КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 19-74-10038
НазваниеТаргетная элиминация стареющих клеток в моделях нарушения функций эндометрия в качестве подхода для восстановления его рецептивных свойств
РуководительБородкина Александра Васильевна, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук, г Санкт-Петербург
Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2019 - 06.2022 | , продлен на 07.2022 - 06.2024. Карточка проекта продления (ссылка) |
Конкурс№41 - Конкурс 2019 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-205 - Клеточная биология, цитология, гистология
Ключевые словаЭндометриальные стромальные клетки, рецептивность эндометрия, клеточное старение, децидуализация, 2D-модели, 3D-модели, сфероиды, имплантация, активные формы кислорода, HyPer, сенолитики, FOXO4-пептид, фармакологическая терапия
Код ГРНТИ34.03.27
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Количество бесплодных пар репродуктивного возраста в России превышает 15%, что по критериям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) считается угрозой национальной безопасности страны (Аганезов и др., 2017; Яковлева, 2016). Наиболее эффективным методом лечения бесплодия признано экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) (Ferraretti et al., 2010; Крылова и др., 2013; Яковлева, 2016). Однако для достижения положительного результата пары вынуждены делать в среднем три-четыре раунда ЭКО, при этом около 60% циклов заканчиваются неудачей (Ferraretti et al., 2010; Аганезов и др., 2017; Корсак, 2014; Крылова и др., 2013). Более того, согласно данным литературы, около 70% эмбрионов хорошего качества после переноса не имплантируются в полость матки (Носенко и др., 2013). Таким образом, сегодня в вопросах женского бесплодия проблема многократных неудач имплантации выходит на первый план, а ее решение становится очень актуальным.
Отсутствие результата лечения при проведении ЭКО в подавляющем большинстве случаев связано с нарушением рецептивности эндометрия и/или дефектами эмбрионально-эндометриальных взаимодействий (Сотникова и др., 2014; Рыбалка и др., 2017). В связи с этим, все большее внимание уделяется исследованию эндометрия в период имплантационного окна, то есть в период максимальной восприимчивости (рецептивности) эндометрия к имплантации бластоцисты. Одним из важнейших этапов трансформации эндометрия, необходимых для «открытия» окна имплантации, является дифференцировка эндометриальных стромальных клеток (эСК) в специализированные эпителиоподобные децидуальные клетки (Gellersen et al., 2014; Teklenburg et al., 2010).
Научную основу настоящего проекта составляет гипотеза о существовании взаимосвязи между старением эСК и процессами децидуализации и имплантации и предположение о том, что таргетная элиминация стареющих эСК может способствовать улучшению рецептивности эндометрия. В рамках настоящего проекта впервые будут изучены как функциональные, так и молекулярные механизмы влияния клеточного старения на децидуальную реакцию эСК. В решении поставленных задач будут объединены подходы молекулярной и клеточной биологии, биомедицины, биотехнологии и биоинформатики. С помощью молекулярного клонирования будут созданы генетические конструкции для визуализации и оценки протекания децидуальной дифференцировки и старения эСК. При помощи РНК-секвенирования и последующего биоинформатического анализа будут выявлены и охарактеризованы ключевые молекулярные механизмы, опосредующие нарушение децидуальной дифференцировки стареющих эСК. Также будет изучено влияние предсуществующих в популяции стареющих эСК на децидуализацию нормальных клеток. В частности, будет исследовано паракринное влияние факторов, секретируемых стареющими клетками, на децидуальную реакцию нормальных эСК. При помощи генетически кодируемого биосенсора HyPer будет оценен вклад активных форм кислорода в процесс распространения старения в популяции эСК и нарушения их децидуальной дифференцировки. По результатам этих экспериментов впервые будут разработаны 2D- и 3D-модели нарушенной децидуализации.
Нормальное протекание децидуализации имеет существенное значение для последующей успешной имплантации. В связи с этим, роль старения эСК будет проанализирована также и на модели имплантации в условиях in vitro при совместном культивировании эСК и клеток хориокарциномы человека. Помимо экспериментов in vitro будет разработана мышиная модель травматической индукции децидуа при псевдобеременности, имитирующая децидуализацию эндометрия in vivo. Далее будут подобраны оптимальные параметры для создания мышиной модели нарушенной децидуализации и верифицирована роль стареющих клеток в такой модели. Использование всех перечисленных моделей и подходов позволит провести многоуровневый анализ роли стареющих эСК в децидуализации эндометрия.
Результаты этих исследований послужат базисом для реализации основной задачи данного проекта, а именно разработки совершенно новой стратегии, направленной на улучшение рецептивных свойств эндометрия посредством таргетной элиминации стареющих клеток. Сегодня в фармакологии активно развивается целое направление по созданию лекарственных средств нового класса – сенолитиков, способных избирательно инициировать гибель стареющих клеток. В рамках настоящего проекта для направленного удаления стареющих эСК предполагается использовать особый проникающий в клетки пептид – FOXO4 D-Retro-Inverso (Baar et al., 2017). Важно подчеркнуть, что предложенный подход, основанный на использовании FOXO4-пептида для направленного удаления стареющих эСК, является абсолютно новым и будет впервые использован для улучшения рецептивных свойств эндометрия. Функциональное значение направленной элиминации стареющих клеток как подхода для восстановления рецептивных свойств эндометрия будет впервые оценено как на клеточных 2D- и 3D-моделях, так и на животных моделях нарушенной децидуализации.
Учитывая значимость проблемы многократных неудач имплантации в вопросе женского бесплодия, настоящий проект обладает высокой степенью актуальности и несомненной практической значимостью. Предлагаемый подход в перспективе может позволить увеличивать шансы успешной имплантации, как в случаях привычного невынашивания беременности, так и при многократных неудачных попытках ЭКО. Предполагается, что результаты наших исследований послужат фундаментальным базисом для последующих клинических испытаний в области женской репродуктологии.
Список использованных библиографических источников представлен в отдельном файле, прикрепленном к настоящей заявке.
Ожидаемые результаты
Ключевые результаты, которые мы планируем получить в ходе реализации проекта, заключаются в создании адекватной клеточной модели, отражающей нарушения рецептивности эндометрия, научную основу которой составят молекулярные механизмы взаимосвязи клеточного старения и децидуализации эндометрия, а также в разработке стратегии, направленной на улучшение рецептивных свойств эндометрия посредством таргетной элиминации стареющих эндометриальных стромальных клеток. Таким образом, в рамках заявленного проекта планируется получение следующих результатов:
– Будет определена способность состаренных эСК дифференцироваться в децидуальном направлении. Ожидается, что способность стареющих эСК к децидуальной дифференцировке будет нарушена.
– При помощи РНК-секвенирования и последующего биоинформатического анализа будут исследованы профили экспрессии генов нормальных и стареющих эСК до и после индукции децидуальной дифференцировки. Ожидается, что такой подход позволит выявить и охарактеризовать ключевые молекулярные механизмы, опосредующие нарушение децидуальной дифференцировки стареющих эСК.
– Будет выяснен вклад предсуществующих в клеточной популяции старых эСК в динамику децидуализации нормальных эСК. С этой целью будут созданы две репортерные трансгенные системы, позволяющие по интенсивности флюоресценции оценивать (1) прогрессию децидуальной дифференцировки и (2) появление субопопуляции стареющих клеток при запуске дифференцировки. При помощи лентивирусной трансдукции будут получены линии эСК, стабильно экспрессирующие PRL-mCerry и CLU-BFP трансгены. Генетически-модифицированные эСК будут использованы для постановки экспериментов по ко-культивированию со старыми клетками в 2D и 3D условиях для оценки эффективности децидуальной реакции и характера распределения децидуализирующихся эСК по субпопуляциям. Ожидается, что наличие предсуществующих стареющих клеток в популяции эСК будет, с одной стороны, снижать эффективность децидуальной дифференцировки молодых эСК, а с другой стороны, будет смещать паттерн распределения дифференцирующихся эСК по субпопуляциям.
– Будет оценено влияние факторов, секретируемых стареющими эСК, на процесс децидуализации контрольных клеток. Ожидается, что факторы, секретируемые стареющими эСК, будут оказывать негативное влияние на протекание децидуализации.
– Будет исследована роль активных форм кислорода, в частности перекиси водорода, в качестве одного из факторов, опосредующих влияние предсуществующих стареющих эСК на децидуализацию молодых клеток. Ожидается, что активные формы кислорода, секретируемые стареющими эСК, будут оказывать негативное влияние на протекание децидуализации.
– Будет исследовано влияние стареющих клеток в культуре эСК на рецептивные свойства децидуализирующейся стромы, в частности на восприимчивость децидуальных клеток к паракринным сигналам от «трофобласта», на их миграционную активность, а также на способность этих клеток стимулировать инвазию «трофобласта». Для этого будет разработана модель имплантации in vitro при совместном культивировании эСК и клеток хориокарциномы человека. Построенная таким образом модель имплантации in vitro позволит изучить взаимодействие трофобласт-децидуа и понять, влияет ли старение эСК на процесс имплантации в условиях, наиболее приближенных к физиологическим. Ожидается, что предсуществующие стареющие эСК будут нарушать адекватное взаимодействие трофобласт-децидуа.
– Будет адаптирована мышиная модель, наиболее точно имитирующая децидуализацию эндометрия in vivo. В частности, будут подобраны оптимальные условия для индукции псевдобеременности и последующего запуска децидуализации у животных. В такой модели предполагается оценить наличие стареющих клеток в строме эндометрия до и после индукции децидуализации. С этой целью гистологические срезы эндометриальной ткани до и после запуска децидуализации будут проанализированы на наличие маркеров клеточного старения.
– Будет создана мышиная модель нарушенной децидуализации на основе модели повреждения эндометрия введением 95% этанола в полости обоих рогов матки. Необходимым условием такой модели будет являться нарушение процесса имплантации и, как следствие, бесплодие животного. На гистологических срезах эндометриальной ткани, полученных от животных с поврежденным эндометрием, по наиболее характерным маркерам будет оценено появление стареющих клеток.
– Будет исследована возможность восстановления рецептивных свойств поврежденного эндометрия посредством направленной элиминации стареющих эндометриальных стромальных клеток. Для таргетного удаления стареющих клеток будет использован особый липофильный проникающий в клетки пептид FOXO4 D-Retro-Inverso (FOXO4-пептид). Начальные эксперименты по направленному удалению стареющих клеток будут проведены в культуре децидуализирующихся эСК при использовании 2D- и 3D- клеточных моделей. Ожидается, что предварительная элиминация стареющих эСК из популяции при предобработке FOXO4-пептидом будет способствовать восстановлению нормальной децидуальной реакции клеток. Далее эффективность работы FOXO4-пептида будет подтверждена на нарушенной модели имплантации in vitro. Предполагается, что предобработка культур эСК данным пептидом должна положительно влиять на хемотаксическую миграцию децидуализирующихся клеток к клеткам хориокарциномы, а также способствовать росту числа прикрепившихся трофобластов к монослою децидуализирующихся эСК и инвазии клеток хориокарциномы в структуру монослоя. И, наконец, эффективность подхода таргетной элиминации стареющих клеток для улучшения рецептивных свойств эндометрия будет подтверждена на мышиной модели повреждения эндометрия по частоте наступления беременности и по количеству потомства.
По результатам проекта планируется серия публикаций в журналах, индексируемых в Web of Science и Scopus.
Ожидается, что результаты, полученные в ходе выполнения проекта, во-первых, внесут вклад в понимание фундаментальных механизмов взаимосвязи старения эСК и процессов децидуализации и имплантации, во-вторых, позволят создать клеточные модели, отражающие нарушение рецептивных свойств эндометрия, в-третьих, позволят разработать подход для восстановления рецептивности эндометрия. В перспективе при клинической адаптации результаты этого проекта могут принести практическую пользу в борьбе с такой социально-значимой проблемой как женское бесплодие. Таким образом, сам проект полностью соответствует направлению по развитию высокотехнологичного здравоохранения в рамках Стратегии научно-технического развития Российской Федерации.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Глобальной целью настоящего проекта является разработка стратегии, направленной на улучшение рецептивных свойств эндометрия, которая при последующей клинической адаптации может быть использована для решения ряда конкретных проблем в области вспомогательных репродуктивных технологий и лечения женского бесплодия, включая повышение эффективности циклов ЭКО и снижение процента женщин, страдающих привычными невынашиваниями беременности. Фундаментальную основу разрабатываемого подхода составляет гипотеза о негативном влиянии клеточного старения эндометриальных стромальных клеток (эСК) на процессы децидуализации и имплантации и вытекающее из этой гипотезы предположение о том, что таргетная элиминация стареющих эСК может способствовать восстановлению рецептивных свойств эндометрия. Предлагаемая концепция была сформулирована на основании тщательного анализа современной литературы, и логика ее «рождения» достаточно полно отражена в нашем обзоре, опубликованном в рамках выполнения настоящего проекта (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31728580).
Работа первого года была направлена на верификацию основополагающего тезиса о существовании взаимосвязи между клеточным старением и децидуализацией эСК. Мы предположили несколько механизмов негативного влияния стареющих эСК на децидуализацию эндометрия. Во-первых, децидуальная дифференцировка самих старых клеток может быть нарушена. Во-вторых, присутствуя в ткани эндометрия, стареющие эСК могут отрицательно влиять на дифференцировку соседних молодых клеток как через межклеточные контакты, так и за счет секретируемых факторов, включая активные формы кислорода.
На начальном этапе исследования мы продемонстрировали, что стареющие эСК не способны адекватно реагировать на индукцию децидуальной дифференцировки. В частности, мы показали, что при запуске дифференцировки стареющие эСК не экспрессировали Е-кадгерин и не претерпевали характерного для децидуализации изменения морфологии с фибробластоподобной на эпителиоподобную, что свидетельствует о нарушении мезенхимально-эпителиального перехода. Более того, индукция дифференцировки в стареющих эСК не приводила к усилению экспрессии транскрипционного фактора FOXO1 и генов-маркеров децидуальной дифференцировки – пролактина и IGFBP1. Соответственно, последующая секреция белков пролактина и IGFBP1 также была снижена. Важно, что в стареющих эСК в ответ на гормональные стимулы мы не выявили усиления экспрессии прогестеронового и эстрагенового рецепторов, которые обуславливают восприимчивость стромы эндометрия к действию стероидных гормонов. Также мы обнаружили, что в старых клетках, в отличие от контрольных, в ответ на индукцию децидуализации рецептор прогестерона не транслоцируется в ядро, где в норме он служит платформой для сборки транскрипционных факторов и, связываясь с промоторными областями децидуальных генов, обуславливает инициацию их транскрипции. Полученные результаты свидетельствуют о нарушенной способности старых эСК к децидуальной дифференцировке. Кроме того, эти данные позволяют предположить, что неспособность старых эСК адекватно реагировать на децидуальные стимулы, по крайней мере частично, обусловлена сниженной восприимчивостью старых клеток к действию стероидных гормонов. С одной стороны, это происходит из-за недостаточной экспрессии прогестеронового и эстрагенового рецепторов, а с другой стороны, ввиду того, что рецептор прогестерона не перемещается в ядро, что, в свою очередь, негативно регулирует транскрипцию ключевых децидуальных генов – пролактина и IGFBP1.
Для более глубокого представления о возможных молекулярных механизмах нарушения децидуальной дифференцировки эСК при старении нами был проведен полнотранскриптомный анализ. Для первичной оценки мы провели глобальное сравнение всех образцов при помощи иерархической кластеризации матрицы дистанций между образцами и анализа главных компонент. Такое представление данных позволило выявить отчетливую разницу между паттернами экспрессии в молодых и старых эСК как до индукции дифференцировки, так и на 4 и 8 сутки децидуализации. Судя по сдвигу паттернов экспрессии, можно сделать однозначный вывод – в ответ на действие гормонов старые эСК претерпевают изменения, однако эти изменения значительно менее выражены, чем в контрольных эСК. Анализ дифференциальной экспрессии генов в молодых и старых эСК на 8 день после индукции дифференцировки выявил статистически значимые отличия в экспрессии более чем 3 000 генов (Wald test p-value < 0.05, BH p.adj < 0.1), из них 1674 были up-регулированы, а 1636 down-регулированы в старых клетках относительно молодых. Важно, что среди генов, down-регулированных в старых эСК на 8 день дифференцировки, мы обнаружили ключевые гены децидуальных клеток, включая пролактин и IGFBP1, LEFTY2, IL11, SCARA5, CLU. В тоже время, среди up-регулированных генов мы выявили ген CDKN1A, обуславливающий блок клеточного цикла в старых эСК, гены, кодирующие экспрессию важнейших SASP-компонентов и белков экстраклеточного матрикса MMP3, MMP12, CCL2, CCL7, COL12A1, COL8A1, COL27A1, COL8A2, а также новый маркер старения DPP4. Функциональная аннтоация генов, up-регулированных в стареющих эСК, на 8 день дифференцировки выявила активацию сигнальных путей, связанных с организацией экстраклеточного матрикса, регуляцией пролиферации эпителиальных клеток, регуляцией клеточной адгезии и хемотаксиса. Полученные результаты однозначно свидетельствуют в пользу нарушенной способности стареющих эСК к децидуальной дифференцировке и позволяют предполагать, что старые клетки могут влиять на аттракцию и проникновение маточных натуральных киллеров в строму эндометрия, а также могут нарушать имплантацию бластоцисты, влияя на ее оппозицию, адгезию и инвазию. Соответственно, присутствие стареющих эСК в строме эндометрия может приводить к нарушению рецептивности ткани.
Согласно нашему предположению, сниженная способность стареющих эСК дифференцироваться в децидуальном направлении может быть не единственным последствием их присутствия в ткани эндометрия. Для подтверждения этой идеи мы оценили вклад предсуществующих в клеточной популяции старых эСК в динамику децидуализации контрольных клеток. Для удобства анализа децидуального ответа клеток мы разработали специальную генетически-кодируемую репортерную систему. При помощи молекулярного клонирования мы заменили последовательность UbC промотора в backbone лентивекторе pUltra-Hot (https://www.addgene.org/24130/) на амплифицированный с геномной ДНК фрагмент дистального промотора гена пролактина. Необходимо отметить, что клонированная последовательность содержит в себе особый транспозон MER20, который локализован в промоторных областях не только пролактина, но и множества других генов, участвующих в регуляции децидуального ответа эндометрия. Таким образом, созданная нами репортерная система позволяет оценивать некий интегральный децидуальный ответ эСК по флуоресценции mCherry. Для последующей работы при помощи лентивирусной трансдукции мы получили линии генетически-модифицированных эСК, стабильно экспрессирующих PRL-mCherry трансген. Важно, что для определения вирусного титра мы воспользовались подходом геномного функционального титрования при помощи ПЦР в реальном времени, что позволило нам получить генетически-модифицированные линии эСК с эквивалентным количеством интеграций таргетной последовательности в геном. Используя PRL-mCherry конструкцию, мы оценили влияние предсуществующих стареющих эСК на децидуализацию контрольных клеток в 2D и 3D условиях культивирования. Мы показали, что предсуществующие стареющие эСК негативно влияют на дифференцировку молодых клеток, о чем свидетельствовало снижение уровня флуоресценции mCherry в молодых дифференцирующихся эСК, ко-культивировавшихся со старыми клетками. Причем негативное влияние, выявленное при ко-культивировании молодых и старых клеток в монослое (2D условия), оказалось еще более выраженным при ко-культивировании клеток в состоянии сфероидов (3D условия). Таким образом, нам удалось обнаружить еще один механизм взаимосвязи между клеточным старением и децидуализацией эСК, а именно мы подтвердили, что, присутствуя в ткани эндометрия, старые эСК могут негативно влиять на дифференцировку «здоровых» клеток микроокружения.
Наряду с сохранением жизнеспособности и метаболической активности старые клетки характеризуются также и высокой секреторной активностью. При этом состав факторов, которые продуцируют старые клетки (senescence-associated secretory phenotype, SASP), существенно отличается от такового в контрольных клетках (https://www.aging-us.com/article/102441/text). Согласно нашему предположению, измененная секреторная активность может быть еще одним механизмом реализации негативного влияния стареющих эСК на децидуализацию контрольных клеток. Для проверки этой гипотезы мы оценили ключевые параметры децидуальной дифференцировки эСК при культивировании в среде, содержащей факторы, секретированные стареющими эСК. Согласно нашим ожиданиям, в присутствии SASP-факторов мы не наблюдали необходимого изменения фибробластоподобной морфологии на эпителиоподобную, более того, мы обнаружили сниженную экспрессию FOXO1 и IGFBP1. Используя эСК, экспрессирующие PRL-mCherry, мы показали, что при индукции дифференцировки в среде, содержащей SASP-факторы, уровень экспрессии пролактина был заметно ниже, о чем свидетельствовало уменьшение интенсивности флуоресценции mCherry. Еще одним важнейшим компонентом, продуцируемым стареющими клетками, является внеклеточный матрикс (ВКМ), состав и жесткость которого также существенно меняются при старении клеток. Мы дополнительно проанализировали влияние компонентов ВКМ от старых клеток на дифференцировку молодых эСК. Для этого мы высевали эСК, экспрессирующие PRL-mCherry, на децеллюляризированный матрикс контрольных или старых эСК и оценивали децидуальную реакцию клеток. При индукции дифференцировки на ВКМ от старых клеток мы наблюдали снижение флуоресцентного сигнала в эСК, что свидетельствует о нарушении децидуальной дифференцировки. Помимо белков, микроРНК и экстраклеточных везикул стареющие клетки могут также секретировать активные формы кислорода (АФК). В связи с этим мы проверили еще одно предположение: могут ли стареющие эСК, продуцирующие и секретирующие повышенные количества АФК, сдвигать физиологически релевантный редокс-баланс в молодых эСК и нарушать таким образом их способность к децидуализации. В первую очередь, используя флуоресцентный краситель H2DCF-DA, мы показали, что стареющие эСК действительно характеризуются повышенным уровнем внутриклеточных АФК, причем как в нативном состоянии, так и после индукции децидуальной дифференцировки. Используя генетически-модифицированные эСК, экспрессирующие биосенсор пероксида водорода HyPer, мы показали, что в ответ на индукцию дифференцировки уровень Н2О2 в старых клетках был существенно выше, чем в контрольных клетках. Далее при помощи Amplex Red мы установили, что стареющие эСК экскретируют во внеклеточное пространство заметно большие количества Н2О2, чем контрольные клетки. И, наконец, мы выявили рост уровня внутриклеточного Н2О2 в процессе дифференцировки молодых HyPer-экспрессирующих эСК при их ко-культивировании со старыми клетками. Эти результаты наряду с данными, описанными выше, демонстрирующими снижение дифференцировочной способности молодых эСК при ко-культивировании со старыми клетками, подтверждают, что пероксид водорода, продуцируемый и секретируемый стареющими эСК, может проникать в соседние молодые эСК и, по крайней мере частично, обуславливать негативное влияние стареющих эСК на децидуализацию молодых клеток.
Таким образом, научные результаты, полученные за отчетный период, однозначно свидетельствуют о негативном влиянии стареющих эСК на децидуализацию стромального компартмента эндометрия и демонстрируют перспективность предлагаемого подхода восстановления рецептивности эндометрия посредством таргетной элиминации этих клеток.
Публикации
1. Грюкова А.А., Дерябин П.И., Шатрова А.Н., Бурова Е.Б., Северино В., Фарина А., Никольский Н.Н., Бородкина А.В. Molecular basis of senescence transmitting in the population of human endometrial stromal cells Aging (Albany NY), Vol. 11, No 21, p. 9912-991 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.18632/aging.102441
2. Дерябин П., Грюкова А., Никольский Н., Бородкина А. The link between endometrial stromal cell senescence and decidualization in female fertility: the art of balance Cellular and Molecular Life Sciences, 77(7):1357-1370 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1007/s00018-019-03374-0
3. А.А. Грюкова, П.И. Дерябин, А.Н. Шатрова, А.В. Бородкина PAI-1 is a master-regulator of senescence transmission within the population of endometrial stromal cells ICSA Abstract Book, p.113 (год публикации - 2019)
4. А.А. Грюкова, П.И. Дерябин, А.Н. Шатрова, Н.Н. Никольский, А.В. Бородкина Роль pai-1 в распространении старения в популяции эндометриальных стромальных клеток Гены и Клетки, Том XIV, № 3, стр. 34 (год публикации - 2019)
5. А.А. Грюкова, П.И. Дерябин, Е.Ю. Комарова, И.В. Гужова, Б.А. Маргулис, А.В. Бородкина The role of Hsp70 in transition of mesenchymal stromal cells towards cancer-associated fibroblasts Cell Death Discovery, Selected Conference Abstracts from “The Regulation of Proteostasis in Cancer”. Cell Death Discov. 6, p. 6. (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1038/s41420-020-0248-5
6. П.И. Дерябин, А.А. Грюкова, А.Н. Шатрова, Н.Н. Никольский, А.В. Бородкина Разработка генетически-кодируемой репортерной системы для оценки рецептивности эндометрия Гены и Клетки, Том XIV, № 3, стр. 101 (год публикации - 2019)
7. П.И. Дерябин, А.А. Грюкова, А.Н. Шатрова, Н.Н. Никольский, А.В.Бородкина Фундаментальные механизмы взаимосвязи клеточного старения и децидуализации эндометриальных стромальных клеток в контексте женской репродуктивности Гены и Клетки, Гены и Клетки, Том XIV, Приложение 2019, стр. 76 (год публикации - 2019)
8. Павел Дерябин, Анастасия Грюкова, Алла Шатрова, Александра Бородкина The linkage between endometrial cell senescence and decidualization in female fertility ICSA Abstract Book, p. 109 (год публикации - 2019)
Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Фундаментальная цель настоящего проекта заключается в изучении роли старения эндометриальных стромальных клеток (эСК) в функционировании ткани эндометрия, в частности, в процессах децидуализации и имплантации. Представление о том, что такое клеточное старение и какова его роль на тканевом, органном и организменном уровнях, можно получить из небольшого анимационного видеоролика, подготовленного с участием А.В. Бородкиной в рамках проекта «ПРОСТО. Генетика», осуществляемого Министерством высшего образования и науки РФ (https://www.youtube.com/watch?v=1OnRqIFZyEA&t=1s). Также небольшой фрагмент о работе А.В. Бородкиной в области клеточного старения можно найти в специальном выпуске программы «Доброе утро» («Женщины в науке») на Первом канале (https://www.1tv.ru/shows/dobroe-utro/reportazh/zhenshiny-v-nauke-dobroe-utro-fragment-vypuska-ot-16-03-2021). Исходя из сути феномена клеточного старения, мы предполагаем, что стареющие эСК могут негативно влиять на нормальное функционирование ткани эндометрия. В случае если наша гипотеза получит экспериментальное подтверждение, мы планируем использовать сенолитики для таргетной элиминации стареющих клеток с целью восстановления рецептивных свойств эндометрия. При последующей клинической адаптации такой подход может быть использован для решения ряда конкретных проблем в области вспомогательных репродуктивных технологий и лечения женского бесплодия, включая повышение эффективности циклов ЭКО и снижение процента женщин, страдающих привычными невынашиваниями беременности. В очень сжатой и доступной форме суть нашего предположения изложена на сайте ТАСС в разделе «Наука» (https://nauka.tass.ru/nauka/11065523).
При реализации задач первого года мы экспериментально установили, что старение эСК может негативно сказываться на процессе децидуализации. Так, мы показали, что сами стареющие клетки утрачивают способность децидуализироваться при действии гормональных стимулов. Более того, стареющие эСК могут негативно влиять на функционирование молодых клеток микроокружения, вызывая в молодых клетках паракринное старение и/или непосредственно нарушая их децидуализацию. Важно, что негативное влияние стареющих эСК на микроокружение может оказываться как локально, при формировании клеточных контактов, так и на некотором удалении, за счет паракринного влияния растворимых факторов, которые они секретируют.
Установив факт и изучив механизмы негативного влияния стареющих эСК на децидуализацию, в текущем году мы перешли к следующему этапу исследования. В норме децидуализация обуславливает успешное протекание одного из важнейших ранних этапов беременности – имплантации. При имплантации децидуализирующиеся эСК вступают в активное взаимодействие с трофоэктодермой бластоцисты. В связи с этим, одной из основных задач этого года было исследование влияния стареющих эСК на различные этапы имплантации. С этой целью мы разработали in vitro модель имплантации, основанную на ко-культивировании децидуализирующихся молодых или старых эСК и клеток хориокарциномы человека линии BeWo b30, которые близки по своим свойствам к клеткам трофэктодермы. В первую очередь, оценивая миграционные свойства клеток, мы показали, что стареющие эСК могут негативно влиять на оппозицию бластоцисты, другими словами, за счет измененной секреторной активности стареющие эСК могут нарушать ориентацию бластоцисты в полости матки относительно ткани эндометрия. Далее мы проанализировали влияние стареющих эСК на адгезию и инвазию модельных бластоцист, сформированных из BeWo клеток. Мы обнаружили, что стареющие эСК нарушают нормальное протекание также и этих этапов имплантации. Суммируя результаты, полученные при реализации этой задачи, мы показали, что стареющие эСК могут отрицательно влиять не только на децидуализацию ткани эндометрия, но и негативно сказываться непосредственно на процессе имплантации бластоцисты. Интересно, что предпосылки для этих экспериментальных результатов были предварительно получены нами in silico в процессе сравнительного анализа транскриптомов молодых и старых эСК, свидетельствующего о существенной модуляции процессов организации экстраклеточного матрикса, сопровождающих децидуализацию стареющих эСК.
Получив подтверждение нашей гипотезы в экспериментах in vitro, в рамках второй задачи этого года мы перешли к разработке релевантных in vivo моделей. Во-первых, нам необходимо было смоделировать децидуализацию на мышиной модели. Стоит отметить, что это является весьма нетривиальной задачей, поскольку физиология эндометрия грызунов и человека существенно отличается. Так, для грызунов, как для большинства млекопитающих, характерен не менструальный, а эстральный цикл, состоящий 4 фаз: проэструса, эструса, метэструса, диэструса. Именно в фазе эструса происходит овуляция и грызуны способны к проявлению половой активности. Важно, что децидуальная трансформация эндометрия у мышей запускается только после наступления беременности и имплантации бластоцисты в толщу эндометрия, тогда как у человека такая трансформация происходит в каждом цикле и не зависит от имплантации. Таким образом, для создания релевантной модели децидуализации in vivo нам необходимо было последовательно сымитировать спаривание, оплодотворение и имплантацию. Для индукции псевдобеременности у животных в фазе эструс мы проводили раздражение влагалища мыши электрическим током. Затем при помощи введения шелковой прошивной нити в полость матки имитировали повреждение эндометрия при имплантации эмбриона и, таким образом, запускали децидуализацию эндометрия. В результате этих манипуляций мы детектировали значительное увеличение рогов матки при макроскопическом исследовании, признаки децидуальной трансформации эндометрия мыши при гистологическом исследовании и существенное повышение экспрессии ключевого гена-маркера децидуализации PRL. Таким образом, в ходе реализации этой задачи нам удалось разработать in vivo модель децидуализации.
На следующем этапе мы перешли к созданию мышиной модели повреждения эндометрия. Согласно нашему предположению, в результате повреждения в эндометрии могут появиться стареющие эСК, которые, в свою очередь, будут негативно сказываться на последующем протекании децидуализации и имплантации. Повреждение эндометрия осуществляли пульсовым введением этанола в один из рогов матки. Для последующего анализа децидуальной реакции поврежденного таким образом эндометрия через 14 дней после повреждения у животных производили индукцию псевдобеременности и децидуализацию эндометрия описанным выше способом. Методами морфологического и гистологического исследования мы показали, что в роге, в котором проводилось повреждение этанолом, децидуальная реакция проявляется значительно слабее, чем в контрольном. Кроме того, спаривание самок через 14 дней после повреждения эндометрия показало уменьшение количества плодов в поврежденном роге матки, что свидетельствует о нарушении процесса имплантации. Таким образом, нам удалось смоделировать повреждение ткани эндометрия, приводящее к нарушению децидуализации и имплантации. Для верификации нарушенной децидуализации в поврежденном роге дополнительно мы продемонстрировали, что уровень экспрессии PRL при децидуализации поврежденного рога был существенно ниже, чем таковой в контрольном роге. И, наконец, мы обнаружили увеличение экспрессии генов-маркеров стареющих клеток CDKN2A, CDKN2B и IL6 в поврежденном роге. Полученные результаты свидетельствуют в пользу появления стареющих клеток в созданной нами мышиной модели нарушенной децидуализации.
Также в рамках текущего периода нам удалось предложить клиническую адаптацию генетически-кодируемой репортерной системы для оценки эффективности децидуальной реакции, разработанной нами в прошлом году. А именно, мы предложили использовать созданную нами конструкцию для пациент-специфического подбора прогестагенов для поддержки лютеиновой фазы в протоколе ЭКО. Такой персонализированный подход может в перспективе повысить шансы успешной имплантации и, соответственно, эффективность циклов ЭКО. Подробное описание фундаментальной основы разработанной генетической конструкции и деталей возможной клинической адаптации созданной тест-системы представлены в нашей статье, опубликованной в текущем году (https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.624053/full).
Таким образом, научные результаты, полученные за отчетный период, свидетельствуют о негативном влиянии стареющих эСК на процесс имплантации и подчеркивают целесообразность предлагаемого подхода восстановления рецептивности эндометрия посредством таргетной элиминации этих клеток.
Публикации
1. П.И. Дерябин, А.В. Бородкина. Cнижение эффективности репарации и антиоксидантной защиты способствует накоплению повреждений ДНК при старении клеток «Цитология» и англоязычная версия “Cell and Tissue Biology”, - (год публикации - 2021)
2. П.И. Дерябин, А.П. Домнина, И.В. Горелова, М.В. Рулев, М.А. Петросян, Н.Н. Никольский, А.В. Бородкина "All-In-One" Genetic Tool Assessing Endometrial Receptivity for Personalized Screening of Female Sex Steroid Hormones Frontiers in Cell and Developmental Biology, 9:624053 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3389/fcell.2021.624053
3. А.В. Бородкина, П.И. Дерябин, А.А. Грюкова, А.Н. Шатрова, А.П. Домнина, И.В. Горелова, М.В. Рулев, Н.Н. Никольский Накопление стареющих стромальных клеток обуславливает дисфункцию эндометрия Гены и клетки, Том XV, № 3, Приложение, 2020, стр. 7 (год публикации - 2020)
4. Грюкова А.А., Дерябин П.И., Шатрова А.Н., Бородкина А.В. Ionophore nigericin as potential agent for targeted elimination of senescent endometrial stromal cells Abstract book “Molecular mechanisms of autophagy in diseases”, Abstract book, p. 20 (год публикации - 2020)
Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий проект нацелен на разработку совершенно новой стратегии, направленной на улучшение рецептивных свойств эндометрия посредством таргетной элиминации стареющих эндометриальных стромальных клеток (эСК). В работе первых двух лет мы экспериментально подтвердили факт негативного влияния стареющих эСК на функционирование эндометриальной стромы. В частности, мы показали, что стареющие эСК утрачивают способность адекватно реагировать на гормональную стимуляцию, что обуславливает нарушение их тканеспецифичной децидуальной трансформации. Более того, присутствие стареющих клеток может нарушать децидуализацию соседних здоровых клеток микроокружения. Важно, что полноценная децидуальная трансформация функционального слоя эндометрия является критически важной для успешной имплантации эмбриона в ткань эндометрия. И, действительно, используя модель имплантации in vitro, мы продемонстрировали, что присутствие стареющих эСК негативно влияет на оппозицию, адгезию и инвазию модельных бластоцист. Также в рамках предыдущих периодов нам удалось разработать релевантные in vivo модели, в том числе модель повреждения эндометрия, которая, с одной стороны, характеризовалась нарушениями децидуализации и имплантации, а с другой, повышенной экспрессией маркеров клеточного старения. Таким образом, результаты, полученные в предыдущие периоды, экспериментально подтверждают негативное влияние стареющих эСК на функционирование эндометрия и свидетельствуют о целесообразности предлагаемого подхода восстановления рецептивности эндометрия посредством таргетной элиминации стареющих клеток, что и явилось ключевой задачей текущего года.
В качестве подхода для направленного удаления стареющих эСК предполагалось использовать FOXO4-пептид. Этот пептид относят к классу соединений с сенолитической активностью, то есть способных таргетно индуцировать апоптоз в стареющих клетках. Однако, оказалось, что в отношении стареющих эСК FOXO4-пептид не проявляет сенолитических свойств, другими словами это соединение вызывало неселективную гибель как контрольных, так и стареющих эСК. Более того, мы протестировали ряд других соединений, так же относящихся к сенолитикам широкого спектра действия (кверцетин, оуабаин, буфалин) и получили аналогичный результат – ни одно из протестированных соединений не оказывало сенолитического действия на стареющие эСК. Для того чтобы разобраться с молекулярными причинами отсутствия сенолизиса в эСК, нами была проведена дополнительная исследовательская работа, результаты которой опубликованы в журнале Cellular and Molecular Life Sciences (https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x). В рамках этой работы мы показали, что и другие типы мезенхимальных стромальных клеток (МСК) являются нечувствительными к действию сенолитиков. При помощи продвинутого биоинформатического анализа нам удалось выявить фундаментальные отличия в процессах старения клеток разного типа. А именно, мы обнаружили, что клетки чувствительные к сенолизису при старении приобретают проапоптотический профиль, тогда как клетки устойчивые к сенолизису, такие как эСК и другие типы МСК, при старении наоборот приобретают выраженный антиапоптотический профиль. Раскрыв таким образом молекулярные причины отсутствия сенолизиса в стареющих эСК, мы пришли к заключению, что попытка направленного удаления стареющих эСК при помощи уже существующих сенолитических соединений с известными механизмами действия, так или иначе направленными на индукцию апоптоза, является нецелесообразной. Исходя из полученных нами данных, для направленного удаления стареющих эСК требуется разработать новый подход для поиска соединений, способных обеспечить их высокоспецифичный сенолизис, что однако выходит за рамки задач настоящего проекта.
Принимая во внимание полученные данные, нами была предложена альтернативная стратегия для восстановления рецептивных свойств эндометрия, основанная на частичной отмене фенотипических проявлений старения клеток, а именно на использовании сеноморфиков. В отличие от сенолитиков, сеноморфики не влияют на жизнеспособность стареющих клеток, однако оказывают воздействие на их фенотип и уменьшают секрецию SASP факторов. И, действительно, мы обнаружили, что применение таких сеноморфиков как метформин и рапамицин позволило частично обратить фенотип стареющих эСК, о чем свидетельствовало снижение ассоциированной со старением активности бета-галактозидазы, уменьшение клеточной гипертрофии и автофлуоресценции (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.07.19.452880v1). Более того, оказалось, что предварительная обработка стареющих эСК метформином частично отменяла их негативное влияние на децидуализацию контрольных клеток в моделях ко-культивирования и на имплантацию модельных бластоцист, что подтверждает возможность восстановления рецептивных свойств поврежденного эндометрия посредством уменьшения выраженности фенотипа стареющих эСК при действии сеноморфиков, по крайней мере, в условиях in vitro (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.07.19.452880v1). На заключительном этапе исследования мы валидировали полученные результаты на созданной нами in vivo модели повреждения эндометрия. Мы показали, что внутрибрюшинное введение метформина после повреждения эндометрия способствовало заметному увеличению количества плодов в рогах матки экспериментальных животных по сравнению с контрольной группой животных, которым вводили физиологический раствор. Эти результаты однозначно свидетельствуют в пользу значительного улучшения рецептивных свойств эндометрия при помощи сеноморфиков.
Суммируя результаты, полученные за отчетный период, можно заключить, что использование сеноморфиков, снижающих фенотипические проявления стареющих эСК, может рассматриваться как перспективная стратегия для восстановления рецептивных свойств эндометрия, которая при последующей клинической адаптации может быть использована для решения ряда конкретных проблем в области вспомогательных репродуктивных технологий и лечения женского бесплодия, включая повышение эффективности циклов ЭКО и снижение процента женщин страдающих многократными неудачами имплантации. Необходимо подчеркнуть, что использование сенолитиков, способных направленно удалять стареющие эСК, может приводить к еще более выраженному положительному влиянию на функционирование эндометрия, так как позволит не просто уменьшить фенотипические проявления клеточного старения, но и удалить такие дефектные клетки из ткани, что делает задачу поиска и разработки высокоспецифичных сенолитиков для эСК крайне актуальной.
Публикации
1. - Stromal cell senescence contributes to impaired endometrial decidualization and defective interaction with trophoblast cells -, - (год публикации - )
2. Дерябин П.И., Шатрова А.Н., Грюкова А.А. Apoptosis resistance of senescent cells is an intrinsic barrier for senolysis induced by cardiac glycosides Cellular and Molecular Life Sciences, 78(23):7757-7776 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x.
3. Шатрова А.Н., Бурова Е.Б., Харченко М.В., Смирнова И.С., Люблинская О.Г., Никольский Н.Н., Бородкина А.В. Outcomes of Deferoxamine Action on H 2 O 2-Induced Growth Inhibition and Senescence Progression of Human Endometrial Stem Cells International Journal of Molecular Sciences, 22(11):6035 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/ijms22116035
4. А. Грюкова, П. Дерябин, А. Шатрова, И. Гужова, Б. Маргулис, А. Бородкина Hsp70 mediates viability of senescent endometrial stromal cells FEBS Open Bio, 11 (Suppl. 1) (2021) 103–507 DOI: 10.1002/2211-5463.13205, p. 336 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1002/2211-5463.13205
5. П. Дерябин, А. Грюкова, А. Шатрова, А. Бородкина Senescence of progenitor cells mediates dysfunction of endometrial tissue FEBS Open Bio, 11 (Suppl. 1) (2021) 103–507 DOI: 10.1002/2211-5463.13205, p. 336 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1002/2211-5463.13205
6. - Ученые опровергли общепринятый принцип действия препаратов против клеточного старения Пресс-служба РНФ, 20.12.2021 (год публикации - )
Возможность практического использования результатов
В ходе выполнения настоящего проекта на разнообразных клеточных и животных моделях нами были получены экспериментальные результаты, свидетельствующие о том, что воздействие на фенотип стареющих эндометриальных стромальных клеток (эСК) при помощи сеноморфиков способствует восстановлению рецептивных свойств эндометрия. При последующей клинической адаптации этот подход (предполагающий местное введение сеноморфиков во время пролиферативной фазы менструального цикла непосредственно перед овуляцией в естественном или стимулированном цикле) может быть использован для повышения эффективности циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и снижения процента женщин страдающих многократными неудачами имплантации, а также для решения ряда других проблем женской репродукции, связанных с нарушенной имплантацией.
Кроме того, в рамках данного проекта нами была разработана репортерная система для оценки интегрального децидуального ответа (PRL-mCherry). Эта система может быть использована для пациент-специфического подбора прогестагенов для гормональной поддержки лютеиновой фазы, которая является неотъемлемой частью рутинного протокола ЭКО. В ходе лютеиновой фазы цикла происходит децидуальная трансформация эндометрия, критически важная для последующей имплантации эмбриона. Гормональная стимуляция овуляции в ходе ЭКО приводит к недостаточности лютеиновой фазы, что, в свою очередь, может негативно сказываться на имплантации. В связи с этим, сегодня поддержка лютеиновой фазы при помощи натурального прогестерона или его синтетических аналогов включена в протокол ЭКО. Тем не менее, назначение того или иного гормонального препарата до сих пор остается эмпирическим. Разработанная нами тест-система позволит осуществлять пациент-специфический выбор прогестагена, способствующего наиболее адекватной трансформации эндометрия. Такой персонализированный подход может в перспективе повысить шансы успешной имплантации и, соответственно, эффективность циклов ЭКО.