Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Модификация антимикробных препаратов является актуальной задачей, поскольку существует проблема роста резистентности микроорганизмов и появления escape-патогенов. Проект направлен на улучшение фармакологических характеристик полимиксинов В и Е с использованием полимерных наноносителей на основе хитозана и полиаминокислот. На этапе 2019 года разработана методика синтеза водорастворимого катионного катионного производного хитозана – диэтиламиноэтил-хитозана (ДЭАЭХ) с различными степенями замещения. ДЭАЭХ использовали для получения полиэлектролитных комплексов с гиалуроновой кислотой (ГК). Условия формирования полиэлектролитых комплексов (соотношение компонентов и порядок их смешения) изучали методами статического, динамического и электрофоретического рассеяния света. Была разработана методика для получения полиэлектролитых комплексов ДЭАЭХ и ГК, которые имели гидродинамический диаметр около 200 нм и дзета-потенциал -30 мВ. Разработана методика получения сферических наночастиц на основе сукцинил-хитозана (СХ) методом бескапиллярного электроспрея с размером 250-500 нм и дзета-потенциалом -30 мВ. Получены загруженные полимиксином Е наночастицы СХ с размером 300-800 нм и дзета-потенциалом от -13 до +16 мВ в зависимости от степени замещения СХ. Метод элекстроспрея позволил получить 100% эффективность загрузки, эффективность инкапсулирования составила 20 мкг/мг. Изучено высвобождение полимиксина Е из наночастиц в изотонический фосфатный буферный раствор (рН 7.4). Профиль высвобождения демонстрирует пролонгированное высвобождение полимиксина Е, за 8 часов высвобождается от 15% до 25 %. Для создания систем доставки полимиксинов синтезирован ряд амфифильных анионных сополимеров на основе глутаминовой/аспарагиновой кислоты и изолейцина/фенилаланина, изучены их характеристики, а также получены и охарактеризованы сферические частицы на их основе. По совокупности физико-химических характеристик полимерных частиц, а также на основе моделирования взаимодействий олигомеров использованных анионных аминокислот с полимиксином Е был выбран наиболее оптимальный состав сополимера для загрузки целевых антибиотиков. Выбранные полимерные носители не обладали цитотоксическим эффектом для клеток печени, почек и легких человека. Сравнение данных по загрузке полимиксинов В и Е показало, что в случае полимиксина В достигалась более высокая загрузка, чем в случае полимиксина Е. В то же время, скорость высвобождения полимиксина Е была существенно выше, чем скорость высвобождения полимиксина В. Присутствие полианиона (сывороточный альбумин человека) в среде способствовало более интенсивному высвобождению антибиотиков вследствие конкурентных ионных взаимодействий. В экспериментах с бактериальным штаммом Pseudomonas aeruginosa полученные прототипы лекарственных форм характеризовались в два раза более низкими минимальными ингибирующими концентрациями, чем свободные антибиотики. При этом незагруженные полимерные частицы не оказывали ингибирующего действия на P. Aeruginosa.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В настоящее время наблюдается рост резистентности грамотрицательных микроорганизмов к антибактериальной терапии, в том числе и к антимикробным средствам последний поколений. В связи с этим такие резервные антибиотики как полимиксины, которые обладают высокой устойчивостью к микробной резистентности, начинают активно использоваться в практической медицине. Однако необходимость использования высоких доз и высокая нефро- и нейротоксичность ограничивают применение полимиксинов у различных категорий пациентов, включая детей. Поэтому разработка систем доставки полимиксинов с целевой доставкой и сниженной токсичностью является актуальной научной задачей. Данный проект направлен на улучшение фармакологических характеристик полимиксинов В и Е с использованием полимерных наноносителей на основе хитозана и полиаминокислот. На этапе 2020 года разработана методика получения наночастиц в форме полиэлектролитных комплексов (ПЭК) на основе гиалуроновой кислоты и водорастворимого катионного производного хитозана – диэтиламиноэтил-хитозана (ДЭАЭХ). Условия формирования ПЭК (степени замещения ДЭАЭХ, соотношение компонентов и порядок их смешения) изучали методами динамического и электрофоретического рассеяния света, а также изотермической титрационной калориметрии и диффузионной спектроскопии ЯМР. Полученные наночастицы имеют гидродинамический диаметр 210-240 нм и дзета-потенциал -19 мВ, эффективность инкапсуляции 100% и эффективность загрузки составляет 17-20%. ПЭК стабильны в водном растворе и разрушаются в условиях солевого фосфатного буферного раствора (рН 7.4). При этом высвобождение колистина составляет 30-45% за 15 мин и 80-90% в течение 1 часа. Таким образом, разработанные частицы при поступление в систему кровообращения во-первых, имеют возможность связываться с иммунокомпетентными клетками за счет сродства гиалуроновой кислоты к CD44 рецепторам лейкоцитов и макрофагов, а во-вторых, достаточно быстро высвобождать колистин в очаге инфекции. Все минимальные ингибирующие концентрации разработанных систем в отношении Pseudomonas aeruginosa составляют 1 мкг/мл, что указывает на сохранение активности антибиотика, несмотря на инкапсуляцию в различные типы наночастиц, при этом инкапсулированный колистин остается активным, и высвобождается достаточно быстро, чтобы поддерживать ингибирование микробного роста в течении как минимум 24 ч. Разработана методика синтеза конъюгатов колистина с анионными производными хитозана (сукцинил-хитозан, глутарил-хитозан), а также с гиалуроновой кислотой методом карбодиимидной активации. Степень клнъюгирования колистина составляет 2-5 % (по данным 1H ЯМР спектроскопии). Разработанные системы доставки обеспечивают пролонгированное высвобождение колистина на уровне 2-4% в сутки. Разработан метод получения и изучены характеристики гибридных наночастиц по типу «ядро-оболочка», состоящих из наночастиц серебра (ядро) и поли(глутаминовой кислоты) (оболочка). Сравнение данных по загрузке полимиксинов В и Е показало, что в случае полимиксина Е достигалась более высокая загрузка, чем в случае полимиксина В. Установлены оптимальные количества загружаемого антибиотика, не влияющие на увеличение размера гибридных частиц. В экспериментах с культурами клеток печени и почек, а также макрофагами изучена цитотоксичность полученных частиц и скорость захвата макрофагами. Показано, что полученные частицы не были токсичны для клеток печени в тестируемом диапазоне концентраций, но проявляли токсический эффект для клеток почек человека. Полученные системы демонстрировали умеренную скорость захвата макрофагами. В отличие от разработанных ранее незагруженных полимерных частиц на основе сополимера глутаминовой кислоты и фенилаланина, гибридные частицы оказывали собственное ингибирующее действие на P. Aeruginosa. Разработанные прототипы лекарственных форм на основе гибридных частиц характеризовались более низкими минимальными ингибирующими концентрациями, чем полученные ранее системы на основе полимерных частиц. Таким образом полученные системы обладали комбинированными антибактериальными свойствами.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В настоящее время наблюдается рост резистентности грамотрицательных микроорганизмов к антибактериальной терапии, в том числе и к антимикробным средствам последний поколений. В связи с этим такие резервные антибиотики как полимиксины, которые обладают высокой устойчивостью к микробной резистентности, начинают активно использоваться в практической медицине. Однако необходимость использования высоких доз и высокая нефро- и нейротоксичность ограничивают применение полимиксинов у различных категорий пациентов, включая детей. Поэтому разработка систем доставки полимиксинов с целевой доставкой и сниженной токсичностью является актуальной научной задачей. Данный проект направлен на улучшение фармакологических характеристик полимиксинов В и Е с использованием полимерных наноносителей на основе полисахаридов и полиаминокислот. На этапе 2021 года разработана методика синтеза конъюгатов колистина (полимиксина E) с сукцинил-хитозаном и гиалуроновой кислотой методом карбодиимидной активации. Степень замещения колистина в полученных конъюгатах составила 3-10 % (по данным 1H ЯМР спектроскопии). Полученные конъюгаты имеют гидродинамический диаметр 100-500 нм и дзета-потенциал от -19 до -28 мВ, эффективность конъюгирования составила 90-99%, содержание колистина в конъюгатах 130-377 мкг/мг. При этом колистин практически не высвободождался из полимерных конъюгатов (1-5% за 24 ч), сохраняя при конъюгировании с полимером антимикробную активность в отношении Pseudomonas Aeruginosa на уровне чистого колистина при высоких степенях замещения. Разработана методика модификации цианокобаламином (витамин B12) конъюгатов колистина на основе гиалуроновой кислоты для улучшения кишечной проницаемости. Полученные конъюгаты (содержание колистина 335 мкг/мг) содержали в своем составе около 9,5% цианокобаламина, их гидродинамический диаметр составил 600 нм, а ζ-потенциал -30 мВ. Разработанные системы доставки были устойчивы к гидролизу при различных рН, сохраняли антимикробную активность и имели коэффициент кишечной проницаемости in vitro на клеточной модели Caco-2 3,2×10-6, что потенциально обеспечивает высокую абсорбцию в кишечнике на уровне 90%. Оптимизирован метод получения гибридных наночастиц, состоящих из наночастиц серебра, покрытых поли(глутаминовой кислотой), со средним гидродинамическим диаметром до 100 нм. С использованием гибридных наночастиц, загруженных полимиксином В/Е, разработан метод получения композиционных материалов на основе природного нейтрального полисахарида для наружной антибактериальной терапии с пролонгированным высвобождением полимиксинов. Изучение высвобождения полимиксинов из композиционных систем подтвердило меньшую скорость высвобождения по сравнению с контрольными системами, полученными на основе тех же гидрогелей, но заполненных свободным антибиотиком. Как гибридные, так и композиционные материалы демонстрировали угнетение роста P. Aeruginosa, эффективность которого зависела от скорости высвобождения антибиотика. Получены новые ковалентные конъюгаты полимиксина В с двумя синтетическими полимерами, а именно, с анионным амфифильным полипептидом и нейтральным гликополимером. В первом случае, конъюгаты представляли наночастицы размером 330 нм, тогда как во втором случае они были водорастворимыми. Содержание конъюгированного полимиксина составляло 220-250 мкг/мг. В дальнейшем планируется оптимизация количества конъюгируемого антибиотика и апробация полученных конъюгатов на P. aeruginosa.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На этапе 2022 года методом карбодиимидной активации были синтезированы цианокобаламин-содержащие производные хитозана (B12-CS), содержание цианокобаламина в полученных конъюгатах составило 15-30%, при этом эффективность конъюгирования была около 90%. Получены полиэлектролитные PMX E-содержащие комплексы на основе B12-CS с гиалуронаном или каррагинаном. Эффективность лекарственной загрузки составила от 167 мкг/мг до 44 мкг/мг (для поликомплексов с гиалуроновой кислотой) и от 167 мкг/мг до 35 мкг/мг (для поликомплексов с каррагинаном). Тестирование антимикробной активности in vitro против P. aeruginosa показало, что минимальные ингибирующие концентрации (МИК) колистина (PMX E) инкапсулированного в полиэлектролитные комплексы B12-CS как с гиалуронаном, так и каррагинаном составили 2 мкг/мл (МИК чистого PMX E составил 1 мкг/мл), что свидетельствует о сохранении антимикробной активности. Изучена кишечная проницаемость полученных систем для пероральной доставки PMX E на клеточных линиях Caco-2 в опытах in vitro. Коэффициент кишечной проницаемости чистого PMX E составил менее 1x10-7, что характеризует его абсорбцию при пероральном применении как очень низкую (менее 1%). Однако инкапсулирование в полиэлектролитные комплексы на основе B12-CS с гиалуроновой кислотой или каррагинаном усиливает способность PMX E всасываться в желудочно-кишечном тракте (коэффициент кишечной проницаемости для PMX E, инкапсулированного в гиалуронан-содержащие наночастицы составил 2,5x10-6, каррагинан-содержание – 1,6x10-5). Считается, что соединения с коэффициентами кишечной проницаемости in vitro на клеточной модели Caco-2 от 1x10-6 до 1x10-5 обладают высокой кишечной проницаемостью (выше 90%) in vivo и могут быть использованы для потенциальной пероральной доставки лекарственных субстанций. Поэтому дальнейшее изучение полиэлектролитных комплексов PMX E с различными полимерами, содержащими сульфо-группу может помочь существенно продвинуться в решении проблемы низкой кишечной проницаемости PMX E. Получена серия новых полимерных конъюгатов полимиксина В (PMX B) с тремя карбоксилатсодержащих полимера и один синтетический гликополимер, а именно: поли(,L-глутаминовая кислота) (PGlu), сополимер L-глутаминовой кислоты и L-фенилаланина (P(Glu-co-Phe)), сополимер N-винилсукцинаминовой кислоты и N-винилсукцинимида (P(VSAA-co-VSI)) и поли(2-дезокси-2-метакриламидо-D-глюкоза) (PMAG). В отличие от PGlu и PMAG, P(Glu-co-Phe) и P(VSAA-co-VSI) являются амфифильными и образуют наночастицы в водной среде. Был синтезирован и охарактеризован ряд конъюгатов с различной загрузкой PMX В. Кроме того, были получены комплексные конъюгаты PGLu или PMAG с PMX B и дефероксамином (сидерофором). Наконец, была определена и сравнена антимикробная эффективность конъюгатов против P. aeruginosa. Самые низкие значения МИК наблюдались для PMX В и PMX В/дефероксамина, конъюгированных с ПМАГ. Среди протестированных полимеров ПМАГ представляется наиболее перспективным носителем для доставки PMX B в конъюгированной форме благодаря хорошему сохранению антимикробных свойств PMX B и способности контролируемого высвобождения препарата.