приводят к восстановлению Fe до 50% при ex-situ воздействии в восстанавливающей атмосфере Ar-H. Данные метода XPS в целом подтвердили данные XANES. Для достижения сопоставимых глубин зондирования применялось фокусированное ионное травление, в наиболее мягких режимах, установленных на предыдущих этапах. Анализ проводился по тонкой структуре Fe 2p линий, а также О и С 1s, общему соотношению интенсивностей линий обзорных спектров. Возможным объяснением результатов экспериментов является формирование агломератов кластерного типа с уравновешенным составом FexOy(Н), где стехиометрия будет определяться размерами и природой самой частицы (молекулы, в полости которой происходит накопление кластера) и вероятностью образования структуры ядро-оболочка в пределах частицы. Таким образом сама клетка фактически может выполнять роль фабрики, продуцирующей сферические наномолекулы dps (ок 10 нм) с неорганическим наноядром железа и его соединений во внутренней полости (не более 6 нм). При этом термическое воздействие может восстанавливать наночастицы состава Fe – O до металлического состояния. Основываясь на данных изучения Si L2,3 краев и частично O К и C K краев синхротронного метода XANES об атомном и электронном строении строения при in situ/ex situ термических трансформациях неорганических частиц в гибридных наноматериалах на основе клеточных культур млекопитающих, декорированных наночастицами Si – O, в том числе при различных временах инкубаций наночастиц в клетках, показано следующее. При температурах, не превышающих диапазон от комнатной до 200 С при краткосрочных (не более 20 минут) температурных воздействиях в атмосфере воздуха, проточном воздействии Ar и при in-situ отжигах в сверхвысоком вакууме не наблюдаются заметные нарушения конформации по данным микроскопии. Не наблюдается и изменений в специфике локального окружения атомов Si в наночастицах клеточного массива, электронном спектре. Изменения фрагментарны, температур и времен недостаточно для активации процессов окисления Si, в том числе за счет разрушения органического окружения. Увеличение температуры свыше 350 С и времен более 20 минут приводит к существенному удалению клеточного материала и практически полному доокислению наночастиц Si. Нагрев при тех же температурах в «восстанавливающей» атмосфере стимулирует доокисление наночастиц Si, вероятно за счет большей скорости разрушение органической части биогибридной структуры. Восстановления кремния при этом не установлено. Данные метода XPS в целом подтвердили данные XANES. Для достижения сопоставимых глубин зондирования применялось фокусированное ионное травление, в наиболее мягких режимах, установленных на предыдущих этапах. Анализ проводился по тонкой структуре Si 2p линий, а также О и С 1s, общему соотношению интенсивностей линий обзорных спектров. Тонкая структура Si 2p линий, в том числе после ионного травления показала бОльшую восприимчивость к термическим воздействиям клеток млекопитающих с интернализованными наночастицами пористого Si чем E.coli с частицами Fe – O. Изменения тонкой структуры спектров Si 2p, O 1s и C 1s говорят об удалении органической части структур при температурах свыше 350 С, особенно в «восстанавливающей» атмосфере Ar-H. Метод XPS не показал восстановления Si в наночастицах. Подтверждены процессы активного и деструктивного по отношению к наночастицам Si взаимодействия с внутриклеточной средой при формируемом in vitro гибридном материале, что в перспективе можно контролировать и чем можно управлять термически, например локальным разогревом. Результаты компьютерного моделирования показали, что рассматриваемой альфа-фазе Fe соответствует упорядоченная магнитная структура, причем все атомы Fe в полном соответствии с экспериментом имеют сонаправленные магнитные моменты. Анализ парциальных плотностей состояний указывает, что основной вклад в формирование энергетической структуры дают d-состояния. Между рассчитанными и измеренными спектрами рентгеновской эмиссии и поглощения наблюдается хорошее соответствие. Ряд особенностей тонкой структуры не разрешились что требует уточнения. Итогом анализа результатов проекта в целом является установление возможности эффективной и управляемой интеграции, совмещения неорганических наночастиц малого размера с клеточным материалом различного происхождения. Изучены системы неорганических частиц в гибридных наноматериалах на основе клеточных культур E.coli со сверхмалыми наночастицами Fe – O, а также неорганических частиц в гибридных наноматериалах на основе клеточных культур млекопитающих, декорированных наночастицами пористого Si и его оксидов. Показана возможность управления и тонкой подстройки особенностей локального атомного строения (окружения), электронно-энергетического спектра неорганических наночастиц в формируемых in vitro гибридных клеточных материалах. Перспективным видится продолжение исследований по влиянию низких температур, вплоть до криогенных на атомное и электронное строения и свойства гибридных клеточных материалов, по взаимодействию биогибридного материала с реальными 3D поверхностями.