Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. Проведены наблюдения за гибридной зоной между Mytilus edulis и M. trossulus в водах Кольского полуострова. Дополнены и обобщены, в части временной динамики, данные за 15 лет исследований зоны в региональном и локальном масштабах. Показано, что за период наблюдений повсеместно сократилась доля M. trossulus, на 30-40%. Динамика, отчасти, обусловлена естественным отбором, действующим на бентосную стадию жизненного цикла мидий, о чем свидетельствует снижение доли генов M. trossulus в одних и тех же генерациях во времени. 2. В совместных с французскими коллегами работах изучена, методами популяционной геномики, интрогресия на примере мидий. В независимых природных экспериментах по гибридизации между одними и теми же видами паттерны интрогрессии, в первую очередь, связаны не с экологическими условиями, а с тем, какие эволюционные линии видов гибридизуют. Если одни и те же линии, то паттерны будут сходными. Если разные линии, то паттерны будут разными. В гибридных зонах, за редким исключением, разные локусы интрогрессируют сходным образом. Гетерогенность интрогрессии становится очевидной по мере удаления от гибридных зон. Гетероспецифичные аллели по некоторым локусам глубоко проникают вглубь ареалов. Для объяснения таких «комет интрогресии» обычно привлекают гипотезу адаптивной интрогрессии. Теория гибридных зон, однако, предлагает и другие объяснения. Методика SNP-типирования мидий, примененная в этих исследованиях, успешно апробирована на базе Научного парка СПбГУ. Мы можем проводить SNP типирование мидий на своей базе. 3. В исследованиях мидий из гибридных зон, особей обычно классифицируют на «чистопородных» представителей видов и гибридов по одному-трем «диагностическим» локусам, интерпретируя гомозиготы по конспецифичным аллелям как «чистопородных», остальных как гибридов. Этот подход предполагает, что гибридизация не идет дальше первого поколения, а интрогрессией по «диагностическим» локусам можно пренебречь. Мы обобщили доступные данные по структуре выборок из гибридных зон между M. edulis и M. trossulus по самым часто используемым маркерам. Используя выборки, типированные по всем маркерам и «reference-free» популяционно-генетические методы, мы предсказали частоты аллелей в гибридизующих популяциях. Оказалось, что разные гибридные зоны радикально различаются по степени гибридизации/ смешения и локус-специфической интрогрессии. Универсальных «малолокусных» методов быть не может, потому что «диагностических» маркеров нет. Для некоторых гибридных зон «малолокусные» методы не применимы, из-за беккроссинга. 4.1 Мы провели анализ большого массива данных из Белого и Баренцева морей и на этом материале отработали статистическую процедуру диагностики объектов (гибридизующих мидий двух видов, M. edulis и M. trossulus) по бинарному полу-диагностическому конхологическому маркеру. При моделировании мы учитывали, что определение видов по таким маркерам является вероятностным и зависит от таксономического состава поселений. Методические приемы работы с полудиагностическими признаками будут востребованы, поскольку такие признаки широко используют ученые для различения гибридизующих видов, подвидов, многих «криптических» видов. 4.2. Дополнены и обобщены данные по современному распределению и исторической динамике M. trossulus и M. edulis в Кандалакшском заливе Белого моря. Отдельные «пятна» инвазивного вида M. trossulus встречены в разных частях акватории. Есть статистически значимая связь частоты M. trossulus с расстоянием до ближайшего порта и с расстоянием до устья ближайшей реки: по мере удаления от устьев рек или от акваторий портов доля M. trossulus сокращается. Для изучения исторической динамики обработаны коллекции раковин 1970х-2010х гг. сбора. Обилие M. trossulus в современных сборах выше, чем в коллекционных. Результаты исследования согласуются с гипотезой о недавнем вселении M. trossulus в Белое море морским транспортом. Вероятно, устья рек, как места свободные от конкурирующего нативного вида (т.е. M. edulis), служат «рефугиумами» для вида-вселенца. 5. Отработана методика морфологического анализа мидий разных видов из районов симпатрии, где морфологические различия между видами скрадываются из-за гибридизации и единообразных условий обитания. Показано, что использование комплекса из 6 стандартных признаков наиболее эффективно для дискриминации M.galloprovincialis–подобных мидий («чистопородных» и гибридов с аллелями M. galloprovincialis). 6. Отработаны гистологические и цитлфлюориметрические методы выявления диссеминированной неоплазии у Bivalvia. Среди дальневосточных M. trossulus обнаружено несколько экземпляров с аномальными гемоцитами (гемоциты имеют повышенную плоидность, увеличенные ядра и необычный цитоскелет, не распластываются на стекле и на пластике, легко открепляются от покровных стекол при иммунохимических окрасках). Характеристики этих гемоцитов совпадают с таковыми болеющих заразным раком (СТС) мидий из Британской Колумбии. У Mya arenaria из Белого и Баренцева морей обнаружено другое раковое заболевание – карцинома, характеризующееся повышенной пролиферацией жаберного эпителия. 7. Морфологический анализ выборок атлантической сельди Clupea harengus из Атлантики и тихоокеанской сельди C. pallasii из Пацифики показал различия между видами по средним значениям ряда признаков, а также по уровню флуктуирующей асимметрии. Отобраны признаки для исследования фенотипического эффекта гибридизации на средние значения признаков и на уровень стабильности развития. 8. Секвенировали 49 транскриптомов Мacoma balthica, в дополнении к 22 изученным ранее. Выборки охватывали почти весь ареал вида. Риды были выровнены на ранее опубликованный транскриптом вида. Провели поиск полиморфных генетических вариантов и первичный анализ популяционной структуры. Всего, выявили 7542 полиморфных однонуклеотидных полиморфизмов, которые могут использоваться для популяционно-генетических исследований. Дополнительно, восстановили около 70% длины митохондриального генома. Анализ ядерных и митохондриальных данных выявляет тихоокеанский и атлантический (под)виды, и широкие зоны интрогрессии между ними в Баренцевом, Белом и Балтийском морях. Уровень генетического смешения, или интрогрессии, варьируется от 35% до 95% в разных популяциях. Таким образом, у маком мы наблюдаем не классическую гибридную зону (узкую, с четкими границами), а минимум две (Балтика, с одной стороны, Баренцево и Белое моря, с другой) широкие зоны с уникальными чертами в каждой из них. Эти зоны структурированы. Генотипы из некоторых популяций внутри зон группируются в четкие кластеры. Полученные данные хорошо согласуются с выводами старых аллозимных исследованиях о сущности популяций маком северных морей Европы и России как протяженного, сложно структурированного «гибридного роя». 9. По результатам секвенирования митохондриального локуса у каждой из дальневосточных мидий, болеющих диссеминированной неоплазией, найдена гетероплазмия в пораженных раком тканях. По результатам клонирования ПЦР-продуктов локуса EFalpha у этих мидий выявлено 3-4 аллели (против 1-2 ожидаемых в диплоидном генотипе), из них 2 характерные для раковой линии BTN2.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Проведен очередной этап мониторинга гибридной зоны между мидиями Mytilus edulis и M. trossulus в Кольском заливе, также обработаны коллекционные сборы мидий 2009-10 гг. сбора. Если в северной части залива виды формируют мозаичную зону, то в южной - типичную клинальную зону, шириной 8 км. Это на порядок меньше величины потенциальной популяционной дисперсии у мидий. Вслед за классиками (Harrison 1993; Arnold, 1997) мы рассматривали клинальную и мозаичную зоны как альтернативные фундаментальные сущности и задавались вопросом: «может ли гибридная зона быть выражена в пространственном масштабе, меньшем, чем масштаб популяционной дисперсии гибридизующих видов?». Теперь мы знаем, что, в зависимости от экологических условий, одни и те же генофонды могут формировать как мозаичные, так и клинальные зоны, в масштабе, меньшем, чем масштаб потенциальной популяционной дисперсии видов. 2. В аквариальных условиях изучены конкурентные отношения между Mytilus edulis и M. trossulus в симпатрии. Показано угнетение M. edulis в плотных поселениях M. trossulus, что может объяснять успех последнего вида в ходе его экспансии, наблюдаемой в Белом море в последние десятилетия. 3. Отработаны методы микросателлитного анализа морских сельдей (Clupea pallasii, C. harengus) и SNP-типирования мидий. Популяции сельдей норвежских фиордов Россфиорд и Балсфиорд оказались сходны с беломорской сельдью (C. pallasii), а не обычной норвежской C. harengus. Это согласуется с гипотезой о том, что сельди Россфиорда и Балсфиорда - реликтовые формы тихоокеанской сельди C. pallasii. По 19 маркерам, включая 15 однонуклеотидных, отработаны методы молекулярной идентификации всех трех видов мидий, встречающихся в северной Атлантике (Mytilus edulis, M. trossulus, M. galloprovincialis) и межвидовых гибридов. Охарактеризована своеобразная «арктическая» линия M. galloprovincialis (одного из важнейших инвазивных видов на земле, угрожающая северным морям России), и описана структура выборки из уникальной гибридной зоны в Норвежском море, где со-существуют и гибридизуют все три вида мидий. 4. По мультилокусным данным (больше тысячи несцепленных SNP маркеров, выявленных в транскриптомах) изучены пространственные паттерны гибридизации в двух географически удаленных гибридных зонах между Limecola balthica и L. rubra в Балтийском и в Баренцевом морях. Результаты согласуются с нашей моделью, постулированной ранее: гибридные рои (низкая межиндивидуальная изменчивость по доле генов двух видов, слабый отбор против рекомбинантных генотипов) с повышенной частотой генов L. balthica, с одной стороны, и чистопородные популяции L. rubra, с другой, разделены гибридными зонами (высокая межиндивидуальная изменчивость, сильный отбор). 5. Изучена остеологическая изменчивость двух видов сельди, атлантической и тихоокеанской, и их интрогрессированных - «гибридных» популяций в Европе. Средние значения меристических признаков обнаруживают связь с генетическими особенностями популяций. Атлантическая сельдь занимает наиболее обособленное положение по отношению к остальным выборкам, а гибридная форма из Россфьорда занимает промежуточное положение между атлантической сельдью и популяциями с доминированием генов C. pallasii. При анализе флуктуирующей асимметрии не отмечено повышенного уровня изменчивости у рыб из «гибридных популяций», которого можно было бы ожидать в случае нарушения генетической коадаптации у гибридов. 6. На примере полиморфной выборки мидий из Норвегии, где намешаны гены сразу трех видов (Mytilus edulis, M. trossulus, M. galloprovincialis), оценен вклад в фенотипическую изменчивость популяции «таксономического сродства» особей. Показано, что форма раковины у мидий в условиях гибридизации варьируется в широких пределах и утрачивает видоспецифические черты, выявляемые при анализе «чистых» популяций. 7. Проверена гипотеза индукции анеуплоидии в гемоцитах мидий за счет инкубации аномальных (опухолевых) гемоцитов с нормальными гемоцитами здоровых мидий. За пять суток культивирования индукции не произошло. В ходе экспериментов показано, что после 10 месяцев криохранения здоровые и неопластические гемоциты сохраняют жизнеспособность и адаптируются к условиям культуры. 8. Освоена методика диагностики инфекционного рака мидий линии BTN2 с помощью qPCR, предложенная Yonemitsu et al 2019. Оценена надежность методики. Наличие ложноположительных результатов обосновывает необходимость дальнейшего совершенствования метода. 9. Обобщены собственные и литературные данные о нарушениях двоякого однородительского наследования (DUI) митохондрий (мтДНК) у гибридизующих мидий Mytilus edulis и M. trossulus. В литературе доминирует точка зрения, что мтДНК генотипирование не информативно для определения пола и вида симпатрических мидий, из-за интрогрессии и нарушений DUI, связанных с межвидовой гибридизацией. В своем материале мы не увидели ни масштабной интрогрессии, ни масштабных нарушений DUI. МтДНК генотипирование по кодирующим локусам – валидный метод определения пола и вида у мидий в океанических (не балтийских) популяциях M. edulis и M. trossulus. 10. Кодирующие части митохондриальных геномов линии СТС мидий BTN2 соответствуют женской, а большая часть контрольных регионов – мужской мтДНК. Такие молекулы могут возникать только в результате рекомбинации между F-мтДНК и M-мтДНК. Поскольку M-мтДНК в норме присутствует в только герминативной ткани самцов (Cao et al. 2004), наличие у BTN2 фрагмента M-мтДНК может указывать на пол «пациента зеро» - особи, у которой возник заразный рак, и на ткань происхождения раковых клеток. 11. Получены образцы гемолимфы и контрольных тканей мидий с лейкемией для геномного исследования.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
(1) Исследования трансмиссивного рака. На примере мидий Mytilus Японского моря мы отработали методику диагностики диссеминированной неоплазии (DN) и трансмиссивной неоплазии Mytilus (BTN) (Skazina et al. 2021). Используя эти методические заделы, мы провели диагностику DN и BTN в обширном материале из дальневосточных морей России. Почти во всех выборках мы нашли рак. Из двух эволюционных линий BTN в дальневосточных морях встречаются обе, причем в одних и тех же популяциях, в одном случае вместе с нетрансмиссивной неоплазией. Используя собранные коллекции раковых образцов, мы разработали экспресс тесты на BTN, основанные на а) детекции митохондриальной гетероплазмии методом прямого секвенирования COI из гемолимфы и мышечной ткани особей, б) детекции уникальных для каждой из двух линий рака аллелей ядерного локуса EF1a в гемолимфе с помощью ПЦР в режиме реального времени. Мы также секвенировали первые транскриптомы BTN двух линий и нетрансмиссивного рака. Поиск трансмиссивного рака у другого моллюска – макомы Limecola (=Macoma) balthica, пока, не дал однозначных результатов. У единственной найденной макомы с DN не удалось показать гетероплазмию, ожидаемую при трансмиссивном раке. (2) Исследования паттернов гибридизации и интрогрессии у маком комплекса Limecola balthica, мидий комплекса Mytilus edulis и морских сельдей Clupea spp. в Европе. В каждом случае аборигенный атлантический вид или подвид гибридизует с инвазивным тихоокеанским видом. Clupea spp. Завершено микросателлитное генотипирование выборок сельди из северо-восточной Европы. Результаты подтверждают гипотезу проекта о том, что различия между географическими и сезонными расами тихоокеанской C. pallasii в северо-восточной Европе связаны с интрогрессивной гибридизацией этого вида с атлантической C. harengus. Популяции Балсфиорда и Россфиорда родственны C. pallasii. Однако на их генофонды сильно повлияла интрогрессия генов C. harengus (вклад генов атлантической сельди порядка 30%). Приметы интрогрессии есть у беломорской C. pallasii (порядка 10% генов C. harengus) и у C. harengus Тронсхеимфиорда (порядка 5% генов C. pallasii). Из-за того, что в 2020 году провести лов беломорской сельди (C. pallasii) на нерестилищах не удалось из-за карантина, мы провели эту работу в 2021. Подавляющее большинство пойманных рыб принадлежит к C. pallassii. Однако некоторое число особей относятся к C. harengus, среди них из них есть особи в нерестовом состоянии. Это указывает на возможность межвидовой гибридизации. Морфологически, гибридов идентифицировать невозможно. Гипотеза будет проверена генетически. Limecola balthica. В результате трехлетних усилий по нас оказалось 117 генотипов маком L. balthica, охарактеризованных по 1392 ядерным, несцепленным, менделирующим SNP и митохондриальным геномам. Генетические отличия между европейскими популяциями тихоокеанской L. b. balthica связаны, во-первых, с разным уровнем интрогресии генов M. b. rubra во-вторых, со структурой интрогрессии. Лучше всего это заметно в популяциях Мурмана, где по одним локусам «завышены» частоты «тихоокеанских» аллелей, а по другим «атлантических». Европейские популяции L. b. balthica, интрогрессированные генами L. b. rubra, представляют интерес с точки зрения изучения ядерно-цитоплазматического неравновесия, поскольку в них циркулируют атлантические и тихоокеанские митохондриальные линии с высоким уровнем дивергенции. Внутри этих популяций, выборки с атлантической и тихоокеанской МтДНК линиями различаются по частотам ядерных генов, вовлеченных в митохондриальные комплексы. Но только для гена, кодирующего субъединицу О митохондриальной АТФ-синтазы (ATP5O), различия видны во всех изученных популяциях. Mytilus. Благодаря опубликованию методики морфологического определения «криптических» видов мидий M. edulis и M. trossulus (Khaitov et al. 2021; работа представлена не как частное исследование мидий, а как формальная процедура идентификации не полностью дискретных морфологически таксонов), мы смогли интерпретировать таксономическую структуру новых и коллекционных выборок мидий без трудоемкого генотипирования. Обработан большой массив данных по пространственному, в частности биотопическому распределению видов, а также по их временной динамике в Кандалакшском и Кольском заливах. В последние годы повсеместно происходит экспансия инвазивного (тихоокеанского) M. trossulus. Генотипировав две выборки из смешанных поселений по большой батарее диагностических маркеров, мы впервые надежно оценили разнообразие немногочисленных (2% и 7% от выборок) межвидовых гибридов, представленных F1 и беккроссами. Анализ солидных аллозимных данных по гибридизующим мидиям в Баренцевом море (97 выборок, 5506 генотипов) принес следующий результат. Доля гибридов в поселениях этой гибридной зоны связана с соленостью. В районах, подвергающихся постоянному опреснению, гибридов значимо больше, чем на участках, удаленных от источников опреснения. Даже в строго-«бимодальных» гибридных зонах гибридизация регулируется не только пост-зиготическими, но и пре-зиготическими (экологических) механизмами.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Анализ собственных и коллекционных сборов мидий Mytilus из Кандалакшского залива Белого моря показал, что с начала 2000х годов там происходило повсеместное возрастание частоты M. trossulus и сокращение M. edulis; в последние годы это привело к смене доминирующего вида с M. edulis на M. trossulus в вершине залива. Обобщены данные о пространственно-временной динамике гибридной зоны между M. edulis и M. trossulus в Кольском заливе Баренцева моря. Показано, что в последние годы там тоже повсеместно происходила экспансия M. trossulus. Охарактеризована узкая (3 км) клинальная зона в вершине залива. Показана неслучайная связь частоты гибридов с солёностью: чем ниже солёность, тем больше гибридов. По данным ядерного (KASP) и МтДНК типирования мидий из Кольского залива, доля гибридов там варьируется от 5% в полносоленых местообитаниях до 30% в опресненных, «чистопордные» M. edulis и M. trossulus всегда имеют F-MтДНК своего вида, а 40% самцов M. trossulus лишены M-мтДНК, что говорит о нарушении двоякого однородительского наследования миДНК у этого вида. Показано, что в Белом море на нерестилищах встречаются вместе оба вида сельди, Clupea pallasii и C. harengus. Гибридизация между ними относительно редка, поскольку ни одного гибрида ранних поколений мы не встретили. Имеет место интрогрессия ядерных генов и мтДНК от Clupea harengus к C. pallasii, причем наблюдается «сцепление» между «многопозвонковостью» и чужеродным мтДНК у C. pallasii. C. pallasii и C. harengus хорошо различаются между собой по комплексу остеологических признаков. В тоже время морфологические дистанции между выборками C. pallasii с разным уровнем интрогрессии генов C. harengus слабо коррелируют с генетическими. Анализ флуктуирующей асимметрии морфологических признаков не показал примет "гибридной депрессии" в гибридогенных популяциях Россфиорда и Балсфиорда. Популяции Macoma balthica в Белом, Баренцевом и Балтийском морях традиционно интерпретировались как инвазивные популяции тихоокеанской M. balthica balthica, в разной степени интрогрессированные генами атлантической макомы M. balthica rubra. По результатам геномного исследования мы уточнили эту гипотезу. Генофонды Мурмана сформировались на базе предковых атлантических (rubra) популяций в результате древнего эпизода интрогрессии тихоокеанских генов. Генофонды Белого и Балтийского морей, напротив, сформировались на базе предковых тихоокеанских популяций в результате независимых, относительно недавних эпизодов интрогрессии атлантических генов. Обе линии трансмиссивного рака мидий (MtrBTN1, MtrBTN2), помимо Японского моря, встречаются в Кольском заливе Баренцева моря, в Охотском море и на океаническом побережье Камчатки. На Командорских островах отмечена только MtrBTN2. Для Кольского залива максимальная и общая зараженность составляют 1.1% и 0.5%, для окрестностей Магадана Охотского моря – 10% и 2.5%, соответственно. Максимальная в России и мире зараженность зарегистрирована на Камчатке, 14%. В Охотском море показана достоверная положительная связь между заболеваемостью MtrBTN и степенью волнового воздействия. Обе линии MtrBTN встречаются «в уловимых количествах» вместе в Охотском море и на Камчатке. На примере сборов из этих мест сравнили плоидность и ядерно-цитоплазматическое отношение у MtrBTN1 и MtrBTN2. У MtrBTN1 плоидность оказалась ниже, а ядерно-цитоплазматическое отношение - выше, чем у MtrBTN2. Таким образом, две независимые эволюционные линии MtrBTN в симпатрии отличаются цитологически. С помощью аллель-специфичной количественной ПЦР определены генотипы моллюсков из Кольского залива, инфицированные MtrBTN. Из 6 инфицированных мидий, пять оказались M. trossulus, одна - гибридом между M. edulis и M. trossulus. Проникшая в Европу через Кольский залив эволюционно молодая линия MtrBTN1 угрожает там не только «родительскому» виду, M. trossulus, но и атлантической мидии M. edulis. Разработан и впервые применен новый подход диагностики трансмиссивного рака у мидий - секвенирование фрагментов диагностических локусов на базе платформы Illumina. Высокое разрешение метода позволило уточнить генотипы MtrBTN, в частности обосновать наличие двух «штаммов» у MtrBTN2 и доказать возможность двойного заражения моллюсков этими штаммами. Нам удалось культивировать неопластические клетки мидий, инфицированных MtrBTN2, в течение 28 дней, когда эксперимент был остановлен. Для сравнения, все культуры здоровых гемоцитов погибли в течение двух недель. Несмотря на все усилия, наши поиски неоплазии и трансмиссивного рака у M. balthica завершились безрезультатно. Также в наших сборах не оказалось ни одного генотипа, подобного описанному Michnowska et al. 2022 для BTN Macoma в Балтике. Анализ транскриптомов MtrBTN, мидий со спонтанным раком и контрольных здоровых мидий показал, что геномы трансмиссивного рака маркированы уникальными аллелями онкосупрессора p53. Неожиданным образом, обе линии MtrBTN имеют один и тот же p53 генотип. Всего, в транскриптомных данных выявили 17480 высококачественных несцепленных SNP. По этим маркерам, геномы двух линий трансмиссивного рака отчетливо отличаются друг от друга и от геномов мидий-хозяев, хотя уровень дивергенции линий BTN на фоне полиморфизма мидий-хозяев не велик. Уровень дивергенции MtrBTN2 от родительского вида (M. trossulus) выше, чем MtrBTN1, что согласуется с гипотезой о разном эволюционном возрасте двух линий и относительной молодости MtrBTN1.