Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Результаты работы изложены в соответствии с объектами. 1. Транспозоны (SINE) в развитии морского ежа Первый год выполнения гранта отличался техническими трудностями организации взаимодействия с ОИ (Ресурсный центр СПбГУ). Поэтому собрать транскриптомы S.intermedius, геном которого отсутствует в базах данных, до конца не удалось. Однако, анализ повторов типа транспозонов (ТЕ) в сырых ридах транскриптомов дальневосточного ежа по сравнению с транскриптомами американского S.purpuratus, находящимися в открытых базах данных и использованными для исходного анализа, показало, что различия в последовательностях ТЕ минимальны. Именно это важно для целей настоящего проекта, где предполагается, что ТЕ являются частью lncRNA. Мы пришли к выводу, что развитие дальневосточного ежа S.intermedius может быть использовано для закономерностей, выявленных при биоинформатном (in silico) анализе транскриптомов развития S.purpuratus. (статья Лебедев и др, 2019; DOI: 10.1134/S0134347519060056) Ход работы изложен в 1 разделе дополнительных материалов (ДМ). (1) по уровню экспрессии ТЕ в транскриптомах оцененных как TPM (transcripts per million) или FPKM (fragments perkilobase per million mapped fragments) построены heat-map ~200 первых по содержанию ТЕ (рис.1, ДМ) ; (2) выявлены ТЕ разных классов с постоянно высокой, постоянно низкой и максимально дифференциальной экспрессией (рис.1 ДМ, приведены слева); (4) предсказания in silico проверены экспериментально ПЦР на соответствующих праймерах и кДНК транскриптомов 7 стадий (можно проверить больше стадий, чем in silico); (5) оказалось, что дифференциальная экспрессия существует не только для отдельных ТЕ, но и для их фрагментов, т.е. впервые показана роль процессинга конкретных lncRNA в развитии. Экспериментальная проверка экспрессии ТЕ столкнулась с неожиданными трудностями (нестабильностью и противоречивостью результатов), которые стали понятны только после подбора адекватных праймеров на основании экспрессирующихся фрагментов ТЕ. Одним из классов ТЕ, показавших максимальную дифференциальную экспрессию, оказались SINEs. Выбрали 12 SINEs, проанализировали их состав (рис.2, ДМ); На примере SINEs хорошо видно, что экспрессируются не консенсусные последовательности, а только их фрагменты и, видимо, они и входят в состав lncRNA (рис. 3 ДМ). Именно эти фрагменты учитывали для экспериментальной проверки экспрессии и на их основании заказаны олиги (рис.4 ДМ). Предварительные результаты показывают, что 10 из 12 проб давали при РНК-ДНК FISH аналогичную картину – на стадии 4х бластомеров транскрипты соответствующих SINE содержатся только в одном бластомере; в 2х случаях окрашивались по 2 бластомера.Неожиданный и важный результат, который может пролить свет на известное и необъяснимое обогащение SINEs всех обогащенных генами районов, т.е. принципиально важен для всей геномики, нуждается в доводке и дополнительных доказательствах, что и определяет планы на следующий год. 2. Транспозоны LINE в жизненном цикле трематоды Проведено секвенирование редий, которые служили для определения клональной изменчивости церкарий, что оказалось необходимо и достаточно для интерпретации полученных результатов. Материал для секвенирования транскриптомов остальных стадий получен, обработан до библиотек и будет секвенирован в 2020г. Проведен анализ последовательностей, составляющих картины генотипирования партеногенетических личинок. Фрагменты кодирующей части CR1 ретроэлемента (обратной транскриптазы (RT), класс LINE) и некодирующей части элемента представлены в транскриптоме в значительных количествах, но в разных транскриптах (рис. 5, I, ДМ). Локализация кодирующей и линкерной частей CR1 (LINE) впервые показана в разных частях хромосом — факультативном или конститутивном гетерохроматине с помощью флуоресцентной in situ гибридизации — FISH (рис. 5, II, ДМ). Материал работы находится в стадии отправки статьи (submission). Для того, чтобы выявить ТЕ с дифференциальной экспрессией в зависимости от стадии цикла выбрали трематоду Fasciola hepatica, печёночную двуустку, активного вредителя скота, опасного для человека, но с прочитанным геномом. Геном размером около 1Gb и в Genbank есть данные о транскриптомах четырех стадий жизненного цикла. Проведен поиск ТЕ в геноме F.hepatica, определены доминирующие по количеству семейства — SR2, RTE, CR1, Perere (LINE), Saci-1, Saci-3, Gypsy (класс LTR). Проведен анализ экспрессии ТЕ (lncRNA) в транскриптомах яйца, метацеркарии, мариты и вылупившейся из цисты ювенильной стадии (newly emerged juvenile). Выявлены ТЕ с наибольшей дифференциальной экспрессией: ДНК-транспозоны CMC-EnSpm, LINE ретроэлементы Zenon, Penelope и LTR-ретроэлемент Gypsy. Также уровень экспрессии TE значительно изменения на стадии метацеркарии (жизненный цикл). Некоторые TE имеют сниженный уровень экспресии (например, CR1 (LINE) и Pao (LTR)). Подготовка статьи к публикации планируется на 2020 г. Гипотеза о самостоятельном значении фрагментов ТЕ, в частности LINE, и их транскриптов, подтверждается на трематодах и дополняет предыдущий раздел. 3. Транскрипты тандемных повторов (ТП) в ооците лягушки На основании предварительных результатов секвенирования тотальной РНК ядра ооцита и анализа транскриптома выявлены три ТП и именно их учитывали при приблизительной оценке их количества в ридах очищенного транскриптома (рис. 6, А, ДМ). Значительное количество lncRNA, основанных на вновь обнаруженных ТП (~20%) выявлено в ооците впервые. Доказано наличие предсказанных ТП в геноме лягушки методом ПЦР (рис. 6, В, ДМ) и подготовлены метафазные хромосомы и олиго-пробы для локализации ТП в геноме методом FISH. Проведено секвенирование РНК капсулы кариосферы ядра ооцита в ОИ (РЦ Биобанк СПбГУ) и начат анализ транскриптома на базе ВЦ. Проводится анализ FPKM для ТЕ и ТП lncRNA ядра ооцита и капсулы. Оказалось, что предположение об обогащении РНК капсулы кариосферы ТП ошибочно: в ядре больше транскриптов ТП, чем в капсуле. В связи с этим возникла задача секвенирования РНК фракции нуклеоплазмы. Препараты подготовлены и секвенирование будет проведено в 2020г. Проводится анализ мРНК генов, которые присутствуют в транскриптомах ядра и капсулы кариосферы. (статья Ilicheva et al., 2019 DOI: 10.1002/jcb.28767) 4. Тандемные повторы (ТП) свиньи и укладка хроматина Транскрипция ТП сопровождает переломные, ключевые, моменты развития. Однако, видоспецифичность ТП затрудняет изучение: для каждого прочитанного генома нужна собственная классификация, что и сделано для генома свиньи. Результат не был запланирован в гранте, но работа выполнена в рамках гранта и статья содержит ссылку на финансирование. В геномной сборке свиньи Sus scrofa (в базе данных NCBI Sscrofa10.2) выявлен набор тандемных повторов (ТП), характерных для вида, некоторые из них картированы методом FISH на метафазных хромосомах с помощью рассчитанных коротких олигонуклеотидных проб (Sscrf_335A, Sscrf_243A, Sscrf_15A, Sscrf_50A). Все ТП, присутствующие в базе данных Repbase для свиньи, выявляются с помощью биоинформатических методов, но кроме них найдено еще 18 новых семейств ТП. Набор найденных ТП в сборке Sscrofa10.2 по сравнению с человеком и мышью отличается бóльшей длиной мономеров. С помощью сконструированных зондов проследили за укладкой центромерного района при сперматогенезе. Мы показали: 1) сконструированные нами зонды выявляют Мс- и Ас-наборы хромосом; 2) в сперматозоидах существует характерный паттерн для каждого зонда (Рис. 7, ДМ); 3) центромерные зонды дают возможность наблюдать сборку центромерного района (Рис. 8, ДМ). Часть работы опубликована в журнале Генетика (Иванова и др, 2019, DOI: 10.1134/S102279541907007X), часть находится в процессе подготовки публикации в журнал Cytogenetic Genome Research.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020, в связи с обстоятельствами непреодолимой силы, направление работ вынужденно сильно скорректировано. Из-за невозможности экспедиций все работы с сезонными объектами (морской еж (1), морские трематоды (2) оказались заторможены. Ресурсный центр СПбГУ (партнерское ОИ) часто закрывался из-за общего карантина СПбГУ. На первый план в 2020 году вышли работы с человеческим материалом (транскрипты ТП в ооцитах человека (5), теломерный комплекс фибробластов кожи человека (2), картирование ТП хомяков (7), а также работы, которые можно вести in silico с удаленным доступом (бактериофаги как векторы горизонтального переноса (3), анализ транскриптомов трематоды (2) и ооцита лягушки (6) Результаты работы изложены в соответствии с объектами. 1. Транспозоны (SINE) в развитии морского ежа. Закончен in silico анализ дифференциальной экспрессии транспозонов (ТЕ) на разных стадиях развития морского ежа. Гибридизацию на уже рассчитанные и заказанные зонды (фрагменты SINE) планируем провести в начале 2021 года. Активно проводится картирование SINEs вблизи генов, разбитых на группы в соответствии со степенью их дифференциальной экспрессии в эмбриогенезе. В результате надеемся получить корреляцию между дифференциальной экспрессией SINEs (ТЕ) и генов определенных групп. Работа исходно организована таким образом, что in silico анализируем хорошо собранный геном одного вида, однако результаты предсказаний вынуждены проверять на другом виде. Поэтому сравнили сборки геномов разных видов морских ежей и репертуар входящих в них последовательностей для того, чтобы иметь представление о возможных ошибках. В результате сравнения разных сборок геномов морских ежей можно видеть, что дальневосточный еж Strongilocentrotus intermedius, развитие которого доступно для экспериментальной проверки, эволюционно близок к ежу S.purpuratus, сборка генома которого оказалась лучшей из существующих. 2. Транспозоны класса LINE в жизненном цикле трематоды. Из предоставленного сотрудниками ЗИН РАН экспедиционного материала получена РНК для секвенирования транскриптомов 2 стадий жизненного цикла (метацеркарии и церкарии трематоды H.elongata; секвенирование проведено на базе ресурсного центра «Биобанк» начата их сборка. В связи с трудностями 2020г (отсутствие экспедиции и ограничения ОИ СПбГУ) провели in silico анализ генома и транскриптома инвазивного для человека вида трематоды Fasciola hepatica. Выявлены отдельные ТЕ, транскрипция которых характерна для конкретных стадий. Уровень экспрессии TE значительно изменения на стадии метацеркарии. Сравнение дифференциальной экспрессии ТЕ и генов показывае, что ТЕ экспрессируются более избирательно относительно стадии, чем гены. 3. Бактериофаги как векторы горизонтального переноса. Известно, что горизонтальный перенос генов широко распространен у прокариот: архей и бактерий. В нашей работе показано, что бактериофаги могут выступать посредниками горизонтального переноса генов прокариот в геномы эукариот. В результате таких событий образуются белки химерного происхождения, которые наполовину состоят из эукариотического участка и наполовину из участка бактериального происхождения (Daugavet et al., 2019 DOI: 10.1186/s13100-019-0146-7). Химерные белки присутствуют у самых разных эукариотических организмов, которые включают основные группы грибов и многоклеточных животных (Daugavet et al. 2020, 10.1186/s12859-020-03599-y). Возможно, такие белки участвуют в антибактериальной защите организма. Далее мы показали, что векторами переноса чаще всего становятся бактериофаги семейства Caugovirales. Мы нашли предполагаемые векторы для определённых бактериальных доноров генетической информации - бактериофаги, специфичные к этому донору. 4. Участие теломер и lncRNA TERRA в организации хроматина. Определена роль неупорядоченного района теломер-связывающего белка udTRF2 в связывании с ламинами. Выявлен набор белков, который связывает шелтериновый комплекс через udTRF2. Среди выявленных белков оказалось несколько, связывающих РНК TERRA, некодирующую РНК, входящую в теломерный комплекс. Статья Travina AO, Ilicheva NV, MittenbergAG, Shabelnikov SV , Kotova AV, . Podgornaya OI. The long linker region of telomere-binding protein TRF2 is responsible for interactions with lamins прошла первую рецензию и после переработки представлена в журнал International Journal of Molecular Sciences (MDPI, Q2) 5. Транскрипты ТП как компоненты lncRNA в ооцитах человека. Показана транскрипция прицентромерных сателлитов в позднем оогенезе человека, но не мыши. Показано наличие транскриптов в безмембранных структурах в овулирующих ооцитах. Статья опубликована. M. A. Dobrynin, N. M. Korchagina, A. D. Prjibelski, D. Shafranskaya, D. I. Ostromyshenskii, K. Shunkina, I. Stepanova, A. V. Kotova, O. I. Podgornaya & N. I. Enukashvily. Human pericentromeric tandemly repeated DNA is transcribed at the end of oocyte maturation and is associated with membraneless mitochondria-associated structures. Sci Rep 10, 19634 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-76628-8, Q1 6. Транскрипты тандемных повторов (ТП) в ооците лягушки. В 2020 году опубликован геном травяной лягушки Rana temporaria (NCBI assembly: GCA_009802015.1.) Появление генома потребовало верификации полученного своими силами транскриптома. Обнаружили ряд ошибок. Транскриптом ооцита R.temporaria проанализировали снова с акцентом на наличие повторяющихся элементов и учетом ошибок. В ходе анализа получили достоверные данные о предполагаемом размере полей ТП, количестве копий в геноме по сборке, количестве копий в транскриптоме ядра ооцита, количестве копий в сырых прочтениях генома. Видно, что количество ТП в геноме совершенно не коррелирует с эффективностью его транскрипции в ооците. Только один из найденных ТП – 494А, описан в базах данных как мажорный сателлит S1a. Методом FISH определена локализация как сателлита S1a на метафазных хромосомах R.temporaria так и остальных 5 ТП. Они также располагаются в основном в прицентромерном районе, что свидетельствует об адекватных методах биоинформатики. Дальнейшая работа предполагает (1) кариотипирование, т.е. определение какой ТП принадлежит какому набору хромосом; (2) использование олигов для определения позиции их транскриптов в ооците лягушки. 7. Тандемные повторы хомяков С помощью пробы CG33A (ТП китайского хомяка) доказано, что с помощью ТП проб мы наблюдаем сборку одного центромера. Картина гибридизации на клетках сперматогенного ряда напоминают одну из схем, известных по литературе (Strukov et al., 2003). Теперь эту схему можно считать доказанной для пери-центромерного района, где расположена основная масса ТП. Статья принята в печать (Ivanova N, Ostromyshenskii D, Podrornaya O. Tandem repeats based probes support loop model of pericentromere packing. Cytogenetic and Genome Research. 2021. DOI: 10.1159/000513228) В продолжение работы с хомяками проведено сравнение наборов ТП у близких видов хомяков Cricetulus griseus и Cricetulus barabensis. ТП китайского хомяка (C.griseus) определены по опубликованному геному, геном барабинского хомяка отсутствует. Показана разница в содержании и распределении ТП у близких видов китайского и барабинского хомяков in situ. Иллюстрации к результатам приведены в файлах Дополнительных материалов (FileRep.pdf, File.pdf) к формам 1о и 3о.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Результаты работы изложены в соответствии с объектами. 1. Анализ генома и транскриптомов морского ежа S.purpuratus, доступных в базах данных проведен методами информатики. Результаты публикованы Panyushev, N.; Okorokova, L.; Danilov, L.; Adonin, L. Pattern of Repetitive Element Transcription Segregate Cell Lineages during the Embryogenesis of Sea Urchin Strongylocentrotus purpuratus. Biomedicines 2021, 9, 1736. https://doi.org/10.3390/ biomedicines9111736. Последний автор Л.С.Адонин был основным исполнителем грантов РНФ 15-15-20026 (Механизмы молекулярного распознавания у морских организмов для создания новых биомедицинских технологий" и настоящего гранта (19-74-20102). Морской еж как модель использовали в рамках гранта 15-15-20026, предварительные результаты затем послужили основанием для текущего гранта. В 2020г А.С.Адонин отказался предоставить результаты для отчета, был выведен из состава участников и уволен из Института цитологии РАН. Таким образом, работа разделилась на две линии. Как видно из приведенной публикации, биоинформатная часть закончена А.С. Адониными соавторами. Общая идеология работы основана на результатах и заделах в рамках РНФ грантов, что можно проследить по заявкам и отчетам. Цитированная статья не содержит упоминаний грантов РНФ. В качестве финансирования указан грант Министерства образования и науки. Однако, хоть и без упоминания грантов, поставленные задачи выполнены и результаты доведены до публикации. 2. ТЕ в геномах и их транскрипты (lncRNA) в жизненном цикле трематод. Доказано участие (транспозонов, ТЕ) в формировании клональной изменчивости трематоды H.elongata. Результаты опубликованы Solovyeva, A.; Levakin, I.; Zorin, E.; Adonin, L.; Khotimchenko, Y.; Podgornaya, O. Transposons-Based Clonal Diversity in Trematode Involves Parts of CR1 (LINE) in Eu- and Heterochromatin. Genes 2021, 12, 1129. https://doi.org/10.3390/genes12081129 (Q2 WOS) 2.1. Выявлены транспозоны (ТЕ) и повторы других классов, которые распознаются разными программами в геноме трематоды Fasciola hepatica (Рис.2 и таблица 2 файла доп.мат). В транскриптомах разных стадий жизненного цикла трематоды определены TPM (кол-во транскриптов) и построены тепловые карты. Максимальную изменчивость транскрипции обнаружили ДНК-ТЕ семейства CMC-EnSpm., LINE ТЕ Zenon и Penelope, LTR ТЕ Gypsy и ряд неизвестных ТЕ. Минимальное количество транскриптов генов и в то же время максимально количество lncRNA TE видно в яйце. (доп мат Рис.3) Вероятно, это связано с их необходимостью для эмбрионального развития. 2.2. Проведена подготовка к проверке полученных in silico расчетов дифференциальной экспрессии ТЕ на разных стадиях жизненного цикла трематоды. Материал кДНК предоставлен коллегами Dr.J.Hodgkinson и Dr.N.Beesley c кафедры инфекционной биологии Ливерпульского университета. Для ТЕ с наиболее выраженной дифференциальной экспрессией подобрали праймеры для RealTime ПЦР и проверили их на геномной ДНК (доп.мат, рис.4.). Для метацеркарии характерна взрывная транскрипция ТЕ 297unknown и 355\Zenon\CR1 Таким образом, еще на одном объекте показано, что транскрипция ТЕ (lncRNA) дифференциально маркирует определенные стадии жизненного цикла трематоды. Экспериментальная проверка регуляторной роли lncRNA ТЕ является задачей будущего 7. Компоненты теломерного комплекса в сперматогенезе лягушки. 7.1. Взаимодействие теломер с мембраной (ламинами). udTRF2-регион белка TRF2 (Telomere Repeat Factor 2) разделяет димеризационный и ДНК-связывающий домены. Фрагмент udTRF2 клонирован в экспрессионном векторе и получены антитела (АТ) против рекомбинантного белка. Проведена ко-иммунопреципитация рекомбинантного udTRF2 с ядерным экстрактом. Масс-спектрометрические исследования преципитата показали: (1) Все пептиды TRF2 из опытной пробы принадлежат только области udTRF2; (2) Среди белков, связанных с udTRF2, определены ламины А и С. Взаимодействие udTRF2 с ламинами A и C подтверждено вестерн-блоттингом. (3) Среди интерактантов udTRF2 также идентифицированы гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины (hnRNP A2/B1, hnRNP A1, hnRNP A3, hnRNP K, hnRNP L, hnRNP M), факторы сплайсинга (SFPQ, NONO, SRSF1), АТФ-зависимые РНК-геликазы (DDX5, DHX9), топоизомераза I и белок теплового шока HSP71. Показано, прямое взаимодействие области udTRF2 белка TRF2 с ламинами; взаимодействие не зависит от ламин-ассоциированных белков. Получена первая протеомная характеристика белков, взаимодействующих с udTRF2-регионом. LncRNA TERRA является компонентом теломерного комплекса и, возможно, именно с ней связано присутствие РНК связывающих белков. Результаты опубликованы Travina et al., Int J Mol Sci. 2021, Q1 7.2. АТ против белка TRF2, тестированные на препаратах семенников лягушки Rana temporaria, далее использованы для локализации TRF2 в процессе сперматогенеза лягушки методом иммуно-gold , т.е. на электронно-микроскопических препаратах (доп мат Рис. 6). Неожиданным оказалось наличие TRF2 в составе “nuage”, загадочной структуры интермитохондриального цемента. Именно в нуаж обнаружили транскрипты тандемных повторов (HS2-3) в ооците человека (Dobrinin et al., 2020, отчет 20г; Enukashvily et al., 2021, текущий отчет). Необычное положение TRF2 не зависит от положения теломер и, вероятно, связано c ассоциацией TRF2 с белками, найденными и описанными выше (пункт 3.1). Работа будет продолжена (форма NNN план). 8. Описаны случаи горизонтального переноса генов от прокариот к эукариотам; найдены бактериальные доноры генетического материала; определены потенциальные переносчики генов - вирусы семейства Caudovirales. Впервые описаны белки и их возможные переносчики (Daugavet et al., 2019, 2020). Результаты высоко оценены премией Президиума РАН в 2021 г. Марии А.Даугавет. Закончено описание белка р48 туники асцидий. Белок оказался новым и отсутствовал в базах данных, помещен (NODE_28777, NODE_67444) и назван туфоксин. Статья направлена в печать в журнал Open Biology.. 9. Тандемные повторы (ТП) свиней и хомяков. ТП, не аннотированные и не картированные, есть в сырых данных секвенирования, собранных до контигов. Методами биоинформатики определили набор ТП в геномах свиньи и китайского хомяка. На сперматогенных клетках свиньи сигналы 4х ТП образуют кольца. Для того, чтобы доказать, что наблюдаем уникальную сборку центромерного района, использовали ТП хомяка с уникальной локализацией на 5й хромосоме. Проба позволила впервые увидеть укладку центромерного района и рассчитать размер петель (~50kb). Результаты опубликованы Ivanova et al., 2021 Cytogenet Genome Res.;161(1-2):93-102. Подготовлена к печати статья про расположение набора из 13 ТП в кариотипах близких видов хомяков – китайского и барабинского. 10. Транскрипты ТП в оогенезе мышей На преовуляторных ооцитах человека обнаружили безмембранные образования (гранулы) в цитоплазме ооцита, окрашиваемые антителами к DDX4 и транскрипты ТП (Dobrinin et al., 2020, отчет 20г; Enukashvily et al., 2021, текущий отчет). Транскрипты в гранулах принадлежат ТП прицентромерных участков хромосом (Human satellite, HS2-3). Инактивация транскрипции снижала число наблюдаемых гранул. Проведено определение распределения DDX4-содержащих гранул в ооцитах мыши. Распределение DDX4 до стадии первичного фолликула соответствовало ранее опубликованным данным. Однако, в окраске дальнейших стадий наблюдали отличия. Получены предварительные данные о положении TRF2, SC35 и ламин в MII ооцитах и зиготе мыши. В отличие от человека, где DDX4-биоконденсаьты, содержащие транскрипты ТП обнаруживаются вплоть до стадии овуляции, у мыши разборка гранул происходит раньше – на стадии вторичного фолликула. Возможно, это связано с различиями в процессах созревания ооцита у человека и мыши. На следующих этапах работы мы проверим, насколько транскрипты ТП вовлечены в формирование структур на разных этапах созревания ооцитов мыши.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Результаты работы изложены в соответствии с объектами. 1. Анализ генома и транскриптомов морского ежа S. Intermedius. В 2022 г получена тепловая карта (heat map) дифференциальной экспрессии ТЕ в транскриптомах на основе собственных данных секвенирования (доп мат рис.1). Видна дифференциальная экспрессия ТЕ. Транскриптомы американского морского ежа сделаны менее подробно; в них не захвачены ранние стадии дробления. Тандемные повторы (ТП) нашли в сырых ридах генома. Транскрипция мажорных ТП определили в транскриптомах (доп мат рис.2). Сильные изменения транскрипции видны. ДНК зонды рассчитаны (доп. мат, Таблица 1); для экспериментальной проверки зародыши зафиксированы так, чтобы сохранить РНК. Статья по результатам находится в стадии оформления. Учитывая сезонность объекта и трудности информатиков, для завершения статьи может понадобиться еще год. 2. Транскрипты ТЕ (lncRNA) в жизненном цикле трематод. В файле доп мат приведены тепловые карты 4х классов ТЕ F.hepatica, три из которых удалось идентифицировать (доп мат Рис.3, A-D). Среди ДНК-ТЕ семейство CMC-EnSpm является одним из наиболее диф экспрессируемых. Большинство ретро-ТЕ CR1 и некоторые ретро-ТЕ RTE-BovB даунрегулируются в метацеркариях и молодых ювенильных особях (доп мат). Zenon 216#, 200#, 1722# и Penelope 395# повышены. Транскрипция ТЕ Unknown менее равномерна. Пытались аннотировать 20 неизвестных ТЕ и нашли совпадения для 7 элементов (доп мат таблица 2). Коллеги прислали кДНК полученную на матрице РНК четырех стадий и вылупившихся ювенилей. На этой кДНК мы провели real-time PCR. Для метацеркарии характерна взрывная транскрипция ТЕ 297unknown и 355\Zenon\CR1 (доп мат Рис. 4). Выделяются в сторону увеличения транскрипции на стадии метацеркарии 297unkn TE, 355aZenon класса LINE и более умеренно 823Gypsy класса LTR. Последний сильно экспрессируется на стадии взрослого червя. На модельном объекте, H.elongata, получены экспериментальные картины экспрессии. Выбор стадий объясняется интересом к партеногенетическим, когда наблюдали клональную изменчивость. Есть выдающаяся экспрессия ТЕ тех же классов, но отличающихся по последовательности. Обращает на себя внимания транскрипция пары проб, описанных в статье Solovyeva et. al., 2021. Обе являются частями LINE, но в геноме они расположены в разных частях: RTE тяготеет к зухроматину, тогда как CR1 – к гетерохроматину. Преимущественная транскрипция RTE и CR1 происходит на разных стадиях: CR1 – церкария, RTE – метацеркария. ТЕ LINE до такой степени адаптированы в геноме, что их разные куски выполняют регуляторные функции на разных стадиях. Основной задачей является оформление и публикация материалов. Материал по H.elongata мы можем оформить самостоятельно, но материал по F.hepatica принадлежит нашим английским коллегам. После начала войны (24.02.2022) они уведомили нас об отказе от дальнейшего сотрудничества и запретили использовать присланный материал в публикациях. Мы не знаем как поступать в таких случаях. 3. Лягушка Rana temporaria 3.1. Компоненты теломерного комплекса в сперматогенезе лягушки. Антитела проверенные с помощью иммуноблотинга, использовали для определения локализации TRF2 при сперматогенезе лягушки с помощью иммунноэлектронной микроскопии. Локализация TRF2 ожидалась на концах хромосом, что и наблюдали при митозе. Неожиданным оказалось наличие TRF2 в составе в составе структур “nuage”.. Именно в нуаж обнаружили транскрипты ТП (HS2-3) в ооците человека (п. 6). В сперматозоидах лягушки TRF2 локализован в акросоме. TRF2 в акросоме, возможно, принципиально важен для выравнивания геномов в зиготе. Его наличие показано для млекопитающих (мышь) и амфибий (лягушка) и, вероятно, является универсальным свойством сперматозоидов. Статья по результатам опубликована (Травина и др, 2022) 3.2. Транспозоны и тандемные повторы лягушки R. temporaria Выполнен в соответствии с пунктом 6 плана 2021 г. Собранный геном получен недавно (NCBI GCF_905171775.1) с невысоким качеством сборки. ТЕ и ТП предсказаны с помощью программы Tandem Repeat Finder (Benson 1999) и RepeatModeler2. Нашлось 4131 семейств ТЕ и ТП, из которых 3303 являются неизвестными (рис.5 файл доп мат). ~1000 ТЕ удалось идентифицировать и построить картину распределения ТЕ в геноме и транскриптоме в зависимости от количества замен от консенсуса (рис.5 файл доп мат). Картины распределения различаются: двугорбая картина в транскриптоме в отличие от близкой к нормальному распределению в геноме. В первом пике транскрптома - мало измененные ТЕ. Во втором пике находятся ТЕ, которые доместифицированы в геноме и могут выполнять только регуляторные функции. Они очевидно не могут перемещаться. Найдено 6 ТП с полями от 5 Mb до 114 Mb. Последовательности ТП и олигов к ним представлены в таблице 3 (файл доп мат). ТП Rtem494A совпадает с уже описанным S1a, пять других являются новыми и отсутствуют в базах данных. Выявленные и тестированные мажорные ТП (Рис.6, файл доп мат) служат пробами для определения их транскрипции. Предварительный вывод - в оогенезе транскрибируются максимально видо-специфичные ТП, но не родо-специфичные. 4. Бактериофаги как векторы горизонтального переноса Опубликована статья Daugavet et al., 2022. Статья посвящена описанию новой фенолоксидазы асцидий, туфоксина (Tuphoxin - Tunicate Phenol Oxidase) и филогенетическому положению гомологов. Провели анализ белков, содержащие в аминокислотной последовательности регулярно расположенные цистеины, паттерн C*{4,9}C*{4,9}C*{4,9}C*{4,9}CC. Для 3010 белков найдены последовательности их генов с интронами. Гены принадлежат 122 организмам. Собрана база данных сайтов рекомбинации бактериофагов (Attp) из 186 последовательностей размером от 10 до 491 нуклеотидов. Выполняли поиск Attp в базе генов белков с цистеиновым паттерном. В 1294 последовательностях из 3010 (43%) обнаружено 2700 потенциальных сайтов рекомбинации. Длина сайтов 10 -16 нп. Т.о. потенциальные сайты рекомбинации чаще встречается в генах белков, содержащих цистеиновый паттерн. Статистическая значимость ассоциации сайтов рекомбинации в и цистеинового паттерна подтверждается точным тестом Фишера. 5. Тандемные повторы (ТП) свиней и хомяков Результаты отражены в статье Ivanova et al., 2022. Возможна публикация по результатам компьютерного анализа ТП свиньи, сделанного ранее, но недостаточно опубликованного. Работа с ТП получила новый толчок в связи с публикацией теоретической статьи Podgornaya OI. 2022). Планы по развитию тематики, связанной с ТП, изложены в заявке на продолжение гранта № 19-74-20102 6. Транскрипты ТП в оогенезе мыши и человека На срезах яичников мышей (3 мес) показано, что гранулы, маркируемые DDX4 присутствуют в ооцитах мыши до стадии первичного фолликула (Рис 7 доп мат). В яичниках человека гранулы есть до поздних преовуляторных стадий (Рис. 8 доп мат). Гранулы содержат хеликазу DDX5 и транскрипты ТП HS2\3 (Рис 9 доп мат). Материалы части работы опубликованы в статье Добрынин и др., 2022. Исследования выполнены на фиксированном материале. В качестве задела создана плазмида на основе вектора pTurboGFP-C (Евроген), у которой вместо гена GFP под промотор CMV вставили кДНК транскрипта HS2/HS3, обнаруженного ранее в транскриптоме ооцитов (Dobrynin et al., 2020). Конструкция нужна для экспериментов по нокдауну и влияния оверэкспрессии последовательности в клетках (см. Продолжение).