Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В отчётный период времени выполнен анализ транскриптомов ядовитой железы двух видов рода Profundiconus. Profundiconus - наиболее базальный таксон семейства Conidae, и его уникальное филогенетическое положение (в качестве сестринской группы остальных Conidae) делает его ключевым таксоном для изучения эволюции яда конусов. Однако, из-за того, что моллюски этого рода имеют узкий ареал распространения, встречаясь в глубоководных экосистемах района Новой Каледонии, сбор проб для анализа транскриптома стал возможет только недавно. В ходе выполнения проекта были получены первые данные о составе яда двух видов этой группы моллюсков. Транскриптомы тканей ядовитой железы и ноги были реконструированы, и аннотированы de novo для Profundiconus voubani и Profundiconus neocaledonicus. У первого вида обнаружили 137 компонентов яда, а у второго их нашли 82. При этом только четыре выявленных токсина присутствуют в яде обоих видов в идентичных копиях. Среди белковых продуктов с избирательной экспрессией в ядовитой железе, выявлены конотоксины, профундитоксины, туррипептиды, инсулин, и прогормон-4. Подавляющее большинство выявленных конотоксинов представляют ранее известные надсемейства генов, однако три выявленных кластера транскриптов сильно отличаются от тех, что были изучены до этого. При этом общее структурное сходство с токсинами у этих продуктов сохраняется, и поэтому они выделены в новые надсемейства. В целом, невысокое разнообразие выявленных токсинов в яде Profundiconus и тип выявленного инсулина позволяют предположить, что оба исследованных вида, для которых нет экологической информации, питаются полихетами или родственными им червеобразными беспозвоночными, и относительно специфичны в отношении пищевых объектов. Наши результаты показывают, что яд Profundiconus значительно отличается от такового у моллюков рода Conus, но при этом содержит ряд известных надсемейств конотоксинов. На основании этих результатов мы заключаем, что токсины подсемейств I1, I2, M, O1, P, широко распространённые в яде моллюсков рода Conus появились ещё у общего предка Conidae. Возникновение в эволюции элегантного механизма отравления жертвы, используемого моллюсками рода Conus, потребовал сложных морфологических и поведенческих адаптаций на ранних этапах диверсификации Conoidea. Замечательны в этом контексте полые зубы радулы конусов и родственных таксонов Conoidea, напоминающие одновременно гарпун или иглу шприца, служащие для впрыскивания яда в ткани жертвы. При этом ряд групп современных коноидей не имеют этой эволюционно-продвинутой черты, что позволяет предположить, что они используют иной механизм введения секрета ядовитой железы в ткани жертвы, более близкий к механизму отравления, используемого предками коноидей. Моллюски рода Clavus (семейство Drilliidae) являются дальними родственниками конусов в надсемействе Conoidea, и обладают необычной радулой с совершенно плоскими маргинальными зубами. Исследование состава яда Clavus, в этом контексте крайне важно для понимания состава яда предка Conoidea и процессов биохимической эволюции Conoidea, которые соответствовали известным морфологическим перестройкам в надсемействе. Мы выполнили анализ транскриптома ядовитой железы двух видов комплекса Clavus canalicularis, каждый был представлен двумя образцами. В результате проведённого исследования, впервые получены данные о составе ядов моллюсков семейства Drilliidae. Даже не смотря на очень строгие критерии отсечения возможных артефактов реконструкции транскриптома, выявлено 1178 транскриптов, предположительно связанных с функциями яда. Часть из них продемонстрировали структурное сходство с конотоксинами, и были предварительно аннотированных как токсины («дрилипептиды»). На основании полученных оригинальных данных о структуре предсказанных транскриптов, их сходства между собой и с известными классами белковых токсинов, транскрипты ядовитой железы Clavus были отнесены к 158 различным надсемействам генов. Среди аннотированных транскриптов обнаружены аналоги инсулинов яда Conus (Drillinsulins), порины (Drilliporins), высоко диверсифицированные лектины (Drillilectins) и семейства с отдаленным сходством последовательности с надсемействами конотоксинов A, F, I3, M, O1, O2 и U. Примечательно, что в транскриптоме ядовитой железы Clavus преобладают относительно короткие токсины, зачастую, содержащие несколько остатков цистеина – т.е. структурные аналоги конотоксинов. Этот результат является неожиданным, учитывая, что филогенетически близкие семейства Turridae, Terebridae, и Pseudomelatomidae обладают значительно более длинными зрелыми токсинами. Этот факт особенно важен для возможного практического применения дриллипептидов: короткая аминокислотная последовательность зрелого токсина (сходная по длине с конотоксинами) существенно упрощает его химический синтез, делая дриллипептиды привлекательными для фармакологических исследований. Примечательно также, что яд Clavus отличается высоким разнообразием и уровнем экспрессии рамнозо-связывающих лектинов и поринов. Лектины и порины связываются с компонентами клеточных мембран, и вызывают их лизис. Высокое разнообразие и уровни экспрессии обоих этих классов белков в яде Clavus, говорят об их функциональной значимости при отравлении жертвы. Радула Clavus не может использоваться для введения яда в тело жертвы, как радула Conus, просто в силу другой, значительно более простой морфологии зубов. Однако, основываясь на анатомических исследованиях, Drilliidae используют маргинальные зубы аналогичным образом, удерживая зуб на конце хобота, предположительно, для разрыва кутикулы жертвы. Через раны яд может проникнуть в тело жертвы, но, чтобы вызвать сколь-либо серьезный физиологический эффект, он должен попасть в циркуляторную систему и распространяться ей. Это может обеспечиваться массивными повреждениями эпителия, действием цитолитических компонентов яда, таких как лектины и порины. Этот результат может стать первой выявленной биохимической адаптацией, функционально компенсирующей отсутствие эффективного аппарата для доставки яда у Conoidea не имеющих полых зубов радулы. Более того, наши результаты подтверждают, что инсулины, лектины и два надсемейства генов поринов уже присутствовали у общего предка Conus и Clavus, то есть у самых ранних коноидей.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Морские брюхоногие моллюски из рода Conus известны своим ограмным разнообразием и смертоносными ядами. В то время как яды рода Conus интенсивно изучаются с точки зрения их биомедицинских применений, имеющиеся данные о составе ядов других представителей семейства Conidae, “дивергентных конид”, остаются очень отрывочными. Это значительно усложняет как анализ яда Conidae в эволюционном контексте, так и разработку оптимальной стратегии исследования биологически-активных компонентов яда конусов. Мы провели подробный анализ транскриптома Conasprella coriolisi и Pygmaeconus traillii, впервые для обоих соответствующих родов Conidae. Чтобы повысить точность аннотации этих ожидаемо сильно дивергировавших транскриптомов, мы дополнили поиск по сходству и прогнозирование токсинов на основе структуры, de novo аннотацией, на основе филогении. Мы повторно «собрали» опубликованные транскриптомные данные двух дополнительных дивергентных родов Conidae, Profundiconus neocaledonicus и Californiconus californicus, чтобы верефицировать предсказанные токсины Conasprella и Pygmaeconus. Путем кластеризации кодирующих последовательностей ДНК (CDS), содержащих сигнальную область - молекулярную метку, которая обычно присутствует в экскретируемых пептидах, включая токсины - мы выделили предполагаемые ортогруппы токсинов, общие для всех 4х таксонов или некоторых из них. Доскональная аннотация этих кластеров (SSC) вявила большое количество токсинов к результатам аннотации на основе последовательности и доменной структуры транскриптов. Финальные каталоги включают 116 и 98 предполагаемых токсинов, отнесенных к 29 и 28 суперсемействам генов у Conasprella и Pygmaeconus, соответственно. Яды Conasprella и Pygmaeconus сильно различаются с точки зрения доминантных надсемейств генов ядов: P- и O3- у Conasprella, по сравнению с T- и L- у Pygmaeconus. В целом, яд Pygmaeconus, сильно отличается от ядов остальных Conidae. Это вполне можно объяснить небольшими размерами животного по сравнению со всеми другими Conidae, включенными в анализ. Следовательно, эволюция яда Pygmaeconus могла быть обусловлена адаптацией к необычной нише среди Conidae и, следовательно, к другому спектру взаимодействий, чем у более крупных Conidae. Семь кластеров транскриптов выделены как новые надсемейства генов DivCon1-7, а еще два кластера соответствуют таксономически надсемействам генов Pmag02 и New-Geo-1, ранее идентифицированных только в очень компактных группах видов конусов. Чтобы лучше оценить распределение DivCon1-7, Pmag02 и New-Geo-1 у Conidae, мы повторно собрали 15 опубликованных транскриптомов Conus, представляющих филогенетическое разнообразие Conus, а также основные пищевые специализации (червеядных, моллюскоядных и рыбоядных). Мы выполнили анализ этих транскриптомов на предмет наличия в них транскриптов DivCon1-7, Pmag02 и New-Geo-1. Мы обнаружили, что DivCon6, Pmag02 и New-Geo-1 на самом деле встречаются повсеместно в Conus, причем два последних имеют довольно высокую экспрессию, обеспечивая до 15% суммарной экспрессии токсинов. Наши результаты показывают, что филогенетический подход, реализованный в нашем исследовании, дополняет аннотацию транскриптомов на основе сходства и позволяет обойти ее методологические недостатки. Новый вид моллюсков семейства Costellariidae, Costapex baldwinae был недавно описан из местообитаний глубоководных рифов в южной и восточной частях Карибского моря, где он встречается на батиальных глубинах на затопленной древесине. Полная последовательность митохондриального генома Costapex baldwinae была секвенирована с помощью комбинации стандартной и дальнодействующей ПЦР и собрана из прочтений Illumina MiSeq. Митогеном длиной 15321 п.н. имеет базовый состав 29,2% A, 41,8% T, 12,0% C и 17,0% G. Он содержит 13 белок кодирующих генов, две рибосомные РНК и 22 гена тРНК, с таким же порядком генов и ориентация ДНК-цепочек, как и у других неогастропод, (кроме Conoidea). Филогенетический анализ показывает, что семейство Costellariidae, представленное этим видом, дивергировало раннем этапе радиации неогастропод, и образует сестринскую группу клады, которая включает пять из семи признанных в настоящее время надсемейств неогастропод В то время как данные ДНК все чаще используются для исследования филогении и идентификации таксонов, их использование для формального описания таксонов применяется редко и непоследовательно. Отчасти это связано с отсутствием до недавнего времени подходящих алгоритмов для идентификации диагностических признаков ДНК. Однако даже после выпуска трех таких программных инструментов, разработанных специально для систематиков в 2020 году, главный вопрос остается без ответа - вопрос надежности диагностических признаков ДНК. Действительно, надежность основанных на ДНК диагнозов в зависимости от доступной фракции генетического разнообразия видов никогда не оценивалась. Мы разработали новую программу под названием MOLD, которая определяет диагностические комбинации нуклеотидов (DNC) для выбранных таксонов на основе выравнивания последовательностей ДНК. Мы выбрали несколько опубликованных сэтов данных для таксонов ранга рода, но различающихся по локусу, числу включённых видов и нуклеотидных последовательностей на вид. В каждом сэте были выбраны несколько «фокусных» видов различающихся генетическим разнообразием и степенью генетической близости с наиболее близкородственным видом. Затем мы выполнили повторяемый сэмплинг увеличивающегося числа случайно выбранных гаплотипов для каждого из фокусных видов, чтобы оценить, как надежность ДНК диагноза изменяется в зависимости от имеющейся доли генетического разнообразия таксона. Мы показали, что широко используемые в настоящее время диагностические признаки ДНК первого типа часто не существуют для определенного вида в конкретном наборе данных, или являются недостаточно надежными. Мы предложили новый тип ДНК-признаков, называемый избыточным DNC (rDNC), который составлен в соответствии с заранее определенными критериями надежности и реализован в MOLD. Мы демонстрируем, что rDNC могут быть успешно идентифицированы для видов даже в наборах данных, состоящих из сотен видов, включая такие традиционно проблемные случаи, как криптические виды или виды с ярко выраженной генетической структурой. MOLD находится под лицензией GNU v3.0 General Public License и снабжен графическим пользовательским интерфейсом, чтобы расширить возможности его использования теми исследователями, которые не знакомы с командной строкой. Кроме того, MOLD интегрирован в растущую платформу iTaxoTools, в первую очередь предназначенную для систематиков.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Отряд Neogastropoda — большая и успешная группа морских улиток, насчитывающая более 15 000 ныне живущих видов. Большинство неогастропод активные хищники или кровососы, и многие из них обладают уникальными биохимическими адаптациями, для охотиты и защищиты от хищников. Наиболее известны из них яды конусов (моллюсков рода Conus), содержащие структурно разнообразные олигопептиды, конотоксины, способные параллизовать и убить жертву, и которые также могут быть смертельны для человека. Благодаря своей способности изменять функционирование нервной системы, блокируя передачу нервных импульсов, конотоксины являются перспективным источником биологически-активных компонентов для фармакологии. В то время как яды конусов становятся крайне популярным объектом мультидисциплинарных исследований, есть веские основания предполагать, что сходные яды есть и у некоторых других групп неогастропод, не родственных конусам. В то время как яды конусов являются крайне популярным объектом исследований, есть веские основания предполагать, что сходные яды есть и у некоторых других групп неогастропод, не родственных конусам. В завершающий год проекта, мы сосредоточились на самой разнообразной из таких групп, роде Vexillum так называемых «ребристых митр» — семейства брюхоногих Costellariidae. Как анатомия этого рода (т. е. наличие секреторной железы, идентичной ядовитой железе конусов), так и наблюдения за питанием позволяют предположить, что улитки этой группы производят сильнодействующий яд, который они используют для умерщвления своей добычи. Чтобы исследовать состав их яда, мы получили транскриптомные и протеомные данные для двух основных типов секреторных желез Vexillum: слюнной железы и железы Лейблена для нескольких видов рода, и в нескольких повторах на вид. Анализируя транскриптомные данные, мы стремились понять, какие гены экспрессируются в слюнной железе и железе Лейблена четырех видов Vexillum. Мы применили широкий спектр биоинформатических подходов, чтобы восстановить, классифицировать и всесторонне аннотировать те предсказанные транскрипты РНК, которые соответствуют секретируемым продуктам, то есть токсинам в широком смысле слова. Мы систематически исследовали структурные аспекты предсказанных пептидных токсинов: структуру их предшественников, дополнительные химические модификации (PTM), которые они приобретают после синтеза пептидной цепи, и нативную трехмерную конформацию зрелых токсинов. Однако реконструированный транскриптом (то есть, по сути, моментальный снимок транскрипции генов, основанный на секвенировании информационных РНК ткани) требует дополнительных доказательств на уровне пептидов, чтобы, во-первых, подтвердить, что предсказанные молекулы действительно существуют, а во-вторых, чтобы лучше понять молекулярную структуру конечных белковых продуктов (токсинов). Поэтому мы также выполнили исследование протеома (то есть, состава белков слюнной железы и железы Лейблейна), используя масс-спектрометрический анализ для двух видов Vexillum, для которых у нас были транскриптомные данные. Наши исследования впервые демонстрируют существование яда у моллюсков рода Vexillum. Мы показали, что в ядах вексиллумов преобладают разнообразные короткие, богатые цистеином пептиды, которые мы называем векситоксинами и которые во многих аспектах очень похожи на конотоксины. Векситоксины имеют одинаковую организацию предшественников, вторичная структура векситоксинов поддерживается сходным образом расположенными дисульфидными мостиками, векситоксины имеют несколько общих посттрансляционных модификаций с конотоксинами. Некоторые векситоксины демонстрируют обнаруживаемое сходство последовательностей с конотоксинами, и должны иметь сходные конформации доменов, соответственно, они должны иметь и сходные молекулярные мишени. Мы показывали, что множественные векситоксины содержат характерный мотив, ингибиторный цистиновый узел (ICK), который присутствует во многих фармакологически важных токсинах животных, включая анальгетик Приалт разработанный на основе конотоксина. Таким образом, векситоксины обладают значительным потенциалом, чтобы новым источником биоактивных пептидов для разработки лекарств и исследований в области нейрофизиологии. Яды были независимо приобретены более чем ста таксонами животных, и стали ключевой эволюционной инновацией, определяющей диверсификацию своих таксонов. Наладить производство яда — процесс не из легких. Это требует множественных взаимосвязанных адаптаций к производству и доставке яда, на уровне генов, тканей, органов и систем органов. На генном уровне гены, кодирующие компоненты яда, появляются из удвоенных «соматических» генов, функции которых не связаны с отравлением. Выявление того, какие «соматические» гены дали начало тому, что в конечном итоге стало токсином, и насколько сходны составы этих предковых генов, у неродственных ядовитых животных, один из важнейших вопросов эволюции. Железа Лейблена Вексиллума - заметно более недавнее эволюционное приобретение, чем ядовитая железа конусов, и поэтому мы предполагаем меньшее расхождение между генами токсинов и их «соматических» аналогов у вексиллюмов по сравнению с конусами. Это подтверждается тем, что, как мы показали, Costellariidae с анцестральной морфологией экспрессируют широкий спектр секреторных продуктов, сходных с обнаруженными в яде Vexillum. Мы находим поддержку этой гипотезы в молекулярной эволюции кластера векситоксинов V027. Транскрипты этого кластера образуют две структурные группы, длинную и короткую, и наши результаты показывают, что гены, кодирующие пептиды короткой группы, произошли от генов, кодирующих длинную группу. Структурная трансформация потребовала избавления от длинного консервативного домена «Frizzled» (который присутствует в транскриптах длинной группы, но отсутствует в короткой группе), и соответственно, утрату анцестральной функции. При этом мы обнаружили, что в генах короткой группы был приобретен дополнительный сайт ферментативного расщепления, так что после синтеза, белковый предшественник расщепляется также, как конотоксины, и его продуктом является короткий токсин, несущий мотив ICK. Мы показали, что домен токсина, как и известные гены конотоксинов, претерпел ускоренную эволюцию последовательности и достиг чрезвычайно высокой экспрессии в железе Лейблена одного анализируемого вида – Vexillum vulpecula. Другими словами, пептидный продукт, кодируемый этой группой транскриптов, вырабатывается в больших количествах и, исходя из его структурных особенностей, является нейротоксином. Этот пример иллюстрирует, как тканеспецифическое рекрутирование копии гена с последующей ускоренной эволюцией его последовательности приводит к появлению фармакологически релевантного компонента яда после видообразования хищников.