Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Лучевая терапия является одним из основных методов лечения пациентов с немелкоклеточным раком легких (НМРЛ). Однако устойчивость опухолевых клеток к воздействию остается основным фактором, ограничивающим успешный терапевтический исход. Чтобы изучить молекулярно-клеточные механизмы повышенной устойчивости НМРЛ к воздействию ионизирующего излучения (ИИ), мы сравнили две клеточные линии НМРЛ: клетки A549 (p53 дикого типа) и H1299 (p53 дефицитные). Используя фракционированное рентгеновское облучение этих клеток в общей дозе 60 Гр, мы получили выжившие популяции и назвали их A549IR и H1299IR, соответственно. Дальнейшая характеристика этих клеток показала множественные изменения по сравнению с родительскими клетками НМРЛ. Мы обнаружили, что клетки H1299IR (p53 дефицитные) демонстрируют более выраженный подобный эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП) фенотип по сравнению с клетками A549IR (p53-дикого типа). Более того, H1299IR продемонстрировали снижение межклеточных контактов и большое количество круглых жизнеспособных клеток с низкой адгезией к пластику. Однако это предположение требует нашего отдельного исследования. Способность клеток НМРЛ сохранять репродуктивный потенциал после фракционированного облучения лежит в основе проблемы рецидивов опухоли, наблюдаемых у пациентов. Мы оценили эффективность посадки родительских и выживших после облучения клеток НМРЛ, которая определяется как способность прикрепившихся к поверхности пластика клеток образовывать колонии. Клетки A549IR продемонстрировали незначительную в два раза более высокую эффективность посадки, чем родительские клетки A549 (p53-дикого типа), растущие в нормальных физиологических условиях. Напротив, клетки H1299IR имели в семь раз более низкую эффективность посадки и меньший размер колоний по сравнению с родительскими клетками H1299 (p53-дефицитными). Наши данные свидетельствуют о том, что функциональный р53 увеличивает клоногенную способность выживших после фракционированного облучения сублиний, полученных из родительских клеток НМРЛ. Мы обнаружили, что уровень EdU-положительных (доля пролиферирующих клеток) клеток H1299IR был значительно ниже, чем родительских клеток. Тем не менее, доля пролиферирующих родительских клеток A549 (функциональный p53) была значительно ниже, чем клеток H1299 (p53-дефицитные). В то время, как пролиферация выживших после мультифракционной радиотерапии (МФР) клеток обеих клеточных линий была статистически неразличимой. Это заставляет нас предположить, что, хотя пролиферация родительских клеток зависит от р53, пролиферация клеток выживших после воздействия МФР не зависит от р53. В то же время мы продемонстрировали, что фракция Ki67 + клеток как в родительских, так и в выживших после облучения сублиниях НМРЛ была почти одинаковой. Интересно, что в ответ на возрастающее острое однократное воздействие ИИ, функциональный p53 обеспечивает значительное дозо-зависимое снижение доли Ki67 + как для клеток A549, так и для A549IR. В то же время в отсутствие функционального p53 как в родительских, так и выживших после МФР клетках H1299 доля Ki67 + клеток уменьшается незначительно. Мы предполагаем, что функциональный р53 может быть необходим для желаемого сокращения репликации ДНК клеток и клеток в пре-репликативной фазе роста - в ответ на острое воздействие ИИ как выживших после МФР, так и родительских клеток. Многие исследования показывают, что репарация ДР ДНК происходит более эффективно в клетках, выживших после фракционированного рентгеновского облучения. В нашем исследовании дополнительное воздействие 2 Гр ИИ привело к значительным изменениям кинетики числа фокусов γH2AX и pATM в A549IR и H1299IR по сравнению с родительскими клетками НМРЛ. В то время, как клетки A549, A549IR и H1299 демонстрировали четкую двухфазную кинетику репарации ДР ДНК, H1299IR демонстрировали более медленную кинетику деградации фокусов γH2AX. Даже через 8 ч после дополнительного воздействия ИИ в этих клетках наблюдалось около 50% фокусов от максимума, наблюдаемого через 1 ч после облучения. Характер фосфорилирования H2AX в этих клетках был pATM-независимым. Мы предположили, что киназа ATR может быть ответственна за фосфорилирование H2AX в этих клетках. H2AX может фосфорилироваться с помощью ATR в присутствии одноцепочечной ДНК во время остановки вилки репликации. В этом случае ДР репарируются по пути гомологической рекомбинации (ГР). Мы проанализировали вклад ключевого белка ГР - Rad51 - в репарацию ДР ДНК. В то время, как в А549 и А549IR клетках изменение доли колокализованных с γH2AX фокусов Rad51 практически не отличалось во всех исследованных временных точках, в клетках Н1299IR уже через 4 ч наблюдалось статистически значимое (р=0,02) увеличение доли колокализованных с γH2AX фокусов Rad51 по сравнению с Н1299. Через 24 ч после облучения доля колоколизованных фокусов в Н1299 и Н1299IR клетках практически не отличалась и была выше (~30%), чем в А549 и А549IR клетках (~20%). Это согласуется с нашими результатами по распределению клеточного цикла после дополнительного воздействия ИИ. Сублиния H1299IR, полученная из p53-дефицитных клеток H1299, имела схожий с сублинией A549IR (получена из клеток с функциональным p53) характер изменения доли G1 / G0 клеток. Однако доля клеток в G2-M фазах сублинии H1299IR была практически в 2 раза больше чем в А549IR клетках, облученных в тех же дозах ИИ. Таким образом, наличие функционального p53 приводило к длительным ИИ-индуцированным задержкам клеточного цикла в G1 и G2, тогда как отсутствие p53 приводило в родительских и радиорезистентных клетках к выходу из G0 / G1 и более заметной задержке в фазе G2 / M. Присутствие остаточных фокусов γH2AX / 53BP1 широко используются для биодозиметрии ИИ и может представлять собой неотрепарированные или неправильно восстановленные ДР ДНК, изменения хроматина, апоптоз и др. Уменьшение числа остаточных фокусов γH2AX / 53BЗ1 наблюдалось как в A549IR, так и в H1299IR клетках по сравнению с родительскими клетками после дополнительного воздействия ИИ в дозах 2, 4 и 6 Гр. Отсутствие апоптоза является признаком радиорезистентных опухолевых клеток. В нашем исследовании в клетках A549 (с функциональным p53) происходило дозозависимое увеличение доли апоптотических клеток как в родительских, так и в выживших после МФР клетках после воздействия 2-6 Гр ИИ. Напротив, в H1299IR (р53-дефицитные) доля апоптотических клеток снижалась после облучения и достигала статистически значимого значения только после воздействия 4 Гр по сравнению с необлученными клетками. Наши данные свидетельствуют о том, что функциональный р53 сенсибилизирует как родительские, так и радиорезистентные клетки к апоптозу в ответ на острые однократные дозы ИИ. Напротив, дефицит р53 приводит к тому, что родительские клетки проявляют выраженный апоптотический ответ только при самой высокой дозе острого однократного воздействия ИИ. В клетках, выживших после МФР дефицит р53 приводит к снижению апоптотической реакции при любой однократной острой дозе ИИ. В А549 популяции доля аутофагических клеток превышала таковую для А549IR и практически не менялась после облучения в дозе 2 Гр. Увеличение дозы облучения до 4 и 6 Гр приводило к снижению доли клеток А549, гибнущих по механизму аутофагии. При этом в А549IR сублинии доля аутофагических клеток практически не менялась во всем изученном диапазоне доз, однако была статистически значимо ниже по сравнению с А549 популяцией. Доля аутофагических клеток в Н1299 популяции незначительно увеличивалась с увеличением дозы облучения (от 26% в контроле до 36%). В Н1299IR сублинии, подобно А549IR, увеличения доли аутофагических клеток не происходило и составляло примерно 15% во всех исследованных дозах облучения. ABCG2 является одним из многообещающих маркеров ОСК и, как известно, способствует множественной лекарственной устойчивости во время химиотерапии. ABCG2 является предполагаемой молекулярной детерминантой фенотипа боковой популяции (SP), и экспрессия мРНК ABCG2 была заметно выше в SP для всех проанализированных клеточных линий рака легких. Поскольку выжившие в результате МФР сублинии продемонстрировали ЭМП-подобный фенотип, в некоторой степени похожий на фенотип SP, мы проанализировали влияние МФР на изменение экспрессии белка ABCG2 в отношении статуса p53. Даже несмотря на то, что экспрессия ABCG2 в необлученных клетках A549IR была выше, чем в родительских клетках, A549IR сублинии не проявили какого-либо значительного изменения уровня экспрессии ABCG2 по сравнению с необлученными клетками в ответ на дополнительное острое воздействие ИИ. Напротив, фоновая экспрессия ABCG2 в H1299IR была выше, чем в родительских клетках H1299, и воздействие ИИ в дозе 2 Гр приводило к резкому (более чем в 3 раза) увеличению экспрессии ABCG2. Хотя дальнейшее увеличение дозы облучения до 4 и 6 Гр приводило к снижению уровня ABCG2 по сравнению с необлученными клетками. Следует отметить, что экспрессия ABCG2 в облученных клетках H1299IR оставалась значительно (р = 0,003, р = 0,018 и р = 0,007 соответственно) выше, чем в родительских клетках, подвергшихся воздействию какой-либо одной дозы облучения. FRA1 (Fos-like antigen 1) высоко экспрессируется в опухолях эпителиального происхождения и увеличивает миграцию опухолевых клеток. Показано, что уровень экспрессии FRA1 в Н1299 клетках был выше по сравнению с А549 в 1,6 раз (p<0.05). При этом в Н1299IR наблюдалось увеличение уровня экспрессии FRA1 в 1,5 раза по сравнению с Н1299(p<0.05). Таким образом, можно сделать предварительное заключение о том, что высокий уровень экспрессии FRA1 ассоциирован с выживаемостью клеток Н1299 после воздействия ИИ и может вносить вклад в рецидивы опухолей НМРЛ. Экзосомы, выделяемые родительскими и радиорезистентными клетками НМРЛ значительно увеличивают метаболическую активность и пролиферацию здоровых клеток легкого человека (ФЛЭЧ). Наше исследование предоставляет убедительные доказательства того, что различные механизмы репарации ДНК активируются в клетках, подвергнувшихся мультифракционной радиотерапии (МФР), а также однократному острому воздействию ИИ. Увеличение выживаемости клеток, подвергшихся МФР, зависит как от функционирования p53 системы, так и FRA1. Наши результаты имеют клиническое значение, так как они могут помочь в выборе наиболее эффективного режима ИИ путем анализа статуса экспрессии p53-53BP1 пути в опухолях и, таким образом, максимизируют терапевтическую пользу для пациентов, минимизируя сопутствующие повреждения нормальной ткани.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Лучевая терапия является основным методом лечения пациентов с неоперабельным немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ). Гетерогенность опухолей по-прежнему представляет собой центральный вопрос в проблеме радиорезистентности рака: приобретает ли определенная популяция клеток внутри опухоли избирательное преимущество во время лучевой- и химиотерапии, и способствует ли эта популяция метастазированию и рецидиву опухоли. На данном этапе выполнения работ по проекту мы изучили влияние двух различных режимов мультифракционной лучевой терапии (МЛТ) с использованием рентгеновского облучения: фракционного увеличения дозы (FDE) в расщепленном курсе и обычного гипофракционирования (HF) на фенотипические и молекулярные признаки четырех сублиний НМРЛ, полученных из родительских клеток A549 (p53 дикого типа) и H1299 (нулевые по p53), а именно, клеток A549FR, A549HR, H1299FR и H1299HR. Мы обнаружили, что сублинии, выжившие после двух различных режимов МЛТ в общей дозе 60 Гр, значительно различаются по своим молекулярным характеристикам в зависимости от режима облучения и статуса p53. Наблюдаемые изменения в отношении радиочувствительности, трансформации, пролиферации, метаболической активности, частичной активации эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) и миграционной активности в 1D плоскости (тест на заживление ран). Мы впервые продемонстрировали, что воздействие МЛТ приводит к значительному снижению экспрессии p63 и p73, членов семейства p53, в клетках p53null, что коррелировало с увеличением доли полиплоидных клеток в этих популяциях. Мы не смогли найти значительных различий в экспрессии FRA1 между родительскими клетками и их радиорезистентными сублиниями, независимо от статуса p53. В нашем исследовании режим FDE, вероятно, вызывает частичную активацию программы ЭМП в клетках НМРЛ, выживших после МЛТ, либо за счет активации виментина в p53null, либо за счет аберрантной активации N-кадгерина в клетках p53wt. Режим HF, вероятно, в меньшей степени влияет на активацию ЭМП независимо от статуса p53 выживших после МЛТ клеток НМРЛ. Наши данные подчеркивают, что оба режима МЛТ вызывали в целом более высокую злокачественную трансформацию клеток p53null H1299FR и H1299HR, чем их родительские клетки H1299. Кроме того, наши результаты показывают, что режим FDE повышает радиорезистентность и трансформацию выживших после МЛТ клеток НМРЛ независимо от их статуса p53, хотя режим HF продемонстрировал аналогичный эффект только для p53null клеток. Наши данные дополнительно подчеркивают влияние статуса p53 на изменение числа фокусов γH2AX и связанную с этим эффективность репарации ДР ДНК в клетках НМРЛ после МЛТ. Мы обнаружили, что белок Rad51 может играть основную роль в выживании p53null клеток НМРЛ и способствовать репарации ДР ДНК путем гомологичной рекомбинации (ГР), поскольку доля Rad51+ клеток была повышена в p53wt и p53null популяциях выживших после МЛТ сублиний и их родительских клетках, экспрессирующих характерные для ОСК поверхностные маркеры CD44high/CD166high. p53wt, по-видимому, обеспечивает опосредованную ДНК-ПК репарацию ДР ДНК как в родительских, так и в выживших клетках независимо от дозы последующего дополнительного однократного облучения. В отсутствие p53 увеличение ДНК-ПК-опосредованной репарации ДР ДНК путем НГСК осуществляется дозо-зависимым образом, поскольку увеличение доли ДНК-ПК(S)+ клеток наблюдалось в раннее время после облучения (через 6 ч) и было более интенсивно в ОСК-подобных популяциях выживших после МЛТ H1299FR по сравнению с их родительскими H1299 клетками. Мы обнаружили значительно более высокое содержание LC3+ клеток в популяциях CD44high / CD166high p53wt-выживших после МЛТ клеток, по сравнению с их p53null аналогами. Дополнительное рентгеновское облучение в дозах 2 Гр и 5 Гр приводило к дозо-зависимому увеличению доли LC3+ клеток в CD44high / CD166high популяциях родительских как p53wt, так и p53null клеток, но не их радиорезистентных сублиний. Наши данные показали, что аутофагия не обязательно связана с радиочувствительностью ОСК-подобных клеток, подчеркивая, что тщательная оценка других процессов (таких как старение и ось аутофагия-p53-Zeb1) может обеспечить новые потенциальные мишени, модулируемые для достижения терапевтического эффекта за счет радиочувствительности раковых клеток. Наши результаты также проливают свет на сложную взаимосвязь между аутофагией и связанным с p53 ЭМП, благодаря которой клетки, выживающие после МЛТ, могут приобретать инвазивный фенотип и метастатический потенциал. Наши данные еще раз подчеркивают, что подходы к терапии НМРЛ должны стать более персонализированными в соответствии с режимом лучевой терапии (ЛТ), гистологией опухоли и молекулярным статусом критических белков.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Опухолевые стволовые клетки (ОСК) играют решающую роль в возникновении, прогрессировании и рецидиве терапии многих видов рака, включая немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ). Многие исследования указывают на то, что CD133, CD44, ABCG2 и ALDH1A1 являются наиболее узнаваемыми маркерами ОСК НМРЛ. На данном этапе выполнения проекта мы стремились ответить на вопрос о том, отличаются ли изогенные субпопуляции клеток p53wt A549 и p53null H1299, отсортированные с помощью FACS (CD44+ и CD133+), по сравнению с не-ОСК (CD44-/CD133-) по своей способности отвечать на повреждения ДНК и появление признаков «дормантности» или «покоя», в том числе полиплоидии, как ранних маркеров (предикторов) их чувствительности к генотоксическому стрессу. Для этого выделенные сублинии были подвергнуты воздействию ионизирующего излучения (ИИ) в дозе 5 Гр. Полученные результаты свидетельствуют о том, что облучение вызывало значительно более высокие уровни активности пути ATR-Chk1/Chk2 в субпопуляциях CD44-/CD133- и CD133+ клеток H1299 по сравнению с соответствующими субпопуляциями клеток A549, которые вызывают только активацию пути ATR-Chk2, как было продемонстрировано мультиплексным профилированием сигнальных путей ответа на повреждения ДНК/генотоксичности, вызванные ИИ. Субпопуляции CD44+ не продемонстрировали индуцированную ИИ активацию ATR, при этом значительно увеличивая только Chk2 и Chk1/2 в клетках, полученных из A549 и H1299, соответственно. По сравнению с клетками A549, все субпопуляции клеток H1299 установили повышенную индуцированную ИИ экспрессию γH2AX, белка репарации ДНК. В субпопуляциях CD44-/CD133- и CD133+ клеток А549 выявлена индуцированная ИИ активация опосредованного ATR-p53-p21 сигнального пути покоя клеток, в то время как ни одна из изогенных субпопуляций CD44+ обеих клеточных линий не обладала какими-либо признаками такой активности. Наши данные впервые показали, что ось взаимодействия транскрипционного фактора MITF и FAM3 Регулирующая метаболизм сигнальная молекула C (FAM3C) задействована в p53-дефицитных клетках H1299, особенно в их популяциях CD44+ и CD133+, в ответ на ИИ, что требует дальнейшего изучения. Опосредованное p21 состояние покоя, вероятно, является преобладающим путем выживания в популяциях CD44-/CD133- и CD133+ клеток A549, на что указывает визуализация высокого разрешения одиночных клеток и анализ Ki67- и EdU-связанной флуоресценции после воздействия ИИ. Оценка доли SA-β-Gal- положительных клеток выявила вызванное клеточным стрессом преждевременное старение (SIPS), которое, вероятно, значительно влияет на временное состояние покоя клеток H1299. Впервые продемонстрированы фракции полиплоидных гигантских и/или многоядерных раковых клеток (PGCC/MGCC) с фенотипом Ki67low, прогрессивно увеличивающиеся преимущественно в клетках CD44+ и CD133+ A549 через 24-48 ч после ИИ. Напротив, обогащение фенотипа Ki67high в одних и тех же фракциях всех отсортированных клеток H1299 свидетельствует об увеличении их активности в отношении пролиферации/реорганизации гетерохроматина после вызванного воздействием ИИ стресса. Наши результаты показали, что переход в состояние покоя, а не в SIPS, опосредованный p21, может играть значительную роль в выживании p53wt ОСК-подобных клеток НМРЛ после ИИ. Полученные результаты важны для выбора терапевтических схем лечения больных НМРЛ в зависимости от функционирования системы р53 в опухолевых клетках. Транскриптомный анализ путей репарации ДНК клеток НМРЛ, выживших после фракционированного воздействия ионизирующего излучения выявил 322 дифференциально-экспрессируемых гена (log10(контроль)>1, |log2FC|>1) между выжившими после облучения и контрольными клетками А549. Из них 164 гена были активированы, а 158 генов — подавлены в А549HR клетках. Изменения активности генов в клетках, дефицитных по р53, были более значительными. Всего были обнаружены различия в 1628 дифференциально-экспрессируемых генах (log10(контроль)>1, |log2FC|>1) в выживших после облучения и родительских клетках Н1299. При этом 808 генов были активированы, а 820 — подавлены в выживших после облучения клетках Н1299HR. Выжившие после облучения А549HR и Н1299HR клетки продемонстрировали активацию сигнальных путей выживания и G2/М прогрессию клеточного цикла, вовлекающих киназу АТМ. Однако в клетках А549HR, в отличие от Н1299HR, обнаружена активация той части пути BRCA1, которая участвует в регуляции структуры хроматина в клетках, вызывая его крупномасштабную деконденсацию. Ожидаемым было обнаружение активации киназы ATR в клетках А549HR для репарации спонтанных ДР ДНК путём ГР. Путь НГСК также активируется в этих клетках. В Н1299HR клетках ГР активируется через путь Fanconi anemia, включающий рекомбиназу RAD51, а также опухолевые супрессоры BRCA1 и BRCA2. Полученные данные чрезвычайно важны для разработки противопухолевой терапии, поскольку одновременное нацеливание на АТМ и компоненты ГР и НГСК путей репарации ДНК может способствовать успешной терапии пациентов с НМРЛ.