Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. На основе изоалантолактона L1 и алантолактона L2 был получен ряд сесквитерпеновых лактонов, содержащих активированную двойную связь в лактонном цикле и пригодных для дальнейших превращений. Синтезировано 12 конъюгатов антрациклиновых антибиотиков с сесквитерпеновыми лактонами в препаративных количествах, достаточных для исследования на всех последующих этапах выполнения проекта. Проведена оценка цитотоксичности 12 соединений на панели клеточных линий и получены результаты, которые приведены ниже. 1) DNR-L1 в 2.3 раза менее токсичен по отношению к нормальным клеткам MDCK-M, а DOX-L1 почти в 3 раза для HEK-293 по сравнению с соответствующими антибиотиками; 2) DOX-L2 менее токсичен по отношению к нормальным клеткам HEK-293, чем исходный антрациклин (в 5 раз); DNR-L3 оказался активнее исходного DNR, а также почти в 2 раза менее токсичным для нормальных клеток MDCK-M; 3) DNR-L3 проявил большую токсичность на клетках рабдомиосаркомы RD, чем исходный антрациклиновый антибиотик. И более токсичным на нормальных клетках HEK-293, не на MDCK-M; 4) DNR-L4 в 1.7 раза активнее исходного DNR на клетках A549, в 8 раз для HCT116 и почти в 1.5 раза менее токсичен на нормальных клетках HEK-293; аддукт этого лактона с DOX в 1.5 раза активнее на клетках HeLa и также проявил себя на нормальных клетках HEK-293 – в 1.7 раза менее токсичен. На данном этапе конъюгат этого лактона с DNR рассматривается как соединение-хит; 5) DNR-L5 проявил меньшую токсичность на нормальных клетках HEK-293 (в 1.5 раза), чем исходный антрациклин, а DOX-L5 в 1.7 раз активнее DOX для клеток HeLa; 6) DNR-L6 активнее исходного DNR по отношению к линиям MCF-7 и RD, но в 3 раза токсичнее для HEK-293. DOX-L6 почти в 1.5 раза активнее для клеток HeLa и Jurkat, но в 7 раз токсичнее для HEK-293, чем исходный DOX; 7) По результатам определения IC50 установлено, что DNR активнее DOX для линий: HeLa, HepG2, HL-60, Jurkat, K562 и MCF7. Этим объясняется и результаты, полученные при оценке активности конъюгатов. Целесообразной является работа, направленная на исследование действия конъюгатов с DNR на опухолевые клетки. 2. Синтезированы новые природные матрицы L7-L12 для расширения ряда конъюгатов с антрациклиновыми антибиотиками. Установлено, что наибольшую активность на клетках HL-60 показал телекин (IC50=1.3мкМ), на линии клеток A549 проявил наибольшую активность костунолид, а дегидрокостуслактон оказался самым активным для линий MCF-7 и RD c IC50 равным 2.9 и 3.9, соответственно. На основании полученных данных по оценке цитотоксичности как соединений L7-L12, а также принимая во внимание, что DNR превосходит активность DOX для панели клеточных линий, расширение ряда конъюгатов проводили введением в реакцию с даунорубомицином лактонов L7-L12 по методике, использованной для синтеза конъюгатов с лактонами L1-L6. Таким образом были синтезированы новые, неописанные ранее соединения – производные рубомицина с изотелекином (DNR-L7), телекином (DNR-L8), рейнозином (DNR-L9), сантамарином (DNR-L10), костунолидом (DNR-L11) и дегидрокостуслактоном (DNR-L12). По результатам оценки цитотоксичности новых конъюгатов сделаны следующие выводы: DNR-L7 активнее исходного DNR в 2 раза для HCT116 и почти в 3 раза для MCF7 (однако токсичнее на нормальных HEK-293); DNR-L8 в 3 раза активнее DNR для MCF7 (в 3.5 раза токсичнее на нормальных HEK-293); DNR-L9 в 3 раза активнее DNR для MCF7 и RD (в 2.4 раза токсичнее на HEK-293); DNR-L10 почти в 2 раза активнее исходного DNR для A549, в 4.3 раза для MCF7 и в 3.4 раза для RD (но значительно токсичнее на HEK-293); DNR-L11 в 3 раза активнее DNR для MCF7 и значительно токсичнее на HEK-293; DNR-L12 в 2.5 раза активнее DNR для MCF7 и RD MCF7 и значительно токсичнее на HEK-293. На основании полученных данных можно выделить в качестве наиболее активного конъюгат даунорубицина с сантамарином DNR-L10. 3. Изоалантолактон проявил высокую активность в тестах по оценке цитотоксичности на панели опухолевых клеточных линиях, а также имеются литературные сведения о его действии на различные мишени в опухолевой клетке. Принимая это во внимание, а также данные, полученные нашей исследовательской группой ранее на данном этапе выполнения Проекта даунорубицин модифицировали по кетогруппе агликона изоалантолактоном. Конечной задачей такой модификации являлось формирование сшивки с высокомолекулярным носителем для системы доставки антрациклина в виде пролекаства в клетку-мишень. Модификации по кетогруппе агликона крайне редко встречаются в литературе и представлены исключительно реакцией с гидразидами, ведущей к образованию иминов (оснований Шиффа). Используя преимущества такого подхода, была сделана замена аминной компоненты (с инертного в биологическом плане полимера) на низкомолекулярный агент. На всех клеточных линиях конъюгат изоалантолактона с даунорубицином по кетогруппе агликона превысил активность конъюгата по даунозамину: для линии HCT116 в 2 раза активнее, для HEp-2 в 2.2, для HepG2 в 2.6, для HL-60 в 5.5, для Jurkat в 1.7, для K562 в 3.4 и для SHSY5Y в 3 раза, однако в 5.7 раз превысил показатель IC50 для нормальных клеток HEK-293 и, по сравнению с исходным DNR, оказался активнее только для линии HL-60. Также было оценено действие соединений L1, DNR, DNR-L1 и DNR-L1-Shb в течение 24ч на клетки линии K562: показатели IC50 для такого времени экспозиции исследуемых соединений (антрациклинового антибиотика, конъюгатов по агликону и кетогруппе) отличаются незначительно и составляют 0.77, 0.66 и 0.96 мкМ, соответсственно. Синтезирован неизвестный ранее конъюгат антрациклинового антибиотика даунорубицина с природным изоалантолактоном по типу основания Шиффа DNR-L1-Shb, проведена оценка токсичности по отношению к опухолевым клеточным линиям и сделаны предпосылки для изучения характера и предположительного механизма действия. 4. Оценка влияния даунорубицина и его конъюгата с эпоксиизоалантолактоном на клеточный цикл клеток линии K562 Результаты эксперимента по оценке влияния противоопухолевого антибиотика – даунорубицина DNR и его конъюгата с эпоксиизоалантолактоном DNR-L4, на клеточный цикл линии K562 с помощью метода проточной цитометрии после 6 и 24 часов инкубации клеток с исследуемыми соединениями позволяют сделать вывод о том, что DNR-L4 вызывает накопление клеток в S-фазе клеточного цикла за счет снижения процента клеток в G0/G1-фазе. 5. Оценка влияния дегидрокостуслактона на апоптоз в клетках Jurkat в тесте с Annexin V. Для детектирования апоптоза в клетках Jurkat использован метод проточной цитометрии. Проведена оценка экстернализации фосфатидилсерина с помощью теста с аннексином V (который имеет высокое сродство к фосфатидилсерину), конъюгированный с красителем Alexa Fluor® 488, а для определения некротической популяции использован краситель SYTOX Blue (который легко проникает в клетки с нарушенными плазматическими мембранами). Исследованный природный дегидрокостуслактон (L12) проявил активность на панели опухолевых клеточных линий и в данном эксперименте была проведена оценка влияния этого соединения на апоптоз в клетках Jurkat. Действие дегидрокостуслактона (10 мкМ) приводит к увеличению апоптотической популяции клеток Jurkat почти в 2 раза по сравнению с контролем после 6 часов инкубации, а некротических клеток в 3 раза после 24 часов. 6. Морфологическая оценка состояния левого желудочка у крыс при введении даунорубицина DNR и конъюгата даунорубицина с эпоксиизоалантолактоном DNR-L4. Одним из путей снижения кардиотоксичности даунорубицина является его модификация сесквитерпеновыми лактонами. Из серии модифицированных аналогов даунорубицина было выбрано для анализа наиболее эффективное соединение - конъюгат даунорубицина с эпоксиизоалантолактоном DNR-L4. Использование DNR-L4 вызывает менее выраженное повреждающее действие на кардиомиоциты и сосудистый компонент стромы миокарда, чем DNR. Предположительно, DNR-L4 обладает меньшим кардиотоксическим действием.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Определён индекс IC50 всех синтезированных веществ (22 конъюгата) в отношении панели опухолевых клеточных линий (НСТ116, MCF7, А549, SH-SY5Y, HEp-2, PANC-1, RD, HeLa, HepG2, OKP-GS, MDCK-M, HEK-293, FLECH-T, K562, Jurkat и HL-60) с помощью МТТ- и ресазурин-теста. Значение концентрации, вызывающее 50% ингибирование роста популяции клеток (IC50, мкМ), было определено на основе дозозависимых кривых. По результатам всего эксперимента установлено, что пять конъюгатов проявили цитотоксичность, сравнимую или превышающую цитотоксичность даунорубицина в отношении большинства использованных опухолевых клеточных культур. Это производные с алантолактоном (DNR-L02), эпоксиизоалантолактоном (DNR-L04), эпоксиаллоалантолактоном (DNR-L06), дегидрокостуслактоном (DNR-SL62) и костунолидом (DNR-SL63). Для прогнозирования токсичности все соединения были протестированы в отношении нормальных клеточных линий млекопитающих FLECH-T, HEK-293, MDCK-M и NIH/3T3. Цитотоксичность была определена in vitro в МТТ-тесте. Дополнительно мы расширили исследование экспериментом по определению острой токсичности выбранных соединений. Острую токсичность соединений DNR-L04, DNR-SL62 и DNR определяли по экспресс-методике Прозоровского В.Б. Бóльшая часть конъюгатов не обладает селективной токсичностью по отношению к опухолевым клеточным линиям. Те соединения, которые оказывают высокую цитотоксичность в отношении опухолевых клеток (DNR-L02, DNR-L06, DNR-SL63), проявляют высокую цитотоксичность и по отношению к нормальным линиям клеток. Стоит выделить только два конъюгата DNR-L04 и DNR-SL62, которые при цитотоксичности, равной цитотоксичности даунорубицина в отношении большинства опухолевых культур, продемонстрировали меньшую цитотоксичность по отношению к нормальным клеточным линиям, приближенную к даунорубицину. Эти два соединения были признаны нами соединениями-хитами и подвергнуты далее испытаниям на острую токсичность в опытах in vivo. Установлено, что ЛД50 даунорубицина составляет 44,7 (37÷53) мг/кг и относится к группе умеренно токсичных веществ (3 класс токсичности), а ЛД50 соединений L04-DNR и SL62-DNR превышает 100 мг/кг, что позволяет отнести их к малотоксичным веществам (4 класс токсичности) по классификации Сидорова К.К. Оценку влияния наиболее активных синтезированных соединений на запуск апоптоза (по уровню экстернализации фосфатидилсерина и активации каспаз) и клеточный цикл (путем оценки содержания ДНК для определения соотношения клеточных популяций) опухолевых линий выполнена с помощью метода проточной цитофлуориметрии. При обработке клеток HL60 соединениями в дозах, близких к IC50 в течение 24 часов, содержание апоптотической и некротической популяций статистически значимо отличается от контроля практически у всех соединений. Наиболее сходным с антарциклиновым антибиотиком по действию является конъюгат с рейнозином (DNR-SL73). По отношению к линии Jurkat такой эффект показали даунорубицин и производное с костунолидом (DNR-SL63). Новые конъюгаты сохраняют сходное с даунорубицином влияние, вызывая накопление клеток в фазе G2/M клеточного цикла. Однако выраженность этих эффектов варьировалась в зависимости от клеточной линии и времени инкубации с соединениями. Из протестированных соединений на клеточной линии Jurkat только производные с изотелекином (DNR-SL17) и костунолидом (DNR-SL63) сохраняли наиболее близкий к исходному антрациклиновому антибиотику эффект. На линии клеток A549 эффект сохраняли конъюгаты с телекином (DNR-SL20), дегидрокостуслактоном (3c), костунолидом (DNR-SL63) и рейнозином (SNR-SL73). Соединения DNR-SL62 и DNR-SL63 были также наиболее активны в отношении клеток линии HL60. На клетках линии K562 только DNR-SL62 проявлял аналогичную активность в отношении ареста клеток в G2/M фазе клеточного цикла. Полученные данные свидетельствуют о том, что основной эффект действия исследуемых соединений на клетки – цитостатический. Вероятно, что запуск апоптотической гибели клеток является результатом накопления клеток в G2/M фазе клеточного цикла (клетки не могут поделиться) и нарушения структуры молекулы ДНК. Исследование влияния соединений на структуру актинового цитоскелета проводили на клетках линии A549 при помощи лазерного сканирующего микроскопа в тесте с родамин-фаллоидином. Полеченные данные структурного состояния f-актина согласуются с результатами изучения влияния соединений на клеточный цикл. При обработке клеток веществами в дозах, близких IC50, клетки накапливаются в G2/M фазе клеточного цикла (клетки не делятся и остаются с двойным набором генетического материала) и, вероятно, это может быть связано с влиянием на сборку f-актина, который участвует во многих процессах в клетке: передвижение, поддержание формы, а также участвует при делении клеток. Гликолитическую активность опухолевой линии клеток HeLa под действием исследуемых соединений оценивали при помощи гликолиз стресс-теста по трём основным параметрам гликолитической функции: гликолизу, гликолитической ёмкости и гликолитическому резерву. Также было оценено действие на работу комплексов электрон-транспортной цепи, процесс перекисного окисления липидов, а также на трансмембранный потенциал митохондрий. При добавлении конъюгатов даунорубицина с сесквитерпеновыми лактонами DNR-SL17, DNR-SL63 и DNR-SL73, а также DNR, происходит индукция свеллинга, сравнимая с формированием митохондриальной поры проницаемости под действием стандартного триггера данного процесса — ионов кальция в концентрации 50 мкМ. В свою очередь при исследовании трансмембранного потенциала митохондрий было показано, что даунорубицин оказывает выраженное деполяризующее действие, в то время как для конъюгатов наблюдается аналогичное влияние, но не превышающее 22,69 ±0,81% (в 4 раза ниже активности даунорубицина). Установлено, что как доксорубицин, так и даунорубицин оказывают выраженное ингибирующее действие в отношении второго комплекса электрон-транспортной цепи. Это выражается в снижении скорости потребления кислорода органеллами более чем на 70%. В свою очередь для большинства синтезированных конъюгатов было обнаружено или отсутствие влияния на работу комплексов дыхательной, или снижение скорости потребления кислорода митохондриями не более чем на 40%. Подавляющее большинство конъюгатов даунорубицина с сесквитерпеновыми лактонами обладают прооксидантной активностью, о чем свидетельствует достоверное увеличение уровня МДА в системах при сравнении с контролем (1% DMSO). В то время как исходный антрациклиновый антибиотик усиливает интенсивность перекисного окисления липидов почти в 3 раза, для синтезированных производных повышение уровня МДА не превышало 164,32±15,92% (для DNR-SL73 на ПОЛ гомогената мозга крыс) и 197,14±6,42% (для DNR-SL63 на ПОЛ липосом). В результате эксперимента по исследованию кинетики взаимодействия наиболее активных конъюгатов с опухолевыми клетками можно сделать вывод о том, что «дикий тип» опухолевых клеток захватывает максимум даунорубицина в первые полчаса-час культивирования. Даунорубицин интеркалирует в ДНК и не выбрасывается обратно в значимых количествах. Резистентный к даунорубицину фенотип клеток К562 (К562/DNR) получен из родительской линии клеток К562 (хроническая миелогенная лейкемия) путем длительного (20 пассажей) культивирования клеток в полной питательной среде и возрастающей концентрацией (от 1 до 200 нМ) даунорубицина. В результате эксперимента по определению цитотоксической активности наиболее активных соединений в отношении резистентных линий опухолевых клеток А549/(DNR 0,4 мкМ) и К562/(DNR 0,2 мкМ) можно выделить конъюгат DNR-L04, который, хотя и продемонстрировал снижение цитотоксичности, однако остался более активным соединением, чем даунорубицин. В рамках Проекта была проведена оценка кардиотоксичности конъюгатов антрациклиновых антибиотиков с сесквитерпеновыми лактонами на 15 половозрелых самках белых крыс линии Sprague-Dawley. Гистологическое исследование сердца производили в продольном разрезе. Материал подготавливали по стандартной методике, делали парафиновые срезы толщиной 6 мкм и окрашивали гематоксилином Джилла и эозином и изучали на световом микроскопе. Компьютерную морфометрию проводили методом точечного счета в 6 случайных полях зрения (1 мм2) с помощью программы обработки графических изображений. В результате были получены удельные объемы (УО) следующих компонентов паренхимы: цитоплазмы кардиомиоцитов (КМЦ) и ядер КМЦ; и стромы миокарда: соединительной ткани и сосудов. Дополнительно рассчитывали паренхиматозно-стромальное отношение (ПСО) как отношение УО всех компонентов паренхимы к УО всех компонентов стромы миокарда. Измеряли диаметры КМЦ и вычисляли их средний диаметр. Также измеряли внешний и внутренний диаметр мелких артерий и артериол, толщину сосудистой стенки и рассчитывали средние значение данных измерений. Несмотря на отсутствие статистической значимости, наблюдается тенденция к увеличению средних значений внутреннего и внешнего диаметров и толщины сосудистой стенки от группы контроля к группе 2 (контроль → группа 3 → группа 2). Данные изменения в сосудистом компоненте стромы миокарда также, вероятно, свидетельствуют о меньшем кардиотоксическом эффекте конъюгата даунорубицина с эпоксиизоалантолактоном (DNR-L04). В рамках Проекта было проведено предварительное исследование по изучению антилекемической активности производных противоопухолевого антибиотика даунорубицина - DNR-L04 и DNR-SL62 в сравнении с даунорубицином. Все соединения вводились в одинаковой дозе (5 мг/кг) и режиме введения (на 1 и 6 сутки после перевивки опухолевого штамма). Исследуемые производные DNR-L04 (ILS 4%) и DNR-SL62 (ILS 30 %) показали результат на опухолевом штамме Р-388 несколько хуже, чем сам даунорубицин (ILS 79 %).