Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Репродуктивные потери у человека - чрезвычайно частое явление. Демографические исследования показали, что шансы произвести жизнеспособное потомство у женщины среднего репродуктивного возраста в течение одного менструального цикла не превышают 25 %. Одной из причин, вносящих существенный вклад в этиологию ранней эмбриональной смерти, являются хромосомные аномалии. По разным оценкам, от 50 до 60% самопроизвольных абортов имеют анеуплоидии. Более того, известно, что частота анеуплоидий выше, а спектр хромосомных аномалий значительно разнообразнее на предимплантационном этапе эмбрионального развития по сравнению с последующими этапами внутриутробного онтогенеза. Высокие частоты мейотической и митотической анеуплоидии в бластоцистах совпадают с волнами эпигенетического перепрограммирования, характеризующимися резким снижением уровня метилирования всего генома. Метилирование ДНК является одним из основных механизмов регуляции программы развития в эмбриогенезе, которое служит для управления как активностью отдельных генов, так и для защиты от различных повторяющихся последовательностей. Половина человеческого генома состоит из различных повторяющихся последовательностей. Самый большой класс повторов – это ретротранспозоны LINE-1, которые занимают около 17% генома человека. Промоторные области ретротранспозона содержат большое количество CpG-сайтов, которые позволяют организму использовать их метилирования в качестве механизма контроля за активностью LINE-1. В данном исследовании мы наблюдали повышенный уровень метилирования LINE-1 в трофобласте ворсин хориона спонтанных абортов с трисомией и моносомией различных хромосом. Этот эффект может отражать влияние анеуплоидии на уровень общегеномного гиперметилирования, что было ранее показано для трисомий 16 и 21. Однако на сегодняшний день было обнаружено, что только несколько генов дифференцированно метилируются в клетках человека с трисомиями 13, 18 и анеуплоидией Х-хромосомы, в которых мы также обнаружили повышенный уровень метилирования LINE-1. Кроме того, мы показали, что уровни метилирования LINE-1 различны у спонтанных абортусов с трисомиями разных хромосом. Наибольший уровень метилирования отмечался при трисомии 8, 14, 18 и моносомии X. Эти хромосомы содержат ключевые гены, обеспечивающие функционирование механизма контроля активности LINE-1 за счет метилирования ДНК и активности piRNA: PIWIL2, PRMT5, MBD1, MECP2. Уровень метилирования LINE-1 повышался со сроком эмбриональной гибели для спонтанных абортусов как с нормальным кариотипом, так и с анеуплоидией по отдельным хромосомам. Наконец, мы показали, что уровень метилирования LINE-1 зависит от возраста родителей. Метилирование LINE-1 уменьшается с возрастом матери у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом и при трисомии 21. Предполагается, что это является результатом переноса метилирования родительских гамет в экстраэмбриональные ткани, что недавно было показано для отдельных участков генома ооцитов. Таким образом, мы показали, что уровень метилирования ретротранспозона LINE-1 повышается в трофобласте ворсин хориона у спонтанных абортусов с трисомией и моносомией. Различный уровень метилирования LINE-1 у спонтанных абортусов с трисомией по отдельным хромосомам указывает на то, что увеличение метилирования LINE-1, по крайней мере частично, является результатом анеуплоидии. Напротив, влияние родительского возраста указывает на то, что уровень метилирования LINE-1 может быть перенесен из гамет, и свидетельствует в пользу независимого от анеуплоидии механизма гиперметилирования LINE-1. Функциональные последствия обнаруженного гиперметилирования LINE-1 неизвестны, но его корреляция со сроком прерывания беременности спонтанных абортусов с трисомией позволяет предположить, что оно может оказывать некоторое защитное действие на жизнеспособность эмбриона. Помимо контроля за активностью повторяющихся элементов в геноме, метилирование ДНК является механизмом управления активностью генов в программе индивидуального развития. Поэтому в настоящем проекте был проведен анализ изменений регуляции активности генов эмбрионального развития человека в плаценте эмбрионов с числовыми хромосомными нарушениями. По предварительным результатам, полученным с помощью широкогеномного анализа, у спонтанных абортусов с трисомией 16 наблюдалось значимое гиперметилирование в промоторах 90 генов. Среди них были обогащены гены секретируемых белков (29 генов), а еще 10 генов кодировали рецепторы. В настоящем проекте было обнаружено, что уровень метилирования промоторов пяти генов (ANKRD53, GATA3-AS1, CALCB, TRPV6, SCL13A4) был значимо повышен у спонтанных абортусов с трисомией 16. Данные гены управляют дифференцировкой клеток трофобласта, сигнальным взаимодействием с организмом матери и являются критическими для функционирования трофобласта в первом триместре беременности. Полученные результаты указывают на возможное эпигенетическое нарушение дифференцировки трофобласта и регуляции сигнального взаимодействия между эмбрионом с анеуплоидией и матерью, что является потенциальной причиной прерывания беременности при наличии у эмбриона анеуплоидии. Именно на 8-10 неделе беременности происходит инвазия клеток трофобласта в спиральные артерии с целью их ремоделирования для обеспечения питания эмбриона. Возможно, гиперметилирование выявленных генов при трисомии 16 приводит к снижению эффективности дифференцировки трофобласта, снижению поступления питательных веществ и гибели эмбриона. Таким образом, числовые хромосомные аномалии у спонтанных абортусов сочетаются с масштабными эпигенетическими нарушениями, которые могут вносить ощутимый вклад в реализацию патологических механизмов, приводящих к внутриутробной гибели эмбрионов человека. Полученные результаты указывают на возможное эпигенетическое нарушение стабильности генома эмбриона и регуляции сигнального взаимодействия между эмбрионом с анеуплоидией и матерью, что является потенциальной причиной прерывания беременности при наличии у эмбриона анеуплоидии.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Развитие эмбриона в организме матери – сложный процесс, требующий соблюдения множества условий. Будущий ребенок внедряется в стенку матки и «договаривается» с матерью, участвуя в формировании плаценты. Ее организм предоставит ему питание и защиту на долгие 9 месяцев. К сожалению, так происходит не всегда. Каждая пятая беременность заканчивается выкидышем в течение первых трех месяцев. Причины такого прерывания беременности обычно не зависят от матери и связаны с генетическими проблемами эмбриона. Примерно половина эмбрионов, остановившихся в развитии, имеют в своих клетках неправильное число хромосом, называемое анеуплоидией. Лишь очень небольшая доля эмбрионов с анеуплоидией доживает до рождения. Поэтому часто выкидыш на ранних сроках беременности – это проявление генетической защиты от рождения больного ребенка. Считается, что основная причина гибели эмбриона с неправильным числом хромосом – изменение активности генов, находящихся на лишней хромосоме. В этом случае эмбрионы с анеуплоидией по разным хромосомам должны были бы иметь различные механизмы нарушения развития. Например, мы показали, что трисомия по хромосоме 16, которая чаще других приводит к гибели эмбрионов в первом триместре беременности, связана с нарушением активности множества генов, отвечающих за нормальное функционирование плаценты. Среди них гены, благодаря которым происходит нормальное общение организмов эмбриона и матери. В настоящем проекте обнаружено, что эмбрионы с анеуплоидией по разным хромосомам связаны общей чертой. У всех них была подавлена активность ретротранспозона LINE-1 за счет повышения уровня метилирования ДНК в его промоторе. Ретротранспозоны – остатки бывших вирусов, записавших свою генетическую информацию в геном человека и передающихся вместе с ним из поколения в поколение. В результате половина генома человека занята такими последовательностями ДНК. Примерно одна пятая часть генома человека представлена последовательностями ретротранспозона LINE-1. Долгое время они считались «генетическим мусором», не выполняющим никакой функции. Однако недавно было установлено, что LINE-1 необходим для включения генов, обеспечивающих раннее эмбриональное развитие мышей. Наши результаты показали, что нарушение активности LINE-1 в плаценте может быть связано с гибелью эмбриона на ранних сроках беременности. Это означает, что ретротранспозон LINE-1 важен и для человека. Ретротранспозоны в геноме человека принадлежат к нескольким семействам. Некоторые из них одинаковы с человекообразными обезьянами. Другие специфичны только для человека. Мы обнаружили, что у эмбрионов с анеуплоидией сильнее подавлялись именно эволюционно более молодые элементы LINE-1, специфичные только для человека. В будущем это поможет понять, какие механизмы задействованы в этом процессе. Результаты работы указывают на то, что геном человека «одомашнил» древние вирусы, приспособив их для выполнения очень важных задач развития организма. В результате изменение регуляции ретротранспозона LINE-1 может служить своего рода «предохранителем», защищающим мать от рождения ребенка с несовместимыми с жизнью генетическими нарушениями. В будущем эта информация может быть использована для разработки методов оценки качества эмбрионов во вспомогательных репродуктивных технологиях.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Каждая пятая беременность заканчивается выкидышем в течение первых трех месяцев. Причины такого прерывания беременности обычно не зависят от матери и связаны с генетическими проблемами эмбриона. Примерно половина эмбрионов, остановившихся в развитии, имеют в своих клетках неправильное число хромосом, называемое анеуплоидией. Дисбаланс генов, который возникает в результате анеуплоидии, приводит к нарушению индивидуального развития и гибели эмбриона, хотя непосредственные механизмы этого процесса остаются до сих пор неизвестными. Лишь очень небольшая доля эмбрионов с анеуплоидией доживает до рождения. Поэтому часто выкидыш на ранних сроках беременности – это проявление генетической защиты от рождения больного ребенка. Одной из таких анеуплоидий является моносомия X-хромосомы, приводящая к развитию синдрома Шерешевского-Тернера. Моносомия Х-хромосомы является наиболее частой генетической аномалией у человека, поскольку она присутствует примерно в 2% всех зачатий, хотя в 99% эти беременности заканчиваются самопроизвольным выкидышем. Среди всех спонтанных абортусов моносомию X имеют около 15%, что ставит ее на второе место по частоте после трисомии 16. Поэтому в нашем проекте мы исследовали причины гибели зародышей с моносомией X. На предыдущих этапах проекта мы обнаружили, что спонтанные абортусы с анеуплоидией по различным хромосомам, включая моносомию X, имеют сходные эпигенетические нарушения – повышенный уровень метилирования ретротранспозона LINE-1, занимающего около пятой части генома человека. Повышенный индекс метилирования в промоторе LINE-1 поднимает вопрос о том, насколько данное эпигенетическое нарушение характерно и для промоторов белок-кодирующих генов. Поэтому мы провели анализ изменений в уровне метилирования более миллиона сайтов в значительной части генома человека в ворсинах хориона спонтанных абортусов с моносомией X с помощью бисульфитного секвенирования ограниченного набора геномных локусов (reduced representation bisulfite sequencing – RRBS). Вопрос о происхождении моносомии Х остается дискуссионным. С одной стороны, показано, что в 2/3 случаев синдрома Шерешевского-Тернера теряется отцовская Х-хромосома. Однако иногда отмечаются и случаи потери материнской X-хромосомы. Так как в отцовском и материнском геноме в гаметогенезе и сразу после оплодотворения действуют разные эпигенетические механизмы, мы отдельно оценивали группы спонтанных абортусов с оставшейся X-хромосомой отцовского и материнского происхождения. Родившиеся индивиды с синдромом Шерешевского-Тернера имеют женский пол в связи с отсутствием хромосомы Y. Однако наши результаты показывают, что спонтанные абортусы с моносомией X по профилю метилирования генома в плаценте были значительно ближе к нормальным эмбрионам мужского пола. Возможно, внутриутробно погибают именно те эмбрионы, у которых нарушено правильное определение пола. Спонтанные абортусы с моносомией X имели значительные нарушения профиля метилирования генома, часть из которых была специфична для эмбрионов с оставшейся X-хромосомой отцовского и материнского происхождения, и лишь некоторые были общими. Среди общих нарушений было выявлено аберрантное повышение уровня метилирования в промоторе гена FGF12, который кодирует один из факторов роста фибробластов. Однако его функции в плаценте в первом триместре остаются неизвестными и требуют дальнейшего изучения. 60% всех генов с нарушенным уровнем метилирования у спонтанных абортусов с моносомией X кодируют белки, имеющие так называемые внутренне-неупорядоченные домены (intrinsically disordered domain). Внутренне-неупорядоченные белки не имеют жесткой трехмерной структуры, но зато могут принимать множество конформаций, обеспечивающих выполнение разных функций. Считается, что внутренне-неупорядоченные белки влияют на решения о судьбе клеток, подключая сети взаимодействия белков. В частности, с внутренне-неупорядоченными доменами в белках связывают поддержание метилирования и деметилирования генома в раннем эмбриогенезе. Таким образом, наши результаты показывают, что гибель эмбрионов с моносомией X в первом триместре беременности может быть связана со значительными нарушениями эпигенетического ландшафта в клетках плаценты, что может приводить к неадекватной плацентации и/или несбалансированной пролиферации и дифференцировки клеток и в конечном итоге к гибели эмбрионов. Темой проекта является изучение эпигенетического ландшафта анеуплоидных эмбрионов человека. Однако на первых этапах было обнаружено, что часть спонтанных абортусов с нормальным кариотипом имеют повышенный уровень метилирования ретротранспозона LINE-1, как и эмбрионы с анеуплоидией по различным хромосомам. Возможно, выявленные эпигенетические нарушения играют самостоятельную роль в эмбриональной гибели. Поэтому мы провели более детальное изучение профиля метилирования по всему геному с помощью метода RRBS у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом, но с повышенным уровнем метилирования ретротранспозона LINE-1. Группами сравнения были нормальные медицинские абортусы и спонтанные абортусы с уровнем метилирования ретротранспозона LINE-1, близким к таковому у нормальных эмбрионов. Помимо повышенного уровня метилирования LINE-1, изученные спонтанные абортусы имели и другие значительные изменения профиля метилирования генома – нарушался уровень метилирования в 70 генах белков, отвечающих за индивидуальное развитие. В частности, был аберрантно повышен уровень метилирования в генах BMP4 и EGFR. BMP4 является важным геном, управляющим дифференцировкой клеток трофобласта ворсин хориона, а сниженная экспрессия EGFR наблюдается при многих осложнениях, связанных с беременностью, включая преэклампсию, задержку внутриутробного развития и привычное невынашивание. Результаты нашего исследования показывают, что масштабные нарушения профиля метилирования в геноме могут быть потенциальной причиной гибели большой части эмбрионов даже с нормальным кариотипом. Повышенный уровень метилирования ретротранспозона LINE-1, выявленный в настоящем проекте, может потенциально влиять на развитие эмбриона несколькими путями. Во-первых, как мы показали в нашей работе, уровень метилирования ретротранспозона LINE-1 связан с уровнем метилирования белок-кодирующих генов, а его изменения отражают значительные изменения по всему эпигенетическому ландшафту клеток плаценты. Во-вторых, недавно было обнаружено, что многие гены, имеющие вставки ретротранспозона LINE-1 в интронах, могут транскрибироваться с антисмыслового промотора LINE-1, приводя к считыванию укороченного транскрипта гена. Учитывая гипометилированный характер эпигенетического ландшафта плаценты, возможно, что в плаценте альтернативные промоторы LINE-1 не находятся под таким строгим контролем, как в других тканях организма, и считывание с них коротких транскриптов может быть более интенсивным. В настоящем проекте нами была подтверждена такая возможность на двух генах – NUP153 и YWHAB, для которых была показана зависимая от уровня метилирования повышенная экспрессия с альтернативных промоторов LINE-1 в плаценте по сравнению с лимфоцитами взрослых индивидов. Таким образом, гипометилированный эпигенетический ландшафт в плаценте повышает экспрессию исследованных генов с альтернативных промоторов ретротранспозона LINE-1, находящихся в интронах. Однако очерчивание границ применимости этой модели для всех или определенного подмножества генов, имеющих такие альтернативные промоторы, требует дополнительных исследований с исследованием всего транскриптома плаценты, которые планируется провести в рамках продленного проекта. Кроме того, необходимо будет оценить зависимость экспрессии с канонических и альтернативных промоторов от уровня метилирования LINE-1 в образце и нарушения экспрессии этих генов у спонтанных абортусов с различным кариотипом.