Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе работы при помощи методики выращивания биопленок на тефлоновых кубиках, стекловолоконных фильтрах, культивирования биопленок микроорганизмов в планшетном инкубаторе-спектрофотометре и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии проведено исследование влияния адреналина на формирование моновидовых планктонных культур и биопленок Micrococcus luteus C01, Kytococcus schroeteri H01, C. acnes 514, S. aureus 209P, S. epidermidis ATCC14990. Адреналин стимулирует рост биопленок M. luteus на тефлоновых кубиках при физиологической концентрации (900 пг/мл) на 89%, с ростом концентрации стимуляторный эффект пропадает. Адреналин влияет на адгезию клеток M. luteus к поверхности, ухудшая ее в случае гидрофильных поверхностей (стекло). При этом, на гидрофобной поверхности такого, по-видимому, нет. При росте биопленок на гидрофобной поверхности адреналин стимулирует рост клеток на начальной стадии роста биопленок, однако, у зрелых стимуляция заключается в увеличении синтеза матрикса. По-видимому, адреналин способен понижать саму метаболическую активность клеток в зрелых биопленках, что выражается в выравнивании активности с контрольными образцами. При этом, матрикс, синтезированный в биопленке, остается, что приводит к стимуляции при окраске КФ. Действие адреналина на рост культур и биопленок C. acnes противоположно действию на M. luteus: физиологическая концентрация ингибирует рост биопленок на 69%, тогда высокая – стимулируют на 61%. Это потенциально может служить одной из причин развития акне при стрессах. Мишенью действия адреналина у кутибактерий также является матрикс биопленок, причем, по-видимому, при разных концентрациях воздействие идет на разные его компоненты: подавление одного компонента при низкой концентрации и стимуляция другого – при высокой. Эта гипотеза нуждается в дальнейшем исследовании. Адреналин всех концентрациях стимулирует рост биопленок K. schroteri на тефлоновых кубиках, максимальный эффект при этом наблюдается при физиологической концентрации (173% от контроля). При этом, конечный выход биомассы планктонной культуры не изменяется, но ее рост слегка замедляется: увеличивается время удвоения (5.19 ч в контроле и 5,77 ч в присутствии адреналина) и лаг-фаза, уменьшается удельная скорость роста (0.13 ч-1 и 0.12 ч-1 соответственно). При этом число КОЕ и метаболическая активность биопленок не изменяются, что свидетельствует о том, что, как и в случае остальных актинобактерий, адреналин действует, прежде всего, на матрикс биопленок. Рост S. aureus в аэробных условиях также стимулируется адреналином во всех концентрациях примерно одинаково, максимальный эффект при этом наблюдается при физиологической концентрации – 136% от контроля. При этом, в анаэрбных условиях стимулирующий эффект гормона не наблюдается, что свидетельствует о различном действии гормона на микроорганизмы в различных эконишах на коже. В случае S. epidermidis при аэробных и при анаэробных условиях на тефлоновых кубиках наблюдается незначительная стимуляция роста биопленок при высоких концентрациях адреналина (113% от контроля), что дополнительно свидетельствует о потенциальном регуляторном действии гормона на сообщество. Исследования на других микроорганизмах, к сожалению, были прерваны из-за карантинных мер, мы планируем возобновить их при первой возможности. Исследование влияния норадреналина показало, что, в отличие от адреналина, норадреналин обладает преимущественно ингибиторным действием на рост биопленок M. luteus, K. shcroeteri, C. acnes. При этом, эффект зависит от концентрации: биопленки микрококка сильнее всего подавлялись при физиологической (600 пг/мл) концентрации гормона, тогда как у китококка и кутибактерий биопленки ингибировались при высоких концентрациях. Рост биопленок S. aureus и S. epidermidis по-разному изменяется в присутствии гормона, однако, общая тенденция такова, что при низких концентрациях рост биопленок золотистого стафилококка подавляется, а при высоких – стимулируется. Биопленки эпидермального стафилококка демонстрируют обратную зависимость. Таким образом, противоположный эффект на биопленки более патогенного (S. aureus) и менее патогенного (S. epidermidis) свидетельствует о регуляторной роли данного гормона на микробиоту. При этом, конечный выход планктонной биомассы в его присутствии не изменяется ни у одного из пяти микроорганизмов. У M. luteus и K. shroeteri норадреналин по-разному воздействовал на динамические параметры роста культур: рост микрококка несколько ускорялся (сокращалось время удвоения, увеличивалась удельная скорость роста), тогда как в случае K. schroeteri рост несколько замедлялся. Исследование биопленок M. luteus при помощи конфокальной микроскопии показало корреляцию с результатами окраски биопленок КФ на кубиках. Ингибиторный эффект, наблюдаемый при физиологической концентрации (80% от контроля на гидрофобных тефлоновых кубиках), на гидрофильной поверхности стекла усиливается: биопленки микрококка становятся тоньше на 43%, а плотность биомассы в них падает на 94% по сравнению с контролем. При этом, исследование метаболической активности биопленок при помощи окрашивания МТТ показало, что норадреналин не оказывает цитотоксического действия на клетки. Таким образом, по-видимому, мишенью норадреналина в клетках микроорганизмов являются компоненты, отвечающие за адгезию клеток и, по-видимому, за синтез матрикса биопленок, что коррелирует с данными по адреналину. Исследование действия натрийуретических пептидов (НУП) показало, что НУП, подобно другим гормонам, не обладают цитотоксическим действием на рост планктонных культур исследованных микроорганизмов. Исключением является рост культуры K. schroeteri в системе планшетного инкубатора: наблюдается сильное замедление (почти двукратное) роста и снижение конечной биомассы планктонных клеток в присутствии НУП С. В Однако, в системе с тефлоновыми кубиками такого не наблюдается. Возможно, критичной в данном случае является разница систем инкубации и материал планшета. Влияние же НУП на рост биопленок очень сильно зависит от концентрации соединения, вида НУП и микроорганизма. НУП А не влияет значимо на рост биопленок M. luteus и K. shcroeteri, однако, в случае микрококка наблюдается тенденция к стимуляции роста с увеличением концентрации. При этом, ускорение роста наблюдается и при исследовании динамики роста культур обоих микрооргоанизмов в присутствии НУП А. На кутибактерий НУП А оказывал ингибирующее действие при физиологической концентрации (70% от контроля), а с ростом концентрации эффект сменяется на стимулирующий (158 % от контроля). Подобная зависимость эффекта от концентрации и вида микроорганизма свидетельствует о регуляторной роли НУП А в отношении микробиоты кожи человека. В случае стафилококков эффект НУП А зависит еще и от условий культивирования. В случае S. aureus в аэробных условиях НУП А стимулирует рост биопленок в физиологической концентрации (20 пг/мл), с ростом концентрации эффект пропадает. При смене атмосферы на анаэробную эффект НУП А сменяется на противоположный. Биопленки S. epidermidis при этом в аэробных условиях в целом стимулируются НУП А, тогда как в анаэробных – ингибируются. НУП В и НУП С также обладают различным влиянием на биопленки, зависящим от вида микроорганизма, концентрации пептида и условий культивирования в случае стафилококков. НУП А и НУП В преимущетвенно стимулируют рост биопленок на тефлоновых кубиках (окраска КФ) у исследованных нами микроорганизмов, а также ускоряют рост планктонных культур. По результатам наших исследований действия эстрадиола на биопленки, данный стероид, аналогично другим гормонам, не является цитотоксическим в отношении роста планктонных клеток. Рост биопленок M. luteus, K. schroeteri и C. acnes ингибируется при физиологической (60 пг/мл) концентрации гормона в среде. При этом с увеличением концентрации эффект в случае микрококка и китококка пропадает, а в случае кутибактерий – сменяется на стимулирующий. По результатам исследования метаболической активности биопленок M. luteus и C. acnes показано, что в случае M. luteus мишенью действия эстрадиола являются компоненты, отвечающие за адгезию клеток. Это подтверждается и данными конфокальной микроскопии: в системе с гидрофильным носителем в присутствии гормона наблюдается стимуляция роста (увеличение толщины и плотности биомассы), тогда как на гидрофобном носителе биомасса биопленок снижается по сравнению с контролем. В случае C. acnes данные свидетельствуют о том, что мишенью для действия эстрадиола является синтез матрикса (снижение биомассы при окраске КФ, отсутствие эффекта при окраске МТТ и подсчете КОЕ). Исследование образования и свойств персистирующих клеток некоторых микроорганизмов кожи человека и влияния на них гормонов специальными методами (в том числе при помощи электронной микроскопии) впервые показало, что для определения численности персистеров у штаммов с множественной АБ-резистентностью применим способ использования лизирующего раствора (на примере S. epidermidis). Обнаружено, что в отличие от большинства коллекционных бактерий у стафилококков – обитателей кожи человека, доля персистеров в их стационарных культурах весьма высока и составляет: у S. epidermidis для персистеров, устойчивых к лизирующему раствору примерно 10%, у S. capitis – персистеров, устойчивых к антибиотикам примерно 10%. Выявлена гетерогенность стандартно полученных персистеров Показано, что при длительной инкубации (4 мес.) в стандартных условиях цикл развития стафилококков завершался образованием покоящихся форм (ПФ), численность которых составляла для обоих штаммов около 0.1% от численности жизнеспособных клеток в стационарных культурах. ПФ стафилококков обладали всеми необходимыми характеристиками покоящихся клеток: образованием в цикле развития культур; сохранением жизнеспособности в неростовых условиях; отсутствием экспериментально определяемого метаболизма (отсутствие дыхания); специфической ультраструктурной организацией; высокой терморезистентностью (в 200-600 раз больше, чем вегетативных клеток при действии t = 90оС, 15 мин). Обнаруженная корреляция между численностью ПЛР в культурах стафилококков и долей высокотермоустойчивых ПФ подтверждает ранее высказанную авторами статьи гипотезу о персистерах как предшественниках ПФ. Также, показано влияние стимулирующее влияние НУП В на образование клеток-персистеров M. luteus и увеличение количества устойчивых к антибиоткам клеток. По результатам работы опубликовано 2 статьи.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
С помощью КЛСМ показано, что все гормоны оказывают эффект на исследуемые микроорганизмы, причем эффект зависит от условий культивирования (в случае стафилококков эффекты могут появляться и исчезать в зависимости от состава атмосферы, в которой культивируется микроорганизм – аэробной или анаэробной). По результатам исследования действия норадреналина на Kytococcus schroeteri принята к публикации статья Даниловой и соавторов. Исследовали кинетические параметры роста факультативных анаэробов (C. acnes, S. aureus, S. epidermidis) в присутствии концентраций гормонов, оказывавших наибольший эффект и выявленных на предыдущем этапе работы. Для С. acnes показано, что присутствиие НУП-А в среде обеспечивало более интенсивный рост C. аcnes на начальной стадии, что выражалось в увеличении скорости роста и увеличении общего урожая клеток. Действие НУП-B близко по характеру к действию НУП-А: интенсификация роста на начальной стадии процесса с увеличением выхода биомассы. В присутствии НУП-C, напротив, рост кутибактерий слегка замедляется в более поздней фазе роста. Можно утверждать, что все три пептидных гормона воздействуют на рост похожим образом: они увеличивают интенсивность роста микроорганизма на начальной стадии, сокращая времена удвоения и увеличивая скорость роста, что выражается в более крутом наклоне графика роста и более высоком выходе биомассы по сравнению с контролем. В случае катехоламинов показано, что, несмотря на очень схожее химическое строение, норадреналин и адреналин влияют по-разному на рост С. acnes. В то время как адреналин и норадреналин в физиологической концентрации затормаживают рост, адреналин в высокой концентрации 900 нг/мл стимулирует рост биомассы. В случае эстрадиола, при помощи сравнения контроля без добавок, контроля с добавлением этанола и образцов с эстрадиолом было установлено, что эстрадиол в концентрации 60 нг/мл оказывает стимулирующее действие на рост C. acnes, что выражается в увеличении скорости роста, большем выходе биомассы и сдвигании на более поздний срок времени наступления стационарной фазы. S. aureus 209р. В присутствии всех натрийуретических пептидов, эстрадиола и катехоламинов в среде в анаэробных условиях наблюдали замедление роста бактерии, что выражалось в увеличении времени удвоения и уменьшении скорости роста. При добавлении гормонов в среду к S. epidermidis, экспоненциальный участок увеличивался по продолжительности, однако, скорость роста уменьшалась или не менялась. Во всех случаях, кроме эстрадиола, время удвоения увеличивалось. Стационарная фаза наступала практически одинаково во всех комбинациях с гормонами. Определено влияние факторов гуморальной регуляции на образование персистеров в планктонных культурах. Результаты проведенных исследований показали, что присутствие гормонов во время роста клеток M. luteus значительно влияет на образование в популяции персистеров II типа, практически во всех случаях приводя к увеличению их количества в 1.5 (100Ф Адреналин) – 11.2 (10Ф норадреналин) раз, что зависело от вида и концентрации гормонов. Максимальный титр персистеров обнаруживался при воздействии физиологической концентрации в опытных популяциях, выращенных в присутствии НУП-B и адреналина; при воздействии 10х физиологической концентрации – в присутствии норадреналина, эстрадиола, НУП-А и НУП-C. Только в одном случае, в бактериальной популяции, полученной с физиологической концентрацией НУП-А, количество персистеров снижалось в 1.5 раза, по сравнению с их титром в контрольной популяции. Таким образом, полученные данные показывают, что гормоны играют важную роль в формировании механизмов стрессоустойчивости и выживания бактериальной микробиоты человека. Исследовано влияние гормонов человека на формирование персистентных клеток планктонных культур S. aureus и S. epidermidis. Альтернативные варианты обработки биоцидами приводят к различающимся эффектам: формирование антибиотикоустойчивых персистеров не зависит от обработки гормонами или эта связь очень слабая. Катехоламины могут как увеличивать долю персистеров в популяции (в случае с норадреналином), так и не изменять это соотношение (в случае с адреналином). Эстрадиол и натрийуретические пептиды не оказывают влияния на формирование персистеров в планктонных кульутрах S. aureus и S. epidermidis, что подтверждается экспериментами с различным дизайном (внесение гормонов в растущую культуру, в популяцию персистеров, а также с использованием двух различных биоцидов). Катехоламины, независимо от концентрации, снижают число КОЕ, сформированных из персистеров на 1 – 2 порядка. Напротив, эстрадиол, не изменяет число персистеров в процессе инкубации, но последствия обработки могут приводить к эффекту массового автолиза клеток при их переходе из персистеров в вегетирующие клетки. Исследовано воздействие гормонов норадреналина и натрийуретического гормона НУП-А на формирование персистеров в биопленках S. epidermidis. Определено влияние натрийуретических пептидов на антибиотикоустойчивость бактериальных клеток представителей кожной микробиоты человека - M. luteus, S.aureus, S. epidermidis. Эксперименты показали, что присутствие пептидов во время роста бактериальных клеток трех исследуемых представителей кожной микробиоты человека значительно влияет на образование антибиотикоустойчивых клеток, увеличивая их количество в 1.1– 3.7 раз. Также было выявлено, что рост бактерий в неоптимальных условиях приводит к усилению действия НУП, направленного на увеличение антибиотикоустойчивых клеток в популяциях. Так, рост M. luteus в присутствии НУП-B в условиях сниженной аэрации, при культивировании в эппендорфах объемом 2 мл с 1 мл среды на термошейкере (BIOSAN TS_100) при 750 об./мин и температуре 34°С приводил к увеличению количества антибиотикоустойчивых клеток более чем в 50 раз. Такой же эффект проявлялся и при рассеве опытных и контрольной популяций на среду с другим антибиотиком ампициллином. Количество антибиотикоустойчивых бактерий в опытных вариантах было в 6-11 раз выше, чем в контроле, что выявлялось уже на экспоненциальной фазе роста. Исследована регуляция гормонами человека активности лизоцима в отношении культуры Micrococcus luteus. Исследование взаимодействия лизоцима и гормонов человека in vitro показало изменение ацетилмурамидазной активности фермента в отношении тестовой культуры Micrococcus luteus. Адреналин и норадреналин повышают активность лизоцима до 180% по сравнению с необработанным гормонами ферментом. В случае катехоламинов на фоне увеличения температуры до 40°С и снижения рН до 5.5 проявлялось ингибирование активности лизоцима. Изменение рН среды с 6.3 до 5.5 увеличивало активность лизоцима, обработанного эстрадиолом, до 150 - 200% в зависимости от концентрации гормона. Методом молекуляного докинга показано снижение энергии активации активного центра фермента при взаимодействии катехоламинов с аминокислотными остатками asp52 и glu35 реакционного центра. Сообщество M. luteus и S. epidermidis тестировали в присутствии норадреналина и эстрадиола (оба – в физиологической концентрации, норадреналин – 6*10-10 г/мл и эстрадиол – 6*10-11 г/мл). Кратко перечислены результаты. Метаболическая активность клеток на чашках Петри, после 24 и 72 часов инкубации, в присутствие гормонов практически не изменяется или изменяется незначительно. Рост клеток M. luteus в бинарных биопленках и планктонных культурах подавляется после 24 и 72 часов инкубации на чашках Петри и в пробирках, с добавлением гомонов среду и без. Метаболическая активность клеток после 24 часов инкубации в пробирках практически не изменяется или изменяется незначительно. После 72 часов наблюдается снижение метаболической активности у M. luteus и бинарных биопленок в присутствие норадреналина. После 24 часов наблюдается снижение КОЕ планктонной культуры M. luteus. После 72 часов снижается число КОЕ S. epidermidis в планктонной культуре и в составе биопленок, в присутствие эстрадиола. При это КОЕ S. epidermidis в бинарных биопленках увеличивается. По кривым роста S. epidermidis и M. luteus видно, что в присутствие эстрадиола снижается рост культур по сравнению с спиртовым контролем. При этом ОП540 зрелых биопленок в присутствие эстрадиола не отличается от контроля. Норадреналин увеличивает рост бинарных культур и ОП540 зрелых биопленок. Исходя из кривой роста бинарной биопленки и планктонной культуры, можно предположить, что S. epidermidis доминирует в составе бинарного сообщества. Сообщество C. acnes и S. epidermidis тестировали в присутствии НУП-А. По результатам работы опубликована статья (Ovcharova et al., 2021). Кратко: в анаэробных условиях НУП-А в концентрации 6,5 × 10-10 М подавляет рост биопленок S. epidermidis и стимулирует рост биопленок C. acnes. В биопленках НУП-А стимулирует агрегацию C. acnes и дисперсию агрегатов S. epidermidis, в то время как в S. epidermidis НУП-А также стимулирует метаболическую активность клеток. Анализ бинарных биопленок показал преобладание S. epidermidis, в то время как НУП-А увеличивает долю биомассы C. acnes в сообществе. Сообщество S. epidermidis и S. aureus исследовали в присутствии норадреналина, по результатам чего была опубликована статья (Mart’yanov et al., 2021). Кратко: показали, что норадреналин может влиять на формирование биопленок обоих видов с сильной зависимостью от аэробных или анаэробных условий культивирования на разных моделях. Было показано, что S. epidermidis подавляет рост S. aureus в бинарных биопленках и что гормон может ускорять этот процесс, способствуя конкурентному поведению стафилококков. Получены первые данные об экспрессии генов в присутствии адреналина у M. luteus. В системе с кубиками политетрафторэтилена обработка адреналином в физиологической концентрации 4912 x 10-9 М увеличивала общее количество биомассы биопленки, окрашенной кристаллическим фиолетовым, и увеличивала метаболическую активность биопленок, как измерено с помощью окраски MTT. , но при более высоких концентрациях (9, 90 и 900 нг / мл) лечение не дало эффекта. На фильтрах из стекловолокна обработка гормоном уменьшала количество колониеобразующих единиц (КОЕ) и изменяла агрегацию, но не влияла на метаболическую активность клеток биопленки. В планшетах со стеклянным дном для конфокальной микроскопии, адреналин заметно ингибировал рост биопленок, которые были окрашены SYTO 9 Green. Анализ дифференциальной экспрессии генов и ОТ-ПЦР продемонстрировал воспроизводимые изменения уровней экспрессии 7 генов, увеличивалась экспрессия генов, кодирующих сборку Fe-S-кластеров, в то время как гены, кодирующие ко-шаперонин GroES, экспортер лизина LysE, короткоцепочечную алкогольдегидрогеназу и гипотетический белок с двумя доменами EAL (потенциальная c-ди-GMP фосфотрансфераза) подавлялись.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В ходе работы за третий год проекта были завершены исследования перспективных сообществ микроорганизмов и влияния на них избранных гормонов человека. Так, НУП-С увеличивает конкурентные свойства Cutibacterium acnes относительно Staphylococcus epidermidis в бинарной биопленке. Изучали эффект эстрадиола и этанола на сообщество Micrococcus luteus C01 и Lactobacillus paracasei АК508. Использованные в работе концентрации 0.22 нМ и 22 нМ (физиологическая и 100 х физиологическая) показали активность в отношении микроорганизмов. Эстрадиол стимулирует в высокой концентрации рост микрококков. В обеих концентрациях гормон ингибирует лактобацилл. Эстрадиол увеличивал агрегацию клеток в моновидовых биопленках. Эстрадиол потенциально снижает синтез специализированных антибактериальных соединений лактобациллами. Присутствие микрококка в сообществе переключает эффект эстрадиола с ингибирования на стимуляцию роста биопленок L. paracasei. Этанол как растворитель для стероидных гормонов, в концентрации 0.6% сам по себе является сильным аффектором роста бипленок , и зачастую он выступает в качестве антагониста эстрадиола. Изучали эффект НУП-А на сообщество Staphylococcus aureus 209Р и Kytococcus schroeteri Н01. В составе бинарных биопленок эти бактерии чувствительны к натрийуретическому пептиду А-типа (НУП-А) в концентрации 650 пкМ. Гормон влияет на способность клеток к агрегации и снижает гидрофобность клеточной поверхности. Присутствие в сообществе китококков влияет на агрегацию и действие, оказываемое НУП-А на микробное сообщество. K. schroeteri усиливает адгезию стафилококков, при этом являясь их антагонистом в биоплёнке. Кроме того, присутствие K. schroeteri в биопленке «переключает» действие НУП-А на S. aureus с нейтрального/стимулирующего на ингибирующий. Под действием этанола как растворителя для эстрадиола изменяется экспрессия 27 генов, из них у 11 повышается экспрессия (в том числе алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназы, SDR-оксидоредуктазы и мембранных белков), а у 16 – понижается, в том числе у АТФ-связывающего домена мембранного ABC-транспортера, белка аквапорина, ряда дегидрогеназ. Эстрадиол в физиологической концентрации при этом изменяет экспрессию у 7 генов по сравнению с образцами с этанолом. Гены глицеролкиназы GlpK, аквапорина, глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы, цистатионин-гамма-лигазы, N-ацетилтрансферазхы семейства GNAT, КоА-лигазы длинноцепочечных жирных кислот снижают свою экспрессию, тогда как ген белка неизвестной функции – повышает. Изучали действие НУП-А и НУП-С на экспрессию генов в биопленках Staphylococcus epidermidis ATCC14990. В аэробных условиях НУП-А в концентрации 0.65 нМ изменяет (понижает) экспрессию двух генов – деиминазы аргинина и катаболической карбамоилтрансферазы орнитина. Первый фермент участвует в посттрансляционной модификации белков (в частности, гистонов), через превращение аргинина в цитрулин а второй отвечает за катаболизм аргинина в цитрулин. По-видимому, дефицит цитрулина, потенциально возникающий в клетках, приводит к ингибированию роста биопленок у стафилококка. НУП-С в аэробных условиях изменяет экспрессию 6 генов: повышает ее у двух белков неизвестной функции и понижает у генов субъединицы DhaK дигидроксиацетонкиназы, деиминазы аргинина (аналогично НУП-А), катаболической карбамоилтрансферазы орнитина (аналогично НУП-А) и карбаматкиназы 2. По-видимому, НУП имеют универсальное свойство влиять на синтез цитрулина у стафилококков, что может быть ключом к механизму действия данных соединений на стафилококк. В анаэробных условиях НУП-С понижает экспрессию генов двух белков неизвестной функции. Изучали действие адреналина, НУП-А и НУП-С на экспрессию генов в биопленках Cutibacterium acnes RT5. При исследовании влияния адреналина в концентрации 4.9 нМ (физиологическая) показано, что изменений в экспрессии генов не происходит. При этом, при концентрации 4.9 мкМ меняется экспрессия у 5 генов (понижается): три из них связаны с АВС-транспортерной системой мембран: субстрат-связывающий белок, АТФ-связывающий белок и железозависимая пермеаза. Также, снижается экспрессия у пермеазы аминокислот и одного белка неизвестной функции. В моновидовых биопленках ни НУП-С, ни НУП-А не изменяли экспрессию генов у кутибактерий. Исследовали экспрессию генов сообщества C. acnes и S. epidermidis в присутствии НУП-С. Было проведено сравнение экспрессии генов стафилококка в аэробных и анаэробных условиях. В образцах без добавок у стафилококков изменяют свою экспрессию 92 гена (из них 34 гена белков неизвестной функции):у 83 экспрессия повышается, а у 9 – снижается. Примечательно, что при этом понижается экспрессия гена 6S рибосомальной РНК и повышается экспрессия гена деиминазы аргинина. Экспрессия гена карбамоилтрансферазы орнитина не меняется. В двухвидовых биопленках показано значительное влияние микроорганизмов друг на друга. Так, при сравнении контрольных образцов моновидовых биопленок S. epidermidis и S. epidermidis из бинарных сообществ выявлено изменение экспрессии 33 генов. При этом, добавление в среду НУП-С дополнительно меняет экспрессию только двух генов (в обоих случаях понижение): белка неизвестной функции и НАДН-хинон-оксидоредуктазы. Присутствие кутибактерий значительно влияет как на экспрессию генов у стафилококка, так и на действие НУП-С. У C. acnes в присутствии стафилококков в контрольных образцах изменяется экспрессия 54 генов. Гены отвечают за самые разнообразные функции, в том числе за синтез белков L28, L32, L33 и S14 рибосом (все четыре увеличивают экспрессию). Вероятно, что увеличение (потенциальное) количества рибосом может быть ответом на жесткую конкуренцию со стороны стафилококков. Добавление НУП-С понижает экспрессию у 5 генов: белков L28 и S14 рибосом, металл-зависимой пермеазы АВС-транспортера и еще двух поверхностных белков. В присутствии стафилококков НУП-С начинает влиять на экспрессию генов у кутибактерий (чего не было в моновидовых биопленках). Изучали in vitro влияние факторов гуморальной регуляции человека ‒ катехоламинов адреналина и норадреналина, а также стероидного гормона эстрадиола, на частоту образования персистеров и их выживание при резкой смене условий культивирования – голодании с последующим переносом персистеров в свежую богатую среду. На стресс богатой среды, вызывающий, так называемую “ускоренную субстратом смерть клеток” адреналин не влиял, тогда как норадреналин во всех концентрациях вызывал переход персистеров в некультивируемое состояние с последующей их ресусцитацией – возвратом способности образовывать колонии. Эстрадиол в физиологической (0.22 нМ) концентрации также не влиял на выживание персистеров в условиях голодания, а в более высоких дозах – 10ф и 100ф защищал персистеров от стресса голодания. От стресса богатой среды, напротив, защищали только высокие 10ф и 100ф концентрации эстрадиола. Показано, что формирование персистеров в биопленках эпидермального и золотистого стафилококков зависит от концентрации гормонов и их молекулярного веса при использовании в качестве основы 2% агарового геля, содержащего компоненты среды Лурия. НУП-А оказывает максимальное стимулирующее воздействие на формирование персисторов S. epidermidis в 100 кратной концентрации (от физиологической), а в случае S. aureus стимуляция варьирует от 20 до 50% в зависимости от концентрации НУП-А. Оценка влияния катехоламинов на образование персистеров у обоих видов стафилококков нуждается в уточнении. Исследовано влияние адреналина в концентрации 4.9 нМ на состав матрикса биопленок M. luteus C01. Гормон увеличивает количество органического вещества в матриксе, полисахаридов и внеклеточной ДНК. Также, меняется значительно белковый и липидный состав матрикса. Так, протестировано влияние НУП-А на активность азитромицина в отношении K. schroeteri. Показано, что гормон способен уменьшать ингибиторное действие антибиотика на биопленки, что открывает большие перспективы в этом направлении. Показано, что in vitro в определенных условия катехоламины и эстрадиол способны увеличивать активность лизоцима в отношении клеток M. luteus