КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-73-20157

НазваниеРазработка систем доставки полимиксинов для лечения синегнойной инфекции с мультирезистентной устойчивостью

РуководительСкорик Юрий Андреевич, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук, г Санкт-Петербург

Годы выполнения при поддержке РНФ 2019 - 2022 

КонкурсКонкурс 2019 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Объект инфраструктуры Центр доклинических и трансляционных исследований ФГБУ "НМИЦ им. В.А. Алмазова" Минздрава России

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-103 - Синтез, строение и свойства природных и физиологически активных веществ; медицинская химия и прогнозирование различных видов биоактивности

Ключевые словасистемы доставки лекарств, антибиотики, полимиксины, хитозан, полиаминокислоты, самоорганизующиеся полимерные системы, конъюгаты, полимерные наночастицы, Pseudomonas aeruginosa

Код ГРНТИ34.57.21


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Полимиксины представляют собой крайне эффективную группу антибиотиков пептидной природы, обладающую чрезвычайно высокой активностью, особенно в отношении грамотрицательных микроорганизмов. В клинической практике полимиксины являются крайним средством в борьбе с обладающими резистентностью ко многим антибиотикам штаммам Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumonia. Cущественным недостаткoм данной группы антибактериальных препаратов является их низкая стабильность к ферментативной деградации, что сопровождается необходимостью использовать повышенные дозы препарата для достижения терапевтического эффекта. Это в свою очередь приводит к побочным действиям в виде нейро- и нефротоксичности. Эти недостатки значительно суживают возможности применения высокоэффективного (а иногда и единственного способного сохранить жизнь пациента) антибиотика, особенно в педиатрической практике, у пациентов с патологией печени и почек, заболеваниями центральной нервной системы и у пациентов пожилого возраста. В связи с этим, защита антибиотика от преждевременной инактивации и выведения из организма до момента его действия на фармакологическую мишень, а также повышение адресности действия препарата, представляют собой актуальную задачу. В литературе имеются единичные работы по созданию систем доставки полимиксинов, а работы направленные на решение задачи по повышению адресности действия данных препаратов отсутствуют вовсе. Среди биосовместимых природных полимеров наиболее удачно себя зарекомендовали различные производные хитозана, обладающего идеальными свойствами для создания платформ для адресной доставки и снижения токсичности лекарств. Также огромные возможности для создания систем доставки гидрофильных молекул открывают амфифильные сополимеры аминокислот. Для создания систем доставки могут оказаться полезными подходы, основанные как на конъюгирование антибиотика с полимером, так и на его инкапсулировании в наночастицу. Модификация конъюгатов и/или наночастиц специфическими лигандами позволит обеспечить адресную доставку лекарства. В рамках данного проекта планируется создание первых полимерных платформ на основе хитозана (конъюгатов или наночастиц), а также амфифильных сополимеров аминокислот, способных обеспечивать адресную доставку полимиксинов. Решение данной задачи обеспечит значительное уменьшение необходимой для терапии дозы антибиотика, увеличит его биодоступность, минимизирует его токсичность и нежелательные эффекты и позволит создать прототипы лекарственных форм, применение которых возможно и безопасно. Поставленная в данном проекте задача является безусловно актуальной имеет большой потенциал к дальнейшему развитию в области терапии инфекций. Предлагаемые методы и подходы в области биополимерных систем, а также фармацевтической химии и исследования биологических свойств не уступают мировому уровню, а по ряду позиций опережают существующие подходы. Научная значимость проекта заключается в разработке фундаментальных основ создания наносистем-носителей пептидных лекарственных субстанций с использованием сополимеров аминокислот и полисахаридов, а также в выявлении основных закономерностей состав и структура наносистемы - ее свойства. К числу актуальных фундаментальных задач в области создания систем доставки пептидных лекарств относятся разработка методов получения полимерных наносистем с контролируемым размером и структурой, изучение закономерностей инкапсулирования целевого вещества, разработка методов химического коньюгирования пептидных молекул с полимерами-носителями, а также установление механизмов высвобождения лекарства. Результаты, полученные при решении этих задач на примере полимиксинов, позволят расширить методологию создания систем доставки и использовать полученные знания для разработки эффективных терапевтических форм других лекарств пептидной природы.

Ожидаемые результаты
В ходе реализации проекта будут: • Получены различные водорастворимые конъюгаты хитозана с полимиксинами, в которых хитозан привит к антибиотику посредством рН-чувствительного линкера, что обеспечит высвобождение лекарства в кислой среде (по сравнению с физиологической) в очаге инфекции. В качестве таких линкеров будут использованы ацетилгидразоновый, ацетальный, силиловый, цис-аконитиловый, β-тиопропионатный, тиомалеимидный и имидазольный спейсеры. • Получены наночастицы на основе производных хитозана и амфифильных сополимеров аминокислот, в качестве наноконтейнеров, загруженных свободным антибиотиком и антибиотиком, конъюгированым посредством рН-чувствительного линкера со специфическими высокоафинными к микробной клетке лигандами. Это позволит обеспечить защиту лекарственной субстанции от метаболической деградации и выведения из организма до того, пока он не достигнет фармакологической мишени. • Получены модифицированные специфическими лигандами полимерные наночастицы, содержащие полимиксин, и конъюгаты полимиксин-полимер, обеспечивающие доставку лекарственной наноплатформы к фармакологической мишени, т.е. микробной клетке. • Получен полный спектр характеристик разработанных систем доставки, а также данные о кинетике высвобождения полимиксинов in vitro, токсичности полученных конъюгатов и наночастиц и противомикробной активности в отношении Pseudomonas aeruginosa in vitro и in vivo. На основе проведенных биологических испытаний будут выбраны лидирующие системы-прототипы для дальнейших исследований в области создания лекарственной формы.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Модификация антимикробных препаратов является актуальной задачей, поскольку существует проблема роста резистентности микроорганизмов и появления escape-патогенов. Проект направлен на улучшение фармакологических характеристик полимиксинов В и Е с использованием полимерных наноносителей на основе хитозана и полиаминокислот. На этапе 2019 года разработана методика синтеза водорастворимого катионного катионного производного хитозана – диэтиламиноэтил-хитозана (ДЭАЭХ) с различными степенями замещения. ДЭАЭХ использовали для получения полиэлектролитных комплексов с гиалуроновой кислотой (ГК). Условия формирования полиэлектролитых комплексов (соотношение компонентов и порядок их смешения) изучали методами статического, динамического и электрофоретического рассеяния света. Была разработана методика для получения полиэлектролитых комплексов ДЭАЭХ и ГК, которые имели гидродинамический диаметр около 200 нм и дзета-потенциал -30 мВ. Разработана методика получения сферических наночастиц на основе сукцинил-хитозана (СХ) методом бескапиллярного электроспрея с размером 250-500 нм и дзета-потенциалом -30 мВ. Получены загруженные полимиксином Е наночастицы СХ с размером 300-800 нм и дзета-потенциалом от -13 до +16 мВ в зависимости от степени замещения СХ. Метод элекстроспрея позволил получить 100% эффективность загрузки, эффективность инкапсулирования составила 20 мкг/мг. Изучено высвобождение полимиксина Е из наночастиц в изотонический фосфатный буферный раствор (рН 7.4). Профиль высвобождения демонстрирует пролонгированное высвобождение полимиксина Е, за 8 часов высвобождается от 15% до 25 %. Для создания систем доставки полимиксинов синтезирован ряд амфифильных анионных сополимеров на основе глутаминовой/аспарагиновой кислоты и изолейцина/фенилаланина, изучены их характеристики, а также получены и охарактеризованы сферические частицы на их основе. По совокупности физико-химических характеристик полимерных частиц, а также на основе моделирования взаимодействий олигомеров использованных анионных аминокислот с полимиксином Е был выбран наиболее оптимальный состав сополимера для загрузки целевых антибиотиков. Выбранные полимерные носители не обладали цитотоксическим эффектом для клеток печени, почек и легких человека. Сравнение данных по загрузке полимиксинов В и Е показало, что в случае полимиксина В достигалась более высокая загрузка, чем в случае полимиксина Е. В то же время, скорость высвобождения полимиксина Е была существенно выше, чем скорость высвобождения полимиксина В. Присутствие полианиона (сывороточный альбумин человека) в среде способствовало более интенсивному высвобождению антибиотиков вследствие конкурентных ионных взаимодействий. В экспериментах с бактериальным штаммом Pseudomonas aeruginosa полученные прототипы лекарственных форм характеризовались в два раза более низкими минимальными ингибирующими концентрациями, чем свободные антибиотики. При этом незагруженные полимерные частицы не оказывали ингибирующего действия на P. Aeruginosa.

 

Публикации

1. Дубашинская Н.В., Гасилова Е.Р., Раик С.В., Скорик Ю.А. Hyaluronan/diethylaminoethyl-chitosan polyelectrolyte complexes for delivery of hydrophilic drugs Proceedings of the 15th International Conference on Polysaccharides-Glycoscience, P. 70-72 (год публикации - 2019).

2. Зашихина Н.Н., Юдин Д.В., Тарасенко И.И., Осипова О.М., Коржикова-Влах Е.Г. Multilayered Particles Based on Biopolyelectrolytes as Potential Peptide Delivery Systems Polymer Science, Series A, Vol. 62, No. 1, pp. 43–53. (год публикации - 2020).

3. Коржикова-Влах Е.Г., Осипова О.М., Юдин Д.В., Зашихина Н.Н., Тарасенко И.И. Nanoparticles based on amphiphilic copolymers of amino acids for delivery of biologically active peptides XXI Mendeleev congress on general and applied chemistry. Book of abstracts in 6 volumes., V. 5, P. 167 (год публикации - 2019).

4. Раик С.В., Гасилова Е.Р., Дубашинская Н.В., Добродумов А.В., Скорик Ю.А. Diethylaminoethyl chitosan–hyaluronic acid polyelectrolyte complexes International Journal of Biological Macromolecules, - (год публикации - 2020).

5. Раик С.В., Дубашинская Н.В., Гасилова Е.Р., Скорик Ю.А. Polyelectrolyte complexes based on hyaluronic acid and diethylaminoethyl-chitosan as potential hydrophilic drug delivery carrier Program and Abstract Book of 15th International Saint Petersburg Conference of Young Scientists, P. 198 (год публикации - 2019).

6. Юдин Д.В., Осипова О.М., Коржикова-Влах Е.Г. Наночастицы на основе полиаминокислот в качестве систем доставки полимиксинов Сборник тезисов Международного конгресса молодых ученых в фармации «Drug Research», С.35 (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В настоящее время наблюдается рост резистентности грамотрицательных микроорганизмов к антибактериальной терапии, в том числе и к антимикробным средствам последний поколений. В связи с этим такие резервные антибиотики как полимиксины, которые обладают высокой устойчивостью к микробной резистентности, начинают активно использоваться в практической медицине. Однако необходимость использования высоких доз и высокая нефро- и нейротоксичность ограничивают применение полимиксинов у различных категорий пациентов, включая детей. Поэтому разработка систем доставки полимиксинов с целевой доставкой и сниженной токсичностью является актуальной научной задачей. Данный проект направлен на улучшение фармакологических характеристик полимиксинов В и Е с использованием полимерных наноносителей на основе хитозана и полиаминокислот. На этапе 2020 года разработана методика получения наночастиц в форме полиэлектролитных комплексов (ПЭК) на основе гиалуроновой кислоты и водорастворимого катионного производного хитозана – диэтиламиноэтил-хитозана (ДЭАЭХ). Условия формирования ПЭК (степени замещения ДЭАЭХ, соотношение компонентов и порядок их смешения) изучали методами динамического и электрофоретического рассеяния света, а также изотермической титрационной калориметрии и диффузионной спектроскопии ЯМР. Полученные наночастицы имеют гидродинамический диаметр 210-240 нм и дзета-потенциал -19 мВ, эффективность инкапсуляции 100% и эффективность загрузки составляет 17-20%. ПЭК стабильны в водном растворе и разрушаются в условиях солевого фосфатного буферного раствора (рН 7.4). При этом высвобождение колистина составляет 30-45% за 15 мин и 80-90% в течение 1 часа. Таким образом, разработанные частицы при поступление в систему кровообращения во-первых, имеют возможность связываться с иммунокомпетентными клетками за счет сродства гиалуроновой кислоты к CD44 рецепторам лейкоцитов и макрофагов, а во-вторых, достаточно быстро высвобождать колистин в очаге инфекции. Все минимальные ингибирующие концентрации разработанных систем в отношении Pseudomonas aeruginosa составляют 1 мкг/мл, что указывает на сохранение активности антибиотика, несмотря на инкапсуляцию в различные типы наночастиц, при этом инкапсулированный колистин остается активным, и высвобождается достаточно быстро, чтобы поддерживать ингибирование микробного роста в течении как минимум 24 ч. Разработана методика синтеза конъюгатов колистина с анионными производными хитозана (сукцинил-хитозан, глутарил-хитозан), а также с гиалуроновой кислотой методом карбодиимидной активации. Степень клнъюгирования колистина составляет 2-5 % (по данным 1H ЯМР спектроскопии). Разработанные системы доставки обеспечивают пролонгированное высвобождение колистина на уровне 2-4% в сутки. Разработан метод получения и изучены характеристики гибридных наночастиц по типу «ядро-оболочка», состоящих из наночастиц серебра (ядро) и поли(глутаминовой кислоты) (оболочка). Сравнение данных по загрузке полимиксинов В и Е показало, что в случае полимиксина Е достигалась более высокая загрузка, чем в случае полимиксина В. Установлены оптимальные количества загружаемого антибиотика, не влияющие на увеличение размера гибридных частиц. В экспериментах с культурами клеток печени и почек, а также макрофагами изучена цитотоксичность полученных частиц и скорость захвата макрофагами. Показано, что полученные частицы не были токсичны для клеток печени в тестируемом диапазоне концентраций, но проявляли токсический эффект для клеток почек человека. Полученные системы демонстрировали умеренную скорость захвата макрофагами. В отличие от разработанных ранее незагруженных полимерных частиц на основе сополимера глутаминовой кислоты и фенилаланина, гибридные частицы оказывали собственное ингибирующее действие на P. Aeruginosa. Разработанные прототипы лекарственных форм на основе гибридных частиц характеризовались более низкими минимальными ингибирующими концентрациями, чем полученные ранее системы на основе полимерных частиц. Таким образом полученные системы обладали комбинированными антибактериальными свойствами.

 

Публикации

1. Дубашинская Н.В., Скорик Ю.А. Polymyxin Delivery Systems: Recent Advances and Challenges Pharmaceuticals, V.13(5), Article #83 (год публикации - 2020).

2. Коржикова-Влах Е., Юдин Д., Зашихина Н., Коржиков-Влах В., Тарасенко И., Демьянова Е. Биодеградируемые полимерные системы доставки полимиксинов B и Е Сборник тезисов докладов Шестой Междисциплинарной конференции «Молекулярные и Биологические аспекты Химии, Фармацевтики и Фармакологии», С.183 (год публикации - 2020).

3. Юдин Д., Зашихина Н., Демьянова Е., Коржиков-Влах В., Щербакова Е., Борозняк Р., Захарова Н., Лаврентьева А., Скорик Ю., Коржикова-Влах Е. Polypeptide Self-Assembled Nanoparticles as Delivery Systems for Polymyxins B and E Pharmaceutics, V.12, Article #868 (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В настоящее время наблюдается рост резистентности грамотрицательных микроорганизмов к антибактериальной терапии, в том числе и к антимикробным средствам последний поколений. В связи с этим такие резервные антибиотики как полимиксины, которые обладают высокой устойчивостью к микробной резистентности, начинают активно использоваться в практической медицине. Однако необходимость использования высоких доз и высокая нефро- и нейротоксичность ограничивают применение полимиксинов у различных категорий пациентов, включая детей. Поэтому разработка систем доставки полимиксинов с целевой доставкой и сниженной токсичностью является актуальной научной задачей. Данный проект направлен на улучшение фармакологических характеристик полимиксинов В и Е с использованием полимерных наноносителей на основе полисахаридов и полиаминокислот. На этапе 2021 года разработана методика синтеза конъюгатов колистина (полимиксина E) с сукцинил-хитозаном и гиалуроновой кислотой методом карбодиимидной активации. Степень замещения колистина в полученных конъюгатах составила 3-10 % (по данным 1H ЯМР спектроскопии). Полученные конъюгаты имеют гидродинамический диаметр 100-500 нм и дзета-потенциал от -19 до -28 мВ, эффективность конъюгирования составила 90-99%, содержание колистина в конъюгатах 130-377 мкг/мг. При этом колистин практически не высвободождался из полимерных конъюгатов (1-5% за 24 ч), сохраняя при конъюгировании с полимером антимикробную активность в отношении Pseudomonas Aeruginosa на уровне чистого колистина при высоких степенях замещения. Разработана методика модификации цианокобаламином (витамин B12) конъюгатов колистина на основе гиалуроновой кислоты для улучшения кишечной проницаемости. Полученные конъюгаты (содержание колистина 335 мкг/мг) содержали в своем составе около 9,5% цианокобаламина, их гидродинамический диаметр составил 600 нм, а ζ-потенциал -30 мВ. Разработанные системы доставки были устойчивы к гидролизу при различных рН, сохраняли антимикробную активность и имели коэффициент кишечной проницаемости in vitro на клеточной модели Caco-2 3,2×10-6, что потенциально обеспечивает высокую абсорбцию в кишечнике на уровне 90%. Оптимизирован метод получения гибридных наночастиц, состоящих из наночастиц серебра, покрытых поли(глутаминовой кислотой), со средним гидродинамическим диаметром до 100 нм. С использованием гибридных наночастиц, загруженных полимиксином В/Е, разработан метод получения композиционных материалов на основе природного нейтрального полисахарида для наружной антибактериальной терапии с пролонгированным высвобождением полимиксинов. Изучение высвобождения полимиксинов из композиционных систем подтвердило меньшую скорость высвобождения по сравнению с контрольными системами, полученными на основе тех же гидрогелей, но заполненных свободным антибиотиком. Как гибридные, так и композиционные материалы демонстрировали угнетение роста P. Aeruginosa, эффективность которого зависела от скорости высвобождения антибиотика. Получены новые ковалентные конъюгаты полимиксина В с двумя синтетическими полимерами, а именно, с анионным амфифильным полипептидом и нейтральным гликополимером. В первом случае, конъюгаты представляли наночастицы размером 330 нм, тогда как во втором случае они были водорастворимыми. Содержание конъюгированного полимиксина составляло 220-250 мкг/мг. В дальнейшем планируется оптимизация количества конъюгируемого антибиотика и апробация полученных конъюгатов на P. aeruginosa.

 

Публикации

1. Бокатый А.Н., Дубашинская Н.В., Скорик Ю.А. COLISTIN-POLYSACCHARIDE CONJUGATES Mendeleev 2021. XII International Conference on Chemistry for Young Scientists, С. 702 (год публикации - 2021).

2. Дубашинская Н.В., Бокатый А.Н., Скорик Ю.А. Системы доставки колистина на основе полисахаридов V Всероссийская конференция «Фундаментальная гликобиология», С.73 (год публикации - 2021).

3. Дубашинская Н.В., Бокатый А.Н., Щербакова Е.С., Демьянова Е.В., Скорик Ю.А. Системы адресной доставки колистина на основе хитозана Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана (Росхит-2021), C.16 (год публикации - 2021).

4. Дубашинская Н.В., Раик С.В., Дубровский Я.А., Демьянова Е.В., Щербакова Е.С., Пошина Д.Н., Шашерина А.Ю., Ануфриков Ю.А., Скорик Ю.А. Hyaluronan/diethylaminoethyl chitosan polyelectrolyte complexes as carriers for improved colistin delivery International Journal of Molecular Sciences, V. 22, № 162, Article 8381 (год публикации - 2021).

5. Дубашинская Н.В., Раик С.В., Дубровский Я.А., Щербакова Е.С., Демьянова Е.В., Шашерина А.Ю., Ануфриков Ю.А., Пошина Д.Н., Добродумов А.В., Скорик Ю.А. Hyaluronan/colistin polyelectrolyte complexes: Promising antiinfective drug delivery systems International Journal of Biological Macromolecules, V. 187, P. 157-165 (год публикации - 2021).

6. Дубашинская Н.В., Щербакова Е.С., Дубровский Я.А., Демьянова Е.В., Скорик Ю.А. COLISTIN DELIVERY SYSTEMS BASED ON POLYELECTROLYTE COMPLEXES OF HYALURONIC ACID AND CHITOSAN THE INTERNATIONAL CONFERENCE NEW APPROACHES TO BIOMATERIAL DEVELOPMENT, С.17 (год публикации - 2021).

7. Коржикова-Влах Е., Юдин Д., Щербакова Е., Демьянова Е. ГИБРИДНЫЕ И КОМПОЗИЦИННЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ Сборник тезисов докладов Седьмой Междисциплинарной конференции «Молекулярные и Биологические аспекты Химии, Фармацевтики и Фармакологии», С.96 (год публикации - 2021).

8. Юдин Д.В., Коржикова-Влах Е.Г. HYBRID NANOPARTICLES AND COMPOSITE MATERIALS AS POLYMYXINS DELIVERY SYSTEMS Mendeleev 2021. XII International Conference on Chemistry for Young Scientists, P.726 (год публикации - 2021).