КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 19-74-10009
НазваниеИсследование влияния потенциальных эпигенетических лекарств на компартментализацию хроматина и энхансер-промоторные контакты в нормальных и опухолевых клетках человека
РуководительУльянов Сергей Владимирович, Доктор биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2019 - 06.2022 |
Конкурс№41 - Конкурс 2019 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика
Ключевые словаХроматин, компартменты, энхансер-промоторная коммуникация, разделение фаз, регуляция транскрипции
Код ГРНТИ34.15.00
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
В клетках человека пространственная организация интерфазного хроматина имеет несколько уровней иерархии. В пределах хромосомной территории и ядра в целом активные и репрессированные геномные регионы пространственно сегрегированы в составе А- и В-компартментов. На масштабе порядка нескольких сотен-миллиона пар нуклеотидов, хроматиновая фибрилла образует глобулярные структуры (топологически-ассоциированные домены, ТАДы), включающие один или несколько генных локусов и ограничивающие зоны действия энхансеров. Многие ТАДы формируются посредством образования CTCF/когезин-зависимых петель, возникающих по механизму экструзии. Петли обнаруживаются и внутри ТАДов, где порядка 30% петлевых взаимодействий устанавливаются между регуляторными элементами (в частности, энхансерами и суперэнхансерами) и подконтрольными промоторами. На сегодняшний день механизмы формирования компартментов, а также коммуникации между энхансерами и промоторами во многом остаются неясными. Согласно широко обсуждаемой модели, одной из возможностей может быть формирования макромолекулярных конденсатов посредством разделения фаз в хроматине. В образовании подобных конденсатов могут принимать участие крупные РНК-белковые комплексы, собирающиеся на энхансерах и включающие в свой состав ряд белков с неструктурированными доменами и бромодомен-содержащие белки, в частности семейства ВЕТ. В данном проекте мы планируем обрабатывать нормальные и раковые клетки человека 1,6-гександиолом, который препятствует образованию конденсатов, и BET-ингибитором JQ1, нарушающим работу комплексов, построенных на основе бромодомен-содержащих активаторов транскрипции. В обработанных и контрольных клетках мы планируем анализировать топологию генома на уровне компартментов, топологически-ассоциированных доменов и энхансер-промоторных контактов с использованием процедуры Hi-C. Данные об изменении структуры компартментов на фоне обработки 1,6-гександиолом будут подтверждены с использованием флуоресцентной гибридизации in situ, а эффекты, оказанные на структуру ТАДов и петель, будут соотнесены с полногеномным профилем связывания архитектурного белка CTCF, который мы охарактеризуем методом ChIP-seq. Задачи, поставленные в данном проекте, являются новыми и актуальными для трёхмерной геномики, молекулярной биологии хроматина и в области изучения свойств эпигенетических лекарств. Результаты выполнения данного проекта не только дополнят и расширят наши представления о взаимосвязи топологии генома и регуляции его работы, но окажутся востребованными при создании рациональных стратегий дизайна и испытаний препаратов, чьими мишенями являются хроматин-ассоциированные ферментные системы.
Ожидаемые результаты
В ходе выполнения запланированных в данном проекте экспериментов будут получены следующие конкретные научные результаты:
1. Будет решён вопрос о том, играет ли какую-либо роль процесс разделения фаз в образовании А- и В-компартментов в интерфазном хроматине нормальных и опухолевых клеток человека.
2. Будет выяснено, играет ли роль процесс разделения фаз в формировании петлевых и беспетлевых топологически-ассоциированных доменов в геноме человека.
3. Будет установлено, приводит ли нарушение формирования макромолекулярных конденсатов к изменению полногеномного профиля связывания архитектурного белка хроматина CTCF.
4. Будет получен ответ на вопрос о том, формируется ли регуляторная контактная сеть суперэнхансеров посредством образования макромолекулярных конденсатов, и в частности образующихся на основе комплексов бромодомен-содержащих белков ВЕТ-семейства.
Полученные результаты позволят значительно расширить представления о механизмах установления и поддержания пространственной структуры интерфазного хроматина на уровне компартментов, топологически-ассоциированных доменов и активаторных энхансер-промоторных блоков, и могут быть использованы при построении стратегии дизайна и экспериментальной проверки лекарственных препаратов, нацеленных на модулирование работы регуляторных систем, управляющих транскрипцией и эпигенетическим статусом хроматина.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2019 году
За отчётный период выполнено тестирование условий обработки клеток 1,6-гександиолом (1,6-ГД) – ингибитора формирования молекулярных конденсатов – для исследования роли процесса жидко-жидкостного разделения фаз в установлении и поддержании пространственной структуры интерфазного хроматина. Показано, что при обработке клеток HeLa 5% 1,6-ГД в течение 15 минут не наблюдается выраженной цитотоксичности. При этом происходит разрушение телец Кахаля, уменьшение размеров спеклов и ингибируется образование конденсатов на основе системы OptoDroplet. В указанных условиях так же происходит обратимое подавление транскрипции РНК-полимеразой II, которая практически полностью восстанавливается после отмывки 1,6-ГД и инкубации клеток в среде роста в течение 1.5 часов. Hi-C анализ низкого разрешения с использованием оригинального алгоритма, разработанного участниками коллектива (пентадный анализ), продемонстрировал, что обработка клеток 1,6-ГД не приводит к изменению формы зависимости частоты контактов от геномного расстояния (скейлинг), но значительно отражается на внутренней структуре компартментов. Так, показано, что А- и В-компартменты по-разному отвечают на обработку 1,6-ГД. Общая сила компартмента А возрастает в обработанных клетках и падает ниже контрольного уровня в клетках после отмывки 1,6-ГД. При этом происходит перераспределение контактов с дальних на близкие геномные расстояния. В компартменте В, напротив, падает частота контактов на всех геномных расстояниях, и вырастает значительно выше нормы после удаления 1,6-ГД из среды роста. Таким образом, можно заключить, что (1) процесс разделения фаз играет ограниченную роль в крупномасштабной компартментализации интерфазного хроматина; (2) роль этого процесса различна в установлении внутренней структуры А- и В-компартментов; (3) супрессия разделения фаз необратимо смещает равновесие сил, контролирующих пространственную организацию хромосом, что не позволяет хроматину вернуться к исходной конфигурации после удаления 1,6-ГД из среды.
Публикации
Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Жидкостно-жидкостное разделение фаз вносит вклад в пространственное и функциональное разделение молекулярных процессов в клеточном ядре. Однако, роль разделения фаз в трёхмерной организации хроматина живой клетки исследована не достаточно. А настоящей работе мы использовали микроскопию сверхвысокого разрешения (STORM) и высокопроизводительный протокол фиксации конформации хромосом (Hi-C) для исследования того, как на трёхмерной организации хроматина отражается обработка клеток 1,6-гександиолом – агентом, подавляющим разделение фаз. Мы обнаружили, что обработка клеток 1,6-гександиолом приводит к увеличению размера нуклеосомных конденсатов и их более равномерному распределению в ядерном пространстве. На масштабах несколько миллионов пар нуклеотидов мы обнаружили, что в раковых и нормальных клетках происходят необратимые изменения фолдинга хроматина, выражающиеся в частичном перемешивании компартментов. Интересно, что удаление 1,6-гександиола из среды не позволяло хроматину раковых и нормальных клеток возвращаться в исходное состояние, но приводило к более плотной упаковке гетерохроматина. Также мы обнаружили, что обработка 1,6-гександиолом ослабляет энхансер-промоторные контакты и инсуляционные свойства границ ТАДов, но практически не меняет интенсивности промотор-промоторных и CTCF-зависимых взаимодействий. Наши данные свидетельствуют о том, что жидкостно-жидкостное разделение фаз, чувствительное к 1,6-гександиолу, играет ограниченную роль в фолдинге хроматина, скорее осуществляя «тонкую настройку» профиля контактов, нежели являясь его определяющим фактором.
Публикации
1. Ульянов С.В., Величко А.К., Магнитов М.Д., Лужин А.В., Голов А.К., Овсянникова Н., Киреев И.И., Гавриков А.С., Мишин А.С., Гараев А.К., Тяхт А.В., Гаврилова А.А., Кантидзе О.Л., Разин С.В. Suppression of liquid-liquid phase separation by 1,6-hexanediol partially compromises the 3D genome organization in living cells Nucleic Acids Research, 1 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1093/nar/gkab249
2. Величко А.К., Разин С.В., Кантидзе О.Л. КЛЕТОЧНЫЙ ОТВЕТ НА ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК, ВОЗНИКАЮЩИЕ В РИБОСОМНЫХ ГЕНАХ Молекулярная биология, том 55, № 2, с. 210–222 (год публикации - 2021)
3. Ковина А.П., Петрова Н.В., Разин С.В., Кантидзе О.Л. L-Ascorbic Acid in the Epigenetic Regulation of Cancer Development and Stem Cell Reprogramming ACTA NATURAE, том 12, номер 4 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.32607/actanaturae.11060
4. Разин С.В., Ульянов С.В. Divide and Rule: Phase Separation in Eukaryotic Genome Functioning Cells, том 9, № 11 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/cells9112480
5. - Принцип «масла в воде» помог сохранить трехмерную структуру ДНК Газета.ru, статья в онлайн издании (год публикации - )
Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За отчётный период по результатам анализа частоты апоптоза, доли интерфазных клеток и состояния актинового цитоскелета клеток HeLa были выбраны рабочие концентрации латранкулина (ингибирует формирование микрофиламентов цитоскелета путем связывания с мономерным актином в соотношении 1:1 и блокирования его полимеризации), СК666 (ингибирует полимеризацию актиновых филаментов путем блокирования конформационных изменений комплекса Arp2/3), 2,3-Butanedione monoxime (BDM; ингибитор АТФ-азной активности миозина), а также была определена рабочая концентрация ингибитора BET-семейства бромодомен-содержащих белков JQ1 (на основании иммуноокрашивания BRD4). Из клеток HeLa, обработанных данными вещестками, были получены и секвенированы Hi-C библиотеки. Кроме того, был усовершенствован и протестирован на панели опубликованных Hi-C данных пентадный алгоритм для анализа структуры хроматиновых компартментов.
Публикации
1. Магнитов М.Д., Гараев А.К., Тяхт А.В., Ульянов С.В., Разин С.В. Pentad: a tool for distance‑dependent analysis of Hi‑C interactions within and between chromatin compartments. BMC Bioinformatics, 23, 1 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1186/s12859-022-04654-6
2. Разин С.В., Ульянов С.В. Genome-Directed Cell Nucleus Assembly Biology, 11(5) (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/biology11050708
3. - Принцип «масла в воде» помог сохранить трехмерную структуру ДНК Газета.ru, - (год публикации - )
Возможность практического использования результатов
Полученные данные могут быть использованы при рациональном дизайне лекарственных средств, влияющих на пространственную организацию генома.