Аннотация результатов, полученных в 2019 году
- Исследовано влияние различных способов обработки и условий (времени суток, степени увлажненности почвы, пониженной и повышенной температур, солевого стресса, возраста растений) на эффективность ингибирования экспрессии трансгена неомицинфосфотрансферазы (NPTII) у Arabidopsis thaliana с помощью экзогенного применения растворов двухцепочечной РНК (дцРНК). Установлено, что опрыскивание и обработка листьев кисточками снижают экспрессию целевого трансгена в наибольшей степени по сравнению с другими тестируемыми способами, включающими инфильтрацию, инокуляцию с карбидом кремния, вкалывание иглой и нанесение раствора пипеткой. Обнаружено, что время суток критически влияет на эффективность обработки поверхности растений растворами дцРНК против целевого трансгена. Экзогенное применение дцРНК было высокоэффективным только при обработке в вечернее и ночное время, в то время как обработка утром вовсе не оказывала эффекта, а обработка днем оказывала только некоторый сдерживающий эффект. Установлено, что степень увлажненности почвы способствует более значительному снижению экспрессии трансгена. Холодовая обработка, тепловая обработка и солевой стресс не оказывали какого-либо значительного эффекта. Кроме того, установлено, что возраст растений является важным фактором, поскольку экспрессия целевых трансгенов снижалась значительно более активно в более молодых растениях. - Обнаружено, что уровень экспрессии гена NPTII и гена зеленого флуоресцентного белка (EGFP), находящихся под контролем двойного конститутивного промотора CaMV 35S, значительно отличался между различными органами A. thaliana без каких-либо дополнительных воздействий. Оба трансгена значительно более активно экспрессировались в семядолях, первых появляющихся листьях и корнях, постепенно снижая свою экспрессию к более «старым» листьям и листьям на стебле. Наиболее низкая экспрессия трансгенов наблюдалась в стеблях и соцветиях. Показано, что уровень экспрессии трансгенов постепенно возрастал с течением времени в растениях. Кроме того, активность трансгенов может варьировать в течение суток в растениях без дополнительных воздействий. Однако наблюдаемые различия в экспрессии трансгенов были в большинстве случаев небольшими. При культивировании арабидопсиса в засушливых условиях экспрессия трансгенов была значительно снижена по сравнению с таковой в условиях регулярного увлажнения почвы. При этом обнаружено, что холодовой стресс, наоборот, значительно повышал экспрессию трансгенов. Анализ содержания соответствующих рекомбинантных белков в различных органах A. thaliana и под влиянием холодового стресса подтвердил полученные данные. Поранение, тепловой и солевой стрессы не оказывали значительного и стабильного эффекта на экспрессию трансгенов. - Изучен эффект внешней обработки растений растворами модифицированных и немодифицированных NPTII-кодирующих РНК-олигонуклеотидов, ДНК-олигонуклеотидов и в сравнении с длинными дцРНК и дцРНК-имитирующими ДНК на экспрессию целевого трансгена у A. thaliana. Подтверждено, что внешняя обработка растений синтетическими siRNA-имитирующими РНК-олигонуклеотидами достоверно снижала экспрессию целевого трансгена в значительной степени. Однако обработка растений аналогичными синтетическими модифицированными и немодифицированными короткими ДНК олигонуклеотидами или длинными ДНК не привела к какому-либо значимому и стабильному эффекту. С помощью Вестерн-блоттинга установлено, что внешняя обработка растений РНК-олигонуклеотидами значительно снижала накопление белкового продукта целевого трансгена. С помощью бисульфитного секвенирования установлено, что цитозиновое метилирование трансгена значительно возрастало после обработки растений РНК-олигонуклеотидами. Показано, что супрессия трансгена, вызванная внешней обработкой растений растворами NPTII-РНК, является сиквенс-специфичной. Для этого растения, несущие в своем геноме только один трансген, обрабатывали различными концентрациями как специфичной трансген-кодирующей дцРНК, так и отдельно дцРНК, кодирующей другой трансген, который не переносили в геном арабидопсиса. - Расширен список кандидатных-генов мишеней для последующего искусственного подавления их экспрессии (с помощью разрабатываемого в настоящем проекте и традиционного подходов в сравнении). Были выявлены 4 кандидатных гена-мишени, имеющих непосредственное отношение к биосинтезу стильбенов. Дальнейший анализ экспрессии 4 генов-мишеней, VaWRKY53, VaCHI3, VaRPP13 и VaCAMTA4, и регулирующих их экспрессию малых некодирующих РНК выявил полное соответствие, выраженное в обратной зависимости экспрессий генов-мишеней и малых РНК в клетках V. amurensis. Полученные данные о полной нуклеотидной последовательности кДНК искомых транскриптов, позволяют перейти к экспериментам, направленным на искусственное подавление их экспрессии в клетках V. amurensis.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1a) Исследовано влияние различных физиологических условий в момент обработки растений экзогенной синтетической длинной двухцепочечной РНК (dsRNA или дцРНК), кодирующей неомицинфосфотрансферазу (NPTII), на степень ингибирования экспрессии трансгенa NPTII у Arabidopsis thaliana. Установлена высокая важность определенного возраста растений (4 недели), времени суток, низкой увлажненности почвы в момент обработки экзогенной dsRNA для эффективного ингибирования экспрессии целевого гена. Выявлено значительно более высокое подавление NPTII при применении dsRNA в вечернее и ночное время. Обработка адаксиальной и абаксиальной поверхности листьев мягкими стерильными кисточками, опрыскиванием и пипетированием показала более высокое подавление NPTII, в то время как инфильтрация и механическая инокуляция были менее эффективными. Результаты опубликованы (Kiselev et al. Plants (Basel) 2021, 10, 264). 1b) Изучены особенности экспрессии трансгенов NPTII и EGFP под контролем двойного промотора CaMV 35S в растениях A. thaliana без экзогенного применения РНК. Установлено, что уровни транскриптов NPTII и EGFP были значительно выше в семядолях, молодых листьях и корнях, чем в соцветиях, стеблях и взрослых листьях трех независимых NPTII и EGFP-трансгенных линий A. thaliana. Обнаружено, что уровень мРНК NPTII и EGFP варьирует в течение суток и постепенно повышается с возрастом растений. Засуха и холодовой стресс значительно повлияли на экспрессию трансгенов, в то время как тепловой стресс, высокая соленость и поранение не оказывали существенного влияния. Это исследование показывает, что транскрипционная активность трансгенов, находящихся под контролем конститутивного промотора CaMV 35S, может значительно варьировать в зависимости от органа и тканей растения, возраста, времени суток и в ответ на абиотический стресс. Результаты опубликованы (Kiselev et al. 2021 Molecular Biology Reports 48:2235–2241). 2) Исследована специфичность наблюдаемого трансген-супрессирующего эффекта, вызванного экзогенными NPTII- и EGFP-кодирующими dsRNA. Ни в одной из используемых доз EGFP-dsRNA не приводила к значимому снижению экспрессии NPTII в NPTII-трансгенных растениях, в то время как обработка этих растений специфичной NPTII-dsRNA значительно снижала экспрессию NPTII. ДНК-олигонуклеотиды и длинная ДНК, имитирующие по последовательности и модификациям NPTII-dsRNA, не оказывали значимого эффекта. Таким образом, экзогенная dsRNA индуцирует сиквенс-специфичный и РНК-специфичный трансген-супрессирующий эффект. Работа готовиться к публикации. 3) Получена новая научная информация о влиянии экзогенных dsRNA и малых интерферирующих РНК (siRNA) на экспрессию целевых эндогенных генов растений A. thaliana и культур клеток Vitis amurensis на примере регуляции генов, важных для биосинтеза антоцианов у A. thaliana (AtCHS, AtMyBL2, AtANAC032) и стильбенов у V. amurensis (VaSTS, VaMyb1). Прямое применение AtCHS-кодирующей dsRNA приводило к значительному и эффективному понижению уровня мРНК гена AtCHS и подавлению накопление антоцианов в листьях A. thalianа как в стандартных условиях (при температуре 22°С, 16 ч день/8 ч ночь), так и в условиях модуляции биосинтеза антоцианов (+7oC и постоянный свет 24 ч) в течение 7 дней. Прямое применение AtCHS-кодирующих siRNA (короткие 21-nt модифицированные РНК-олигонуклеотиды, 5'-фосфорилирование, 2ʹ-O-метил на 3′конце) приводило к таким же эффектам. Подавление экспрессии генов AtMybL2 и ANAC032 экзогенными AtMybL2- и ANAC032-dsRNA значительно снижало уровни мРНК этих транскрипционных репрессоров и при этом приводило к ярко выраженной активации гена AtCHS. После обработки MybL2-dsRNA наблюдали значительное увеличение содержания антоцианов. Работа готовиться к публикации. Установлено, что обработка каллусных клеточных культур V. amurensis экзогенной VaSTS- и VaMyb1-dsRNA приводит к снижению уровня мРНК генов VaSTS и VaMyb1, важных для биосинтеза стильбенов. Экзогенная VaSTS-dsRNA снижала содержание стильбенов, а экзогенная VaMybL2-dsRNA, напротив, значительно повышала. 4) Изучено содержание и разнообразие продуцируемых малых РНК до и после обработки растений экзогенными dsRNA, кодирующими эндогенный ген AtCHS и трансген NPTII (c помощью масштабного секвенирования фракции малых РНК). В результате было получено 526 174 120 прочтений. Секвенировано два биологических повтора для каждого воздействия (6 образцов фракции малых РНК). На данный момент установлено, что в растениях, обработанных AtCHS-dsRNA, значительно выше содержание AtCHS-кодирующих малых РНК, чем в растениях, обработанных водой или неспецифической NPTII-dsRNA. Более того в растениях, обработанных NPTII-dsRNA, обнаружено большое количество NPTII-кодирующих малых РНК, в то время как в растениях, обработанных водой и AtCHS-dsRNA, таковых малых РНК не обнаружено. Полученные данные свидетельствуют об индукции процессов РНК интерференции экзогенными dsRNA. Биоинформатический анализ полученных данных продолжается. 5) С помощью конфокальной микроскопии анализировали проникновение и распространение экзогенных AtCHS- и NPTII-кодирующих dsRNA в листьях A. thaliana. In vitro синтезированную AtCHS-dsRNA и NPTII-dsRNA метили красителем Cy3 и наносили на поверхность листьев. Исследование листьев A. thaliana через 1 день после обработки выявило наличие Сy3-меченной dsRNA в проводящих сосудах, в группах клеток паренхимы и устьицах. Полученные данные свидетельствуют о проникновении dsRNA в ткани и отдельные клетки растений и о распространении ее по сосудам листовой пластинки. 6) Получены векторные конструкции, трансгенные растения A. thaliana и культуры клеток V. amurensis для сравнения двух способов сайленсинга целевых генов (CHS у A. thaliana и Myb1 в V. amurensis). На данный момент полученные данные показывают активацию общего содержания стильбенов в 5-15 раз в трансгенных каллусах, экспрессирующих два типа amiRNA-VaMyb1. По предварительным данным при обработке нетрансгенных каллусов VaMyb1-кодирующей dsRNA наблюдаемые эффекты (снижение экспрессии VaMyb1 и увеличение содержания антоцианов) были менее яркими и значимыми, чем при трансформации растений amiRNA. 7) С помощью метода бисульфитного секвенирования исследовали уровень цитозинового метилирования гена AtCHS до и после обработки растений экзогенной AtCHS-dsRNA. Полученные результаты показывают, наоборот, некоторое снижение степени метилирования кодирующей области AtCHS в отличие от ранее опубликованных нами данных для NPTII и EGFP (Dubrovina et al. 2019 IJMS).

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1) Доказана возможность специфичного подавления экспрессии целевых эндогенных генов растений с помощью экзогенных дцРНК и киРНК (на примере генов AtCHS, AtMybL2 и AtANAC032), а также возможности регуляции количества конечного продукта – антоцианов. Прямая обработка листовой поверхности A. thaliana водными растворами AtCHS-дцРНК и киРНК приводила к эффективному подавлению экспрессии гена AtCHS и значительно снижала накопление антоцианов. Экзогенные AtMYBL2- и AtANAC032-дцРНК значительно снизили уровни мРНК этих генов, активировали экспрессию AtCHS и повысили содержание антоцианов. Наблюдаемый супрессирующий эффект геноспецифичных дцРНК сохранялся на 2, 7, 14, и 21 день после обработки. Написана и опубликована статья «External dsRNA Downregulates Anthocyanin Biosynthesis-Related Genes and Affects Anthocyanin Accumulation in Arabidopsis thaliana" (International Journal of Molecular Sciences 2021, 22, 6749). 2) Оценили эффективность одновременного ингибирования генов пяти важных белков, вовлеченных в регуляцию биосинтеза и метаболизма антоцианов у растений A. thaliana, а именно AtCPC, AtCBP60g, AtMybL2 и AtANAC032 и AtBAN. Сначала проанализировали влияние обработки внешней поверхности растений арабидопсиса геноспецифичными дцРНК на экспрессию каждого из этих пяти факторов по отдельности. После этого водные растворы пяти дцРНК против каждого из пяти регуляторов аккумуляции антоцианов объединили и обрабатывали растения сразу против пяти целевых генов. Установлено, что обработка растений дцРНК против одновременно пяти генов данных негативных регуляторов накопления антоцианов активирует аккумуляцию этих веществ в два раза более эффективно, чем обработка против какого-либо одного из этих факторов по отдельности, даже несмотря на меньшее количество отдельных дцРНК. 3) С помощью масштабного секвенирования фракции малых РНК по технологии Illumina и последующего биоинформатического анализа впервые установлено, что применение как AtCHS-дцРНК, так и NPTII-дцРНК, привело к появлению большого количества AtCHS- или NPTII-специфичных малых РНК в листьях A. thaliana, которые не присутствовали после контрольных водных обработок. Проанализирован состав секвенированной фракции малых РНК, распределение по длинам и сосбенности покрытия соответствующих генов. Применение экзогенных AtCHS-дцРНК привело к значительному увеличению уровня 21-нуклеотидных малых РНК, в то время как содержание малых РНК длиной 23 и 24 нуклеотида, было значительно снижено. Показано, что экзогенные AtCHS-дцРНК, подвергаются расщеплению до киРНК и в конечном итоге происходит индукция процессов РНК интерференции, что приводит к подавлению экспрессии AtCHS. Последовательности библиотеки sRNA были депонированы в NCBI под регистрационным номером PRJNA827691 и в базе данных лаборатории биотехнологии ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН (https://biosoil.ru/downloads/biotech/RNAseq/Arabidopsis/2021-03-20012551-data1(Our-RNAseq-1(2))/). 4) Установлено, что ни одна из доз EGFP-дцРНК не приводила к значительному снижению экспрессии трансгена NPTII в NPTII-трансгенных растениях, в то время как специфическая NPTII-дцРНК значительно снижала экспрессию NPTII дозозависимым образом. Длинные ДНК, имитирующие дцРНК, и короткие ДНК-олигонуклеотиды, имитирующие киРНК, не оказывали существенного влияния на экспрессию трансгена NPTII. Анализ показал, что экзогенно примененная NPTII-дцРНК не влияла на экспрессию четырех нецелевых генов A. thaliana, включая AtGAPDH, AtCHS, AtUBQ и AtCML80 при трех различных концентрациях применяемой дцРНК, что подтверждает специфичность действия экзогенных дцРНК. Таким образом, экзогенные NPTII-дцРНК индуцировали специфичный для последовательности и специфичный для РНК трансген-подавляющий эффект. На основе полученных данных опубликована статья «The Specificity of Transgene Suppression in Plants by Exogenous dsRNA» (Plants 2022, 11, 715). 5) Проведено сравнение способов сайленсинга целевых генов, а именно эффективности экзогенной обработки растений растворами дцРНК и получения трансгенных растений, экспрессирующих искуственные микроРНК на примере регуляции генов AtCHS A.thaliana и VaMyb1 V. amurensis. Установлено, что amiRNA-AtCHS-трансгенные растения A.thaliana накапливают значительно меньшие количества антоцианов и эффект сохранялся в течение 21 дня. Трансгенные каллусные культуры V. amurensis, активно экспрессирующие искусcтвенные amiRNA-VaMyb1 против гена, кодирующего транскрипционный репрессор биосинтеза стильбенов VaMyb1, характеризовались значительно сниженной экспрессией VaMyb1 и резкой активацией биосинтеза стильбенов. Эффект сохранялся в течение 3 месяцев и затем резко исчезал. Опрыскивание нетрансгенных каллусных культур VaMyb1-дцРНК снижало экспрессию VaMyb1 и способствовало повышенному накоплению стильбенов. Обработка же листьев лианы V. amurensis VaMyb1-дцРНК привела к яркому подавлению VaMyb1 и повышению продукции стильбенов. Таким образом, возможно в значительной степени снизить экспрессию целевого гена растения с помощью обоих подходов. Данные частично опубликованы “Применение методов РНК-интерференции для регуляции экспрессии генов винограда” (Виноградарство и виноделие 2021, 50:32-35). 6) С помощью бисульфитного секвенирования проанализировали количество метилированных цитозинов в ДНК кодирующей последовательности гена AtCHS (3’-концевая область длиной 292 bp) после обработки водой (негативный контроль), специфической экзогенной AtCHS-дцРНК и неспецифической NPTII-дцРНК. Полученные результаты бисульфитного секвенирования говорят о том, что обработка растений A.thaliana AtCHS-дцРНК приводит к уменьшению уровня метилированных цитозинов в 3’-кодирующей области гена AtCHS, и при этом обработка растений неспецифической NPTII-дцРНК не влияла на уровень метилирования гена AtCHS. Однако полученное снижение уровня метилирования AtCHS на 5-7% статистически не отличалось от уровня метилирования проб, обработанных водой и NPTII конструкцией. 7) Подготовлен обзор научной литературы на тему “ Novel RNA interference-based tools for plant improvement and pathogen control”, где мы провели описание и анализ современных подходов, основанных на явлении РНК интерференции, для регуляции экспрессии генов у растений и патогенов растений. В обзор вошел анализ данных по трем подходам: (1) spray-induced gene silencing или РНК «вакцинация» растений на основе применения экзогенных дцРНК и киРНК; (2) «вирус-индуцированное подавление генов» или virus-induced gene silencing и (3) «хозяин-индуцированное замолкание генов» или host-induced gene silencing. Основное внимание уделено регуляции экспрессии генов растений с помощью дцРНК.