Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В течение первого этапа выполнения работ по проекту членами коллектива проведена масштабная научно-исследовательская работа в фондах крупнейших Гербариев – LE, LECB (Санкт-Петербург, Россия), M, MSB (Мюнхен, Германия), MW (Москва, Россия), NS (Новосибирск, Россия). В результате критической ревизии гербарных коллекций (более чем 4500 гербарных листов) переопределена таксономическая принадлежность гербарных образцов и уточнены данные по распространению представителей исследуемой группы злаков. Результаты выполненной работы были обобщены с данными, полученными ранее при работе с личными сборами (3406 гербарных листов) и материалами гербарных коллекций – AA, B, BM, BRNU, E, FR, FRU, G, GAT, GFW, GOET, IFP, K, KAS, KFTA, KHOR, KRA, KRAM, KUN, KUZ, MOIS, P, PE, PR, PRC, TAD, TASH, TK, UPS, W, WA, WU, Z (более 6000 гербарных листов). Выявлено, что на территории Центральной Азии произрастает 98 таксонов, включая 72 вида, 4 подвида и 22 разновидности, из которых 23 имеют гибридное происхождение (предположение выдвинуто на основании морфологического изучения). Так же проанализировано распределение числа видов по странам Центральной Азии: Казахстан – 42, Таджикистан – 40, Киргизия – 35, Китай – 38. В результате выполнения работ по проекту описано 13 новых таксонов, из них: 4 новых для науки вида, 1 подвид, 8 разновидностей. Кроме того, обнародовано 12 новых номенклатурных комбинаций. С учетом проведенной таксономической ревизии составлен новый ключ для определения видов ковылей Центральной Азии. Проанализирована степень эндемичности среди представителей рода Stipa на исследуемой территории. Из 98 таксонов (видов и подвидов) Stipa в Центральной Азии, 41 – является эндемичным, и их распространение ограничено либо конкретной страной или горным массивом, либо регионом исследования в целом. К субэндемикам нами отнесено 8 видов: Stipa himalaica, S. kirghisorum, S. korshinskyi, S. lingua, S. roborowskyi, S. tianschanica, S. Trichoides, S. turkestanica. Наибольшее количество эндемичных таксонов Stipa отмечается для территорий Южного Казахстана (21 таксон), Таджикистана (20 таксонов), Кыргызстана (14 таксонов) и Узбекистана (7 таксонов). Также в рамках проекта проведен поясно-зональный и экологический анализы ковылей Центральной Азии. Проведен сравнительный анализ эффективности применения двух методов молекулярно-генетического анализа: (1) с использованием секвенирования по Сэнгеру хлоропластных локусов, заявленных в первоначальном плане исследования; (2) с использованием маркеров DArT. До настоящего времени метод DArTseq применялся в основном в рамках геномных исследований хозяйственно ценных видов растений, однако за последний год была доказана его эффективность для геномных исследований диких видов. Полученные по проекту результаты применения метода DArTseq, основанного на редукции размера генома при помощи эндонуклеаз рестрикции и последующем секвенировании следующего поколения на платформе Hiseq2500 (Illumina, USA), показали существенное его преимущество перед методом секвенирования по Сэнгеру лимитированного набора локусов. В частности, метод DArTseq способен не только реконструировать филогению рода, но и выявлять таксоны, имеющие гибридное происхождение. В отчетном году проведено исследование, направленное на выявление происхождения эндемичного таксона Stipa ×lazkovii, найденного на южном берегу озера Иссык-Куль (Киргизия). В рамках интегративной таксономии, объединяющей морфологические и молекулярные подходы для подтверждения видовых гипотез, было выдвинуто предположение о гибридной природе Stipa ×lazkovii. Для верификации данного предположения были изучены виды S. krylovii, S. bungeana, S. ×lazkovii, S. breviflora, S. capillata и S. sareptana. На макроморфологическом уровне были проанализированы 22 количественных и 3 качественных признака, традиционно применяемых в ключах и таксономических описаниях видов Stipa. Факторный анализ смешанных данных (FAMD) выявил 6 заметно дифференцированных групп объектов в соответствии с таксономической классификацией исследуемых таксонов. Признаки, оказывающие наибольшее влияние на изменчивость первых трёх осей, были проанализированы с помощью «Notch plots». Были выявлены пять признаков, имеющие значимые различия между средними и убедительные доказательства различающихся медиан в пределах видов S. bungeana, S. krylovii и предполагаемого гибрида Stipa ×lazkovii. Микроморфологический анализ выявил наличие промежуточных характеристик Stipa ×lazkovii между S. bungeana и S. krylovii. Молекулярно-генетический анализ с использованием метода DArTseq выявил 76 604 silicoDArT и 19 133 SNP полиморфных маркеров. Результаты анализа генетической структуры изученных таксонов с использованием (1) метода главных координат (PCoA), (2) fastSTRUCTURE и (3) метода невзвешенных парных групп со средним арифметическим (UPGMA) подтвердили наличие шести заметно дифференцированных групп, а также подтвердили, что все образцы S. ×lazkovii являются гибридами первого поколения между S. bungeana и S. krylovii. Результаты исследований доказали возможность гибридизации между генетически отдалёнными видами ковылей и эффективность применения метода DArTseq для геномных исследований злаков. В связи с этим, считаем уместным и вполне оправданным применение метода DArTseq на следующих этапах выполнения работ по генотипированию в рамках проекта. Так же в отчетном периоде были начаты работы по анализу гибридогенных процессов в комплексе видов S. capillata, S. grandis, S. baicalensis, S. krylovii, в рамках которого был применен алгоритм анализа гибридных комплексов разработанный и успешно опробованный нами на S. ×lazkovii. Для решения этой задачи были отобраны репрезентативные гербарные образцы (всего 556 экземпляров). Из них в молекулярно-генетические исследования были вовлечены 309 образцов. На данном этапе идет обработка полученных результатов и написание статьи. Кроме того, проведены исследования распространения ковылей и составлены точечные карты для 32 видов, на основании информации по 3864 гербарным листам. По завершению работ по проекту весь массив данных будет размещен в Глобальном информационном фонде по биоразнообразию (GBIF). Таким образом, в первый год реализации проекта выполнены все запланированные виды работ. Результаты обобщены и опубликованы в журнале Annals of the Missouri Botanical Garden (Q1). Еще одна обзорная статья "Morphological and genome-wide evidence for natural hybridisation within the genus Stipa (Poaceae)" находится на стадии рецензирования в редакции журнала Scientific Reports группы Nature.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В рамках второго этапа выполнения работ по проекту членами коллектива проведена масштабная научно-исследовательская работа по выявлению гибридов в роде Stipa на основании интегративного подхода. Поскольку современное понимание таксономии Stipa по-прежнему в значительной степени основывается на морфологических признаках, результаты работ по проекту доказывают необходимость применения молекулярно-генетических методов для правильной идентификации таксонов и выявления процессов, лежащих в основе видообразования. Это особенно важно для территории Центральной Азии, где продолжающаяся гибридизация и интрогрессия приводит к образованию особей с промежуточным (смешанным) фенотипом или подобным одному из родительских видов, что затрудняет идентификацию таких таксонов с применением только морфологических признаков. Более того, интегративные исследования доказали, что промежуточные фенотипы между двумя видами не обязательно являются гибридами. Установлено, что некоторые межвидовые гибриды имеют промежуточные признаки между родительскими таксонами, их фенотипические признаки могут перекрываться с признаками неродительских видов, что приводит к ошибочной идентификации. Учитывая данные обстоятельства, в рамках проекта был применен интегративный подход, объединяющий данные по полногеномному анализу и морфологии, чтобы разграничить виды и установить степень гибридизации в роде Stipa. Важным результатом исследования на втором этапе выполнения работ по проекту является оценка дат расхождения видов, полученная на уровне видов и популяций. Установлено, что потенциальное расхождение между S. capillata и S. baicalensis, S. krylovii, S. grandis произошло примерно 0,95 млн лет назад, что аналогично нашей предыдущей оценке – 1,53 млн лет назад на основе NOR региона. Сделан вывод, что диверсификация в пределах видов S. capillata, S. baicalensis, S. krylovii и S. grandis началась около 110–85 тыс. лет назад (95% HPD: 160–50 тыс. лет назад). Этот возраст соответствует периоду между последним межледниковым периодом, начавшимся около 130 тыс. лет назад, и последним ледниковым периодом (LGP), начавшимся около 110 тыс. лет назад. Таким образом, подтверждена гипотеза о том, что климатические изменения во время последней ледниковой эпохи были движущей силой современного распространения ковылей, что в общем является типичным для высших семенных растений. Так же одной из важнейших задач проекта было выявление гибридных комплексов. Проанализирован один из сложнейших комплексов S. capillata, S. grandis, S. baicalensis, S. krylovii, в том числе проведен морфологический и молекулярно-генетический анализ методом DartSeq. Изначально, на основании анализа морфологических признаков и распространения, была высказана гипотеза о том, что S. baicalensis является гибридом, происходящим от комбинации двух из выше перечисленных видов – S. grandis × S. krylovii или S. capillata × S. krylovii. Основываясь на данных SNP, полученных в результате генотипирования, выявлено четыре генетические группы, представляющие отдельные морфологические виды, и доказано, что S. baicalensis является генетически отличным видом, а не таксоном гибридного происхождения, как предполагалось ранее. Установлено наличие гибридов F1 и F2, что указывает на низкий уровень репродуктивной изоляции этих видов. Наличие в природных популяциях особей F2 или более продвинутых поколений гибридов дает основание предположить, что среди гибридов F1 встречаются фертильные особи, способные к половому размножению. Это наблюдение согласуется с нашими предыдущими выводами о гибридизации внутри рода сделанным по итогам первого года выполнения работ по проекту, где прямой подход доказал, что гибридный таксон S. heptapotamica производит фертильные пыльцевые зерна и способен к обратному скрещиванию в основном с одним родительских видов (Nobis et al., 2019). Обнаружены несколько обратных скрещиваний S. baicalensis × S. krylovii и S. grandis × S. krylovii с их родительскими видами, что указывает на возможную интрогрессию между таксонами. Выявлены признаки современного потока генов между популяциями видов из секции Leiostipa. Более того, анализ паттернов BABA / ABBA среди видов выявил признаки прошлой интрогрессии между S. baicalensis и S. krylovii, S. baicalensis и S. grandis, S. krylovii и S. grandis. Принимая во внимание время диверсификации этих видов, можно предположить, что поток генов начался относительно недавно с точки зрения эволюции и, по-видимому, все еще присутствует между S. baicalensis и S. krylovii, а также в паре S. grandis и S. krylovii. В отчетном году получены и интерпретированы данные морфометрического анализа 5 гибридных комплексов: S. consanguinea, S. sczerbakovii, S. sareptana, S. korshinskyi, S. drobovii; исследована их морфологическая изменчивость, определены границы видов, выявлены гибриды. Отобрано 282 образца для молекулярно-генетического анализа. Проведено секвенирование и анализ данных методом DArTseq. На основании анализа маркеров SilicoDArT и SNP доказана гибридная природа S. consanguinea и ее происхождение от S. krylovii x S. glareosa на морфологическом и молекулярно-генетическом уровнях. Так же, проведенный анализ доказал, что S. sczerbakovii на морфологическом и генетическом уровнях идентичен трем другим описанным видам, что позволило свести эти виды в синонимы. Впервые для науки обнаружен гибрид между S. drobovii и S. richteriana, который сейчас находится на стадии описания и обнародования. Проанализированные образцы S. sareptana показали значительную неоднородность данного вида и сложную генетическую структуру, что потребует на следующем этапе вовлечения в молекулярно-генетический анализ большего числа образцов. Проведен анализ комплекса Stipa korshinskyi и интегративный подход позволили установить, что понимаемый под этим видом морфотип представлен двумя гибридами. Получен результат по полногеномному секвенированию S. capillata. Собран «черновой» геном, который будет применен в дальнейшей работе как в рамках проекта, так и в других исследованиях. «Черновой» вариант генома размером около 1004 т.п.о. получен с длиной контига N50 в 351 т.п.н. Всего предсказано 154 755 генов, кодирующих белок, и 94 237 из них – аннотированы. Собранные ядерные, митохондриальные и хлоропластные геномы являются важным источником генетической информации для исследований по филогении и гибридизации ковылей и семейства злаковых в целом. Полученный набор данных необработанных чтений будет доступным и полезным для всех, кто работает с «long-read bioinformatics methods». Таким образом, во второй год реализации проекта выполнены все запланированные виды работ. Результаты обобщены и опубликованы в журнале Scientific Reports группы Nature (Springer Nature, Q1; 5-year Impact Factor – 4.576). Еще две статьи находится на стадии рецензирования в редакции журнала Scientific Reports группы Nature и BMC Plant Biology (Springer Nature, Q1; 5-year Impact Factor – 4.494). Три статьи находятся на стадии оформления результатов.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В ходе выполнения 3-го этапа работ по проекту опубликовано 4 статьи в журналах, индексируемых базами данных Web of Science Core Collection и Scopus, 3 из которых Q1. Освещение в СМИ о ходе реализации проекта представлено 3 новостями. Итоги выполнения работ по проекту освещены в сети Интернет по ссылке: http://herbarium.tsu.ru. Новость о полногеномном секвенировании одного из видов ковыля была опубликована на сайте Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в новостной рубрике: https://minobrnauki.gov.ru/press-center/news/?ELEMENT_ID=37621. Результаты исследований по гранту представлены на международных конференциях: Международной конференции, организованной Американским ботаническим обществом – Botany 2021 и Международной научной конференции «Камелинские чтения» на Алтае». Все запланированные на 2021–2022 годы полевые, лабораторные и камеральные работы выполнены в полном объёме. Полевые исследования проводились в Республике Казахстан, где были обследованы юго-западные районы. Экспедиция по Армении была изменена, связи с нестабильной обстановкой в районе исследования, на Республику Дагестан и Чечня. Так же проведена ревизия гербарных материалов по ковылям Кавказа в Гербарии Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (Санкт-Петербург, Россия). Составлены карты распространения гибридных комплексов S. consanguinea, S. drobovii и S. korshinskyi, с помощью ArcGIS Pro 2.7.1 (ESRI, Redlands, США). Ареалы видов уточнены в рамках ревизии гербарных образцов, хранящихся в фондах: AA, ALTB, B, BM, BRNU, COLO, E, FR, FRU, G, GAT, GFW, GOET, IFP, K, KAS, KFTA, KHOR, KRA, KRAM, KUZ, L, LE, LECB, M, MO, MSB, MW, NY, P, PE, PR, PRC, TAD, TASH, TK, UPS, W, WA, WU и Z. Проведено морфометрическое изучение 463 экземпляров по 33 признакам. Проведен молекулярно-генетический анализ комплексов видов Stipa consanguinea, S. sczerbakovii, S. drobovii, S. sareptana и S. korshinskyi. В результате изучения комплекса видов Stipa drobovii обнаружены экземпляры с промежуточными морфологическими признаками между S. drobovii и S. richteriana. Предположительное гибридное происхождение было доказано и на молекулярно-генетическом уровне, что позволило нам описать новый для науки нотовид Stipa × smelanskyi, который является первым свидетельством отдаленной гибридизации в роде Stipa от морфологически и генетически далеких видов S. richteriana и S. drobovii, представляющие секции Leiostipa и Smirnovia соответственно. Настоящее исследование является первым молекулярным доказательством гибридизации между видами из этих секций. Кроме того, решена сложная и запутанная таксономическая проблема видов родства S. purpurea. При ревизии комплекса видов S. purpurea было обнаружено, что они характеризуются высокой морфологической изменчивостью, которая связана с географическим распространением. Статистический анализ выявили три группы, соответствующие трем морфотипам внутри комплекса S. purpurea. Совокупность макро- и микроморфологических признаков, а также анализ распространения позволили пересмотреть таксономический статус Lasiagrostis tremula, описанный Рупрехтом в 1869 году и обосновать приоритетное название Stipa tremula. Так же была доказана самостоятельность видов Stipa tremula, S. purpurea и S. arenosa. Описан новый для науки нотовид из этого комплекса – S. × ladakhensis, возникший в результате гибридизации S. klimesii и S. purpurea. Выделен лектотип Ptilagrostis semenovii. Составлен оригинальный ключ для определения видов изучаемого комплекса и подробные морфологические описания.