КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-73-10134

НазваниеНовое поколение электрохимически активных материалов для (био)сенсоров для медицинской диагностики на основе полифункциональных макроциклов, производных фенотиазина и биомолекул

РуководительПадня Павел Леонидович, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет", Республика Татарстан (Татарстан)

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2019 - 06.2022 

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-405 - Наноструктуры и кластеры. Супрамолекулярная химия. Коллоидные системы.

Ключевые словатиакаликс[4]арены, функционализация макроциклов, самосборка, бионаноматериалы, супрамолекулярная химия, фенотиазины, электрохимические сенсоры, биосенсоры, аминокислоты, белки.

Код ГРНТИ31.21.27


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Сложившаяся мировая тенденция к переходу на новый тип оказания медицинских услуг, где во главе ставятся индивидуальные особенности организма пациента, предъявляет новые требований к методам диагностики. Персонализированная медицина направлена на лечение пациента, а не симптомов болезни у среднестатистического человека. Такой подход может быть реализован только с учетом биохимических особенностей организма, поэтому на стадиях профилактики, диагностики и лечения больного существует потребность в контроле содержания множества биологических соединений. Существующие методы контроля биологически важных соединений зачастую страдают отсутствием мобильности, продолжительной пробоподготовкой и дороговизной оборудования. Эти методы не могут обеспечить экспрессность анализа и его доступность в режиме «point-of-care testing» (диагностика у постели больного), что затрудняет своевременную диагностику и назначение лечения. Альтернативой современным методам выступают биосенсорные технологии, которые входят в перечень критических технологий Российской Федерации. Компактные и чувствительные устройства, способные мгновенно предоставлять информацию о содержании интересующих веществ (аналитов), по аналогии с глюкометрами, могут стать эффективным инструментом в руках медицинского работника будущего. Чувствительность и селективность разрабатываемых биосенсоров в первую очередь зависит от применяемых материалов – модификаторов поверхности трансдьюсера (преобразователь сигнала). По сей день актуальной остается проблема синтеза материалов, обеспечивающих оптимальную иммобилизацию и распознавание биомолекул. Зачастую новые материалы, которые предлагаются для биораспознавания, обладают прекрасными характеристиками, в том числе биосовместимостью, но полностью или частично блокируют поверхность трансдьюсера, затрудняя преобразование химического сигнала о биоспецифическом процессе в более доступный электрический. В таком случае приходится прибегать к введению в состав материала дополнительных компонентов, к примеру, электропроводящих наночастиц металлов, которые ухудшают биосовместимость материала. Представленный проект направлен на решение проблемы синтеза новых бионаноматериалов с функцией биораспознавания и не менее актуальной проблемы адаптации полученного материала для работы в составе биосенсоров. За взаимодействие с биомолекулами и сохранение их нативной структуры будет отвечать новый супрамолекулярный материал, получаемый за счет предварительной самоорганизации тиакаликсаренов и электрохимически активных мономеров – производных арилиминофенотиазинов. Последующая полимеризация пространственно ориентированных мономеров будет приводить к формированию трехмерных структур, где относительно крупные белковые молекулы будут удерживаться силами электростатических взаимодействий с заряженными мультивалентными макроциклическими соединениями и нановолокнами полимера. Дальнейшее электрохимическое поведение нового полимерного материала на поверхности трансдьюсера будет определяться изменением зарядового распределения после протекания биоспецифического распознавания. Также будет рассмотрена возможность модификации заместителей тиакаликсарена фрагментами, отвечающими за донорно- акцепторное взаимодействие и комплексообразование, с целью обеспечения наилучших характеристик связывания низко- (аминокислоты) и высокомолекулярных (белки) аналитов. Возможность контроля трехмерной структуры материала за счет использования различных конфигураций макроцикла (конус, частичный конус, 1,3-альтернат) позволит оптимизировать состав модифицирующего покрытия биосенсора для обеспечения эффективной иммобилизации биокомпонента и диффузии аналитов в структуру материала. Конкурентными преимуществами предлагаемых материалов являются их гидрофильность и электроактивность, которые не только облегчают проникновение низкомолекулярных соединений - аналитов в состав распознающего слоя биосенсора, но и позволяют проводить анализ с использованием диффузионно свободных индикаторов в водных растворах. Впервые предложено использование наноструктурированных полимеризованных форм алкил- и арилиминофенотиазинов для выполнения нескольких задач: формирования эффективной матрицы для удерживания биокомпонентов сенсора и генерации электрохимического отклика системы на протекание биоспецифических процессов. Использование мультивалентных производных тиакаликсарена, замещенных заряженными группами и аминокислотными остатками в различных положениях относительно ядра макроцикла, позволит проводить предварительную самосборку супрамолекулярных систем и обеспечит дополнительные возможности по связыванию биомолекул.

Ожидаемые результаты
Разработка методики дизайна новых материалов на основе замещенных тиакаликсаренов и полимерных форм алкил- и арилиминофенотиазинов, способных производить эффективную иммобилизацию низко- (аминокислоты) и высокомолекулярных биомолекул (белки) при сохранении их доступности для взаимодействий с аналитами и обладающих собственной электроактивностью. Придание макроциклу функций узла для электростатического контроля координации электрохимически активных мономеров и, одновременно, введение в его заместителей донорами и/или акцепторами водородных связей и п-п взаимодействий позволит повысить характеристики распознавания низко- и высокомолекулярных соединений. Гидрофильность полученного впоследствии покрытия биосенсоров определит преимущества предложенных материалов в результате сохранения условий электронного обмена и диффузии аналитов. Будут определены характеристики самосборки двух- и трех-компонентных супрамолекулярных систем на основе производных тиакаликсарена, полимерных форм алкил- и арилиминофенотиазина и биомолекул (аминокислоты, модельные белки и белки бета-амилоид 42, Д-димер) в водных и органических средах. Будет определен оптимальный состав модифицирующего покрытия новых биосенсоров для количественной оценки биоспецифических взаимодействий, в том числе природа заместителей макроцикла и их положение относительно ядра молекулы (конфигурация), общее содержание тиакаликсарена в материале. Будут установлены наиболее пригодные условия для иммобилизации биокомпонента на поверхности сенсора (захват в состав растущей пленки на стадии полимеризации, послойное накопление за счет электростатических и донорно-акцепторных взаимодействий, ковалентная сшивка). Электроаналитическими методами будут охарактеризованы условия электронного обмена на поверхности трансдьюсера (гетерогенные константы скорости электронного переноса, сопротивление переноса заряда на границах трансдьюсер - материал, материал - раствор), и выявлены закономерности между составом материала и характеристиками распознавания аналитов с помощью новых биосенсоров. Полученные материалы в перспективе могут найти применение при конструировании чувствительных устройств, необходимых для распознавания биологически важных соединений (нуклеиновые кислоты, аминокислоты, белки – маркеры заболеваний, лекарственные препараты и др.). Получение таких материалов с биорецепторными свойствами сможет ускорить переход к персонализированной медицине. Достижение конечной цели по синтезу новых материалов и их интеграции в состав биосенсоров носит важный социальный характер, поскольку позволит повысить уровень здоровья и снизить риск потери трудоспособности населения. Результаты исследований по дизайну и созданию электрохимически активных бионаноматериалов и (био)сенсоров на их основе публикуются в самых высокорейтинговых международных научных журналах, что еще раз подчеркивает актуальность и значимость выбранной тематики.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Поставленные в Проекте цели на первый год полностью достигнуты. В ходе выполнения Проекта получены результаты по всем основным его направлениям. Была разработана пошаговая методика синтеза ряда катионных макроциклов, содержащих положительно заряженные четвертичные аммониевые и имидазолиевые фрагменты, на основе п-трет-бутилтиакаликс[4]арена с высокими выходами. Разработанная методика заключается в аминолизе сложноэфирных производных тиакаликсарена аминами, содержащими третичную аминную или имидазольную группы, с последующим алкилированием полученных соединений галоген-содержащими реагентами с различной длиной алкильного заместителя, и заменой бромид- и иодид-анионов в синтезированных четвертичных аммониевых и имидазолиевых солях на хлорид-анионы с помощью ионнообменной смолы. Впервые разработана синтетическая стратегия синтеза новых водорастворимых карбоксилатных производных тиакаликс[4]арена в конфигурациях конус, частичный конус и 1,3-альтернат, заключающаяся в алкилировании макроциклических третичных аминов реагентами, содержащими высоко реакционно-способный фрагмент Br-CH2-CO-R (R = OEt или N(CH2COOEt)2), с последующим хемоселективным гидролизом сложноэфирных фрагментов. На основании результатов анализа и систематизации литературных данных, а также имеющегося у научного коллектива опыта в области самосборки макроциклов и ионов серебра, была опубликована обзорная статья [1]. Статья систематизирует имеющийся на данный момент практический опыт исследователей в области синтеза и изучении свойств супрамолекулярных систем макроциклических соединений (в том числе тиакаликсаренов) и ионов серебра. Обобщённые данные позволяют коллективу разработать подходы к созданию материалов - модификаторов сенсоров, включающих неэлектропроводные молекулы макроциклов и наночастицы серебра. Впервые были получены новые производные фенотиазина, содержащие сложноэфирные, карбоксильные, гидроксильные, амидные и аминогруппы, а также и четвертичные аммониевые фрагменты. Для синтеза фенотиазина с амидными и гидроксильными группами были применены дивергентный (непосредственный аминолиз аминоэтанолом сложноэфирного производного фенотиазина) и конвергентный (аминолиз этилового эфира 4-аминобейнзойной кислоты аминоэтанолом с последующим взаимодействием продукта с фенотиазином) методы синтеза. Было показано, что итоговый выход целевого соединения при конвергентном подходе составил 38.4%, что значительно выше, чем при дивергентном подходе (15%). Показано, что при добавлении третичных аминов к фенотиазину в спиртах происходит олигомеризация, в результате которой были впервые получены олиго(3,10)фенотиазины. Получение полимерных форм фенотиазинов химическим способом – задача нетривиальная, и химическое получение (3,10)олигомеров, состоящих из 3-6 фрагментов фенотиазина, является прорывным результатом, развитие которого открывает возможность получения полифенотиазинов. С помощью методов динамического светорассеяния и просвечивающей электронной микроскопии была исследована самосборка полученных производных тиакаликс[4]арена в воде. Показано, что изученные соединения образуют в воде наночастицы с низким индексом полидисперсности. С помощью метода динамического светорассеяния показано, что полученные тиакаликс[4]арены способны в воде образовывать двухкомпонентные супрамолекулярные системы с производными фенотиазина, при этом формируются частицы субмикронного размера. Установление электрохимических характеристик новых синтезированных материалов является неотъемлемой частью любого исследования, направленного на конструирование электрохимических (био)сенсоров. Проверка электрохимической активности новых соединений позволяет прогнозировать характеристики разрабатываемых устройств, проводить по результатам этой проверки скрининг наиболее оптимальных кандидатов на роль модификатора трансдьюсера и выявлять закономерности, связывающие химическую структуру новых соединений и их редокс-активность на поверхности электрода. В рамках первого этапа Проекта было подвергнуто электрохимическому изучению на поверхности стеклоуглеродного электрода производное фенотиазина N-фенил-3-(фенилимино)-3H-фенотиазин-7-амин (PhTz) [2]. По результатам исследования выявлены особенности электродной реакции PhTz на поверхности стеклоуглеродного электрода: смешанный режим переноса электрона, т.е. наличие процессов сорбции, электрохимическая квазиобратимость реакции и сильное влияние рН среды на формальный редокс-потенциал (Е0’) пары PhTz(ox)/PhTz(red). Была предложена схема электрохимических превращений нового соединения на поверхности стеклоуглеродного электрода, предполагающая перенос разного количества протонов водорода и электронов в реакциях, проводимых в кислых (рН<7) и щелочных (рН>7) средах. В ходе выполнения первого этапа разработана методика электрополимеризации нового производного фенотиазина PhTz. Установлены оптимальные условия проведения электросинтеза polyPhTz, включая диапазон сканирования потенциалов, состав фонового электролита, соотношение водной и органической частей рабочего раствора и его рН. Формирование пленки нового материала на поверхности стеклоуглеродного электрода подтверждено данными электронной микроскопии и спектроскопии электрохимического импеданса. Были определены параметры электронного переноса и его обратимости с использованием электрода, покрытого новым электрополимеризованным материалом на основе производного арилиминофенотиазина. Исходя из полученных величин, пленку polyPhTz можно отнести к редокс-активным непроводящим полимерам. Выполнена апробация электросинтезируемых покрытий в качестве модификатора индикаторного электрода при проведении потенциометрического титрования органических кислот и при определении ХПК (химическое потребление кислорода). Результаты проведенных работ позволили предложить протокол конструирования ДНК-сенсора, основанный на нековалентных взаимодействиях нового полимерного материала и молекул двухцепочечной ДНК. Продемонстрирована возможность дискриминации нативных и поврежденных (термическая денатурация и химическое окисление) молекул ДНК по данным спектроскопии электрохимического импеданса с использованием сконструированного ДНК-сенсора. 1. https://www.mdpi.com/1422-0067/21/4/1425 2. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468620305879

 

Публикации

1. Кузин Ю.И, Падня П.Л., Стойков И.И., Горбачук В.В., Стойков Д.И., Хадиева А.И., Евтюгин Г.А. Electrochemical behavior of the monomeric and polymeric forms of N-phenyl-3-(phenylimino)-3H-phenothiazin-7-amine Electrochimica Acta, 345, 136195 (год публикации - 2020).

2. Падня П.Л., Горбачук В.В., Стойков И.И. The role of calix[n]arenes and pillar[n]arenes in the design of silver nanoparticles: self-assembly and application International Journal of Molecular Sciences, 21, 4, 1425 (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Поставленные в Проекте цели на второй год полностью достигнуты. В ходе выполнения Проекта получены результаты по всем основным его направлениям. Была разработана методика синтеза новых производных п-трет-бутилтиакаликс[4]арена, содержащих одновременно четвертичные аммониевые, амидные и аминокислотные фрагменты, в конфигурациях конус, частичный конус и 1,3-альтернат. Разработанная методика заключается в аминолизе сложноэфирных производных тиакаликсарена аминами, содержащими третичные аминогруппы, с последующим алкилированием полученных соединений реагентами, содержащими сложноэфирные группы и фрагменты аминокислот. Последующим хемоселективным гидролизом сложноэфирных фрагментов в полученных соединениях были получены соответствующие карбоксилатные производные на основе тиакаликс[4]арена в трех конфигурациях – конус, частичный конус и 1,3-альтернат, в цвиттер-ионной форме. С высокими выходами был получен ряд макроциклических аммониевых солей и бетаинов. Впервые синтезирована серия катехол-содержащих оснований Шиффа на основе тетразамещенных по нижнему ободу производных тиакаликс[4]арена в трех стереоизомерных формах – конус, частичный конус и 1,3-альтернат. Методом УФ спектроскопии показано избирательное распознавание катионов меди (II) в ряду катионов d-металлов (меди (II), никеля (II), кобальта (II) и цинка (II)). С помощью ряда физических методов показано, что ионы меди (II) координированы по атому азота иминной группы и ближайшему атому кислорода катехольного фрагмента в производных тиакаликсарена. На основе комплексов 1,3-альтернат + Cu (II) были получены термостойкие органо-неорганические медь-содержащие материалы. Была изучена антибактериальная активность и цитотоксичность макроциклических четвертичных аммониевых солей, полученных на первом году выполнения Проекта по отношению к ряду грамположительных и грамотрицательных бактерий. Полученные соединения обладают высоким антибактериальным действием в отношении грамположительных (S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis) бактерий, сопоставимым с используемыми в продаже антисептиками хлоргексидином, мирамистином и бензалкония хлоридом. Было обнаружено, что большинство четвертичных аммониевых производных тиакаликс[4]арена в конфигурации 1,3-альтернат более эффективно подавляют рост исследуемых штаммов бактерий по сравнению с соединениями в конфигурации конус. Исследования цитотоксичности клеток фибробластов кожи человека продемонстрировали, что все соединения менее токсичны по сравнению с контрольными препаратами и имеют достаточно большое терапевтическое окно. При установлении механизма биологической активности было показано, что соединения в конфигурации конус адсорбируются на поверхности мембраны модельных везикул, в то время как включение липофильных алкильных фрагментов макроциклов в конфигурации 1,3-альтернат в мембрану приводит к «слипанию» везикул. Было изучено взаимодействие соединений, содержащих четвертичные аммониевые и карбоксильные фрагменты, с аминокислотами и рядом модельных белков – лизоцим, бычий сывороточный альбумин, гемоглобин в воде. Показано, что полученные аммониевые производные не взаимодействуют с аминокислотами и белками. Тиакаликс[4]арены в конфигурация конус, частичный конус и 1,3-альтернат, содержащие фрагменты иминодипропионой кислоты по нижнему ободу, взаимодействуют с лизоцимом и гемоглобином с образованием нанометровых и субмикронных ассоциатов. Были определены стехиометрия (1:1) и константы связывания белков (LogK = 3.36-5.10). Электрохимические исследования в рамках второго этапа Проекта были главным образом посвящены оценке того, как включение в состав изученного ранее N-фенил-3-(фенилимино)-3H-фенотиазин-7-амина (PhTz) карбоксильных и аминогрупп скажется на его электрохимическом поведении. Для того, чтобы дальнейшее сравнение результатов было корректным, экспериментальные условия (концентрация, диапазон потенциалов, рН, природа фонового электролита) для синтезированных молекул PhTz-(NH2)2 и PhTz-(COOH)2 не отличались от таковых для PhTz. Наличие новых электронодонорных аминогрупп в структуре PhTz-(NH2)2 облегчало процесс электроокисления по сравнению с PhTz. В случае PhTz-(COOH)2, наоборот, пики окисления на вольтамперограммах сдвигались в область положительных потенциалов, демонстрируя снижение реакционной способности молекулы. Электрохимическое поведение изученных соединений испытывало сильное влияние рН. Для карбоксильного производного электродная реакция сопровождалась переносом 2 электронов и 2 ионов водорода во всем изученном диапазоне рН рабочего раствора, для PhTz-(NH2)2 установлена область рН с вдвое меньшим числом переносимых ионов водорода в лимитирующей стадии. Более того, для аминированного производного зарегистрирован переход между протонированной окисленной и протонированной восстановленной формами, ранее не обнаруженный для PhTz. Таким образом, можно говорить о положительном влиянии аминогрупп на стабильность восстановленной протонированной формы соединения в кислой области рН. По результатам исследования для обоих производных была предложена и экспериментально подтверждена схема переходов между окислительно-восстановительными состояниями. Сравнение кинетических параметров реакций с участием PhTz-(NH2)2, PhTz-(COOH)2 и PhTz говорит о незначительном влиянии дополнительных функциональных групп на скорость электродной реакции (k0 для PhTz 11×10-4 см×с-1, для PhTz-(NH2)2 и PhTz-(COOH)2 ~ 8×10-4 см×с-1). Новые изученные соединения демонстрировали различную склонность к электрополимеризации. В целом по данным пьезокварцевого микровзвешивания и спектроскопии электрохимического импеданса количество электроосаждаемого в ходе электролиза продукта снижалось. По эффективности электросинтеза полимера изученные молекулы составили ряд PhTz > PhTz-(NH2)2 > PhTz-(COOH)2. Отмечается сильное негативное влияние карбоксильных групп на электрополимеризацию PhTz-(COOH)2. Электрохимическое изучение двухкомпонентных систем «производное фенотиазина: макроцикл» позволило выявить позитивный вклад двух макроциклов на кинетические характеристики электродной реакции PhTz (карбоксильный тиакаликс[4]арен в конфигурации 1,3-альтернат и аммониевый тиакаликс[4]арен в конфигурации конус). Их включение обеспечило наилучшие характеристики проницаемости для низкомолекулярных соединений. Синтезированные материалы демонстрировали значительное изменение сопротивления переноса заряда в спектроскопии электрохимического импеданса после иммобилизации ДНК путем физической адсорбции. Это было использовано при конструировании ДНК-сенсора для количественного определения противоракового препарата доксорубицина в диапазоне концентраций от 0.003 нМ до 1 нМ.

 

Публикации

1. - Ученые КФУ создают новое поколение материалов для биосенсоров Сайт Казанского федерального университета kpfu.ru, Дата публикации: 01.11.2020 (год публикации - ).

2. Кузин Ю.И., Хадиева А.И., Падня П.Л., Ханнанов А.А., Кутырева М.П., Стойков И.И., Евтюгин Г.А. Electrochemistry of new derivatives of phenothiazine: Electrode kinetics and electropolymerization conditions Electrochimica Acta, 375,137985 (год публикации - 2021).

3. Падня П.Л., Терентьева О.С., Ахмедов А.А., Иксанова А.Г., Штырлин Н.В., Никитина Е.В., Крылова Е.С., Штырлин Ю.Г., Стойков И.И. Thiacalixarene based quaternary ammonium salts as promising antibacterial agents Bioorganic & Medicinal Chemistry, 29, 115905 (год публикации - 2021).

4. Падня П.Л., Шибаева К.С., Арсеньев М.В., Барышникова С.В., Терентьева О.С., Шиабиев И.Е., Ханнанов А.А., Болдырев А.Е., Герасимов А.В., Гришаев Д.Ю., Штырлин Ю.Г., Стойков И.И. Catechol-Containing Schiff Bases on Thiacalixarene: Synthesis, Copper (II) Recognition, and Formation of Organic-Inorganic Copper-Based Materials Molecules, 26(8), 2334 (год публикации - 2021).