Аннотация результатов, полученных в 2019 году
За отчетный период мы планировали с помощью технологий высокопроизводительного секвенирования определить изменения в количестве и трансляции всех клеточных мРНК при полном подавлении синтеза в клетке одного или нескольких Y-бокс-связывающих белков и экспрессии одного из белков с плазмиды. Решение этой сложной и масштабной задачи позволит установить также, какова роль Y-бокс-связывающих белков в регуляции экспрессии генов в клетке, какие клеточные процессы регулируют эти белки, а также выяснить до какой степени один Y-бокс-связывающий белок способен компенсировать отсутствие другого. Y-бокс-связывающие белки 1 и 3 имеют сходное строение, участвуют в схожих ДНК- и РНК-зависимых процессах и даже имеют одинаковые посттрансляционные модификации. Опираясь на данные, описанные в литературе, и наши предварительные данные и соображения можно предполагать, что вероятность функциональной взаимозаменяемости белков YB-1 и YB-3 весьма высока. Проверка этой новой и ранее не выдвигавшейся в мировой литературе гипотезы необходима и может быть важна не только с фундаментальной точки зрения, но и с практической. На данный момент мы можем утверждать, что, при отсутствии белка YB-1 в клетке его РНК-связывающую функцию берет на себя YB-3. Более того, когда YB-3 оверэкпрессирован в клетках, он ингибирует общий белковый синтез в той же степени, что и оверэкспрессия YB-1. Удаление из клеток HEK293T обоих Y-бокс-связывающих белков методом геномного редактирования CRISPR/Cas9 приводит уменьшению количества полисом в клетках, что говорит о серьезном снижении уровня трансляции. Важно, что экспрессия любого из Y-бокс-связывающих белков (либо YB-1, либо YB-3) практически восстанавливает полисомный профиль клеток. В меньшей степени восстановление выражено при экспрессии YB-3. Это, вероятно, обусловлено повышенным синтезом YB-3 в клетках, в которых отсутствует YB-1, вследствие не контролируемой белком YB-1 экспрессии гена YB-3. Это позволяет предположить, что выключение синтеза двух исследуемых Y-бокс-связывающих белков существенно меняет экспрессию генов клетки, но одного из них уже достаточно (YB-1) или почти достаточно (YB-3) для восстановления тотального белкового синтеза. О том, как изменяется экспрессия разных генов, можно будет судить после анализа полученных за отчетный период библиотек рибосомного профайлинга из клеток с двойным нокаутом и из клеток в которых экспрессируется только один из Y-бокс-связывающих белков.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В отчетный период были проанализированы данные RiboSeq и RNASeq о транслируемости и количестве всех мРНК в клеточных линиях с различным уровнем экспрессии Y-бокс-связывающих белков. Анализ самих библиотек показал их хорошее качество, однако потребовалось провести достаточно большую биоинформатическую работу по нормализации данных и коррекции числа чтений для адекватной оценки дифференциальной экспрессии генов. Нами была проанализирована дифференциальная экспрессия генов в клетках, экспрессирующих либо YB-1, либо YB-3, а также экспрессирующих оба белка по сравнению с клетками с двойным нокаутом Y-бокс-связывающих белков. Для всех клеточных линий, экспрессирующих один из или оба Y-бокс-связывающих белка, характерны небольшие по амплитуде (Fold Change) изменения относительно клеток, не экспрессирующих YB-белки, как в RNA-Seq, так и в эффективности трансляции. При этом количество значимо изменившихся генов значительно выше для изменения в РНК (около 4000 по РНК против 500 по эффективности трансляции). В первую очередь нас интересовало, могут ли YB-1 и YB-3 функционально заменять друг друга. Для ответа на этот вопрос мы проанализировали согласованность изменения эффективности трансляции или количества РНК в клетках, экспрессирующих YB-1, YB-3 или оба белка. Изменения в эффективности трансляции при экспрессии Y-бокс-связывающих белков хорошо согласуются между всеми тремя клеточными линиями (+YB-1, +YB-3, HEK293T∆∆+YB-1+YB-3), что может говорить о том, что белки YB-1 и YB-3 могут функционально заменять друг друга в регуляции трансляции довольно большого набора генов (более 500). Среди мРНК, чья трансляция активируется при экспрессии Y-бокс-связывающих белков можно выделить мРНК белков, участвующих в сплайсинге, транспорте РНК и делении клеток (в том числе в анафазе и цитокинезе). Стоит отметить, что данное наблюдение хорошо согласуется с обнаруженными ранее явлениями: (1) появление многоядерных клеток при понижении количества YB-1 в клетке; (2) анеуплоидией (нарушением расхождения хромосом) в раковых клетках с повышенным содержанием YB-1. Данные явления объяснялись прямым вовлечением YB-1 в формирование веретена деления. Наши результаты говорят о том, что Y-бокс-связывающие белки могут участвовать в цитокинезе и сегрегации хромосом также и опосредованно, трансляционно-регулируя ключевых участников. Среди мРНК, чья трансляция снижается при экспрессии Y-бокс-связывающих белков, мРНК белков, участвующих в трансляции (в том числе рибосомных белков и белков биогенеза рибосом) и клеточном дыхании. В отличии от изменений в эффективности трансляции, изменения в РНК значительно различаются между клетками. Все гены с изменившимся количеством транскрибируемой РНК, можно разделить на 5 кластеров: (1) количество РНК наиболее сильно возросло в клетках с экспрессией обоих белков; (2) количество РНК возросло во всех клеточных линиях; (3) количество РНК наиболее сильно возросло в клетках с экспрессией YB-3; (4) количество РНК упало в клетках с экспрессией YB-1 или обоих белков; (5) количество РНК упало во всех клеточных линиях. мРНК первого кластера обогащены мРНК, чьи продукты участвуют в клеточном цикле (в том числе в проверке check point), клеточном дыхании, репарации и репликации ДНК. Во втором кластере много мРНК, чьи продукты участвуют в метаболизме липидов, нуклеотидов, биосинтезе аминокислот, ответах на разные стрессы. В третьем кластере - трансляция, биогенез рибосом, организация митохондрий, клеточное дыхание и клеточный цикл. В четвертом - трансляция, биогенез рибосом, сплайсинг, цитокинез. В пятом - клеточный цикл, транскрипция, локализация и процессинга мРНК. Видно, что некоторые процессы, обогащены в нескольких различных кластерах, например, регуляция клеточного цикла. Это говорит о том, что различные гены, участвующие в этом процессе по-разному изменяют свою экспрессию при экспрессии разных Y-бокс-связывающих белков в клетке. Однако на данный момент сложно сказать, это действительно реализуются разные клеточные программы при экспрессии разных Y-бокс-связывающих белков в клетке или же при получении стабильных линий были отобраны клетки с изменившейся экспрессией. Отдельно стоит упомянуть, что изменения в количестве РНК при экспрессии YB-1 или YB-3 слабо положительно коррелируют и лишь около 20% значимо изменившихся генов общие для обоих клеточных линий. Возможно, для этого набора РНК YB-1 и YB-3 могут функционально заменять друг друга. В отчетный период мы начали исследование влияние уровня экспрессии одного или двух Y-бокс-связывающих белков на стабильность клеточных мРНК. Предварительно была отработана методика иммунопреципитации BrU-меченной мРНК антителами против BrU, лежащая в основе метода BRIC-Seq (5'-bromo-uridine (BrU) immunoprecipitation chase-deep sequencing analysis). Убедившись в эффективности этой методики мы проанализировали изменения в деградации мРНК в клетках, экспрессирующих оба Y-бокс-связывающих белка (HEK293T∆∆+YB-1+YB-3) по сравнению с клетками, не экспрессирующими Y-бокс-связывающие белки (HEK293T∆∆). К мРНК, которые стабилизируются Y-бокс-связывающими белками, относятся РНК рибосомных белков , белков, участвующих в клеточном дыхании и автофагии. К РНК, деградацию которых Y-бокс-связывающие белки ускоряют, относятся РНК, чьи продукты участвуют в процессинге и локализации мРНК, клеточном делении, организации актинового и тубулинового цитоскелета. Таким образом, удалось выяснить, что Y-бокс-связывающие белки участвуют как в стабилизации, так и дестабилизации определенных наборов мРНК в клетке. Кроме того, за отчетный период для получения клеточных линий на основе клеток HEK293T YB-1-/-, экспрессирующих либо YB-1 с преимущественно ядерной локализацией YB-1, либо с фосфомиметической заменой S102D, или экспрессирующих нефосфорилируемую форму YB-1 S102A, были получены соответствующие плазмидные конструкции pcDNA3.1-Puro-YB-1(nuc), pcDNA3.1-Puro-YB-1(S102D) и pcDNA3.1-Puro-YB-1(S102A).

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За отчетный период были проанализированы данные BRIC-Seq о стабильности всех мРНК в клеточных линиях с различным уровнем экспрессии Y-бокс-связывающих белков. Базовая обработка чтений показала, что в некоторых образцах доля полезных (уникально картируемых) прочтений была невелика, что потребовало дополнительного секвенирования этих образцов. Стартовый анализ методом главных компонент показал, что необходимо проводить коррекцию данных (батч-коррекцию) для устранения систематической ошибки, вероятно, связанной с различной эффективностью удаления рибосомной РНК в образцах с помощью коммерческих наборов. После коррекции данных была проведена их нормализация. После длительной биоинформатической работы было решено использовать для нормализации ген HSPA8, поскольку он удовлетворял большинству критериев, а в первую очередь, при соответствующей нормализации на уровень его экспрессии основная часть РНК должна достоверно снижала свое количество с течением времени (деградировать), а количество «растущих» генов было минимально и соответствовало технической дисперсии. Кроме того, ген HSPA8 имеет постоянную и высокую экспрессию в используемых нами клеточных линиях. При нормализации на него усредненное по генам время полужизни РНК составило около 7 часов в клетках с двойным нокаутом (HEK293T ΔΔ) и около 12-14 часов в клетках HEK293T ΔΔ, экспрессирующих YB-1 и/или YB-3. Важно, что усредненное время полужизни в клетках без YB-белков ниже, что свидетельствует об участии YB-белков в глобальной стабилизации РНК в клетке, и согласуется с известными данными об участии YB-1 и YB-3 в упаковке РНК. Анализ дифференциальной стабильности мРНК в клетках, экспрессирующих либо YB-1, либо YB-3, а также экспрессирующих оба белка по сравнению с клетками с двойным нокаутом Y-бокс-связывающих белков, с последующим анализом функциональных групп в ранжированном по оцененной стабильности списке генов с помощью подхода gene set enrichment analysis (GSEA) показал, что в клетках HEK293T ΔΔ, экспрессирующих YB-1 и/или YB-3, по сравнению с клетками HEK293T ΔΔ стабилизируются мРНК рибосомных белков и белков, участвующих в инициации трансляции. При этом наибольшая стабилизация наблюдается в клетках, где экспрессированы оба YB-белка, а наименьшая, в клетках, экспрессирующих только YB-3. Можно предположить, что в стабилизации этой группы мРНК YB-3 лишь частично может заменять YB-1. Другие функциональные группы РНК, которые существенно стабилизируются YB-белками – это мРНК белков, участвующих в организации актинового и тубулинового цитоскелета, формировании клеточных контактов и веретена деления. При этом для этих групп мРНК характерна большая стабилизация при экспрессии только одного из YB-белков (только YB-1 или YB-3). При экспрессии обоих белков, мРНК этих функциональных групп стабилизируются слабее. мРНК белков, участвующих в окислительном фосфорилировании стабилизируются только при экспрессии обоих YB-белков. Вероятно, в этом случае они могут работать в комплексе. Среди мРНК, чья стабильность снижается при экспрессии YB-1 белков удалось обнаружить единственную функциональную группу. В клетках, экспрессирующих YB-1 или YB-3, но не оба белка, значимо снижается стабильность мРНК белков, входящих в состав «крышки» протеасомы, т.е. отвечающих за регуляцию доступности коровой части протеасомы. Интересно, что при экспрессии обоих белков стабильность этой группы РНК остается практически неизменной. Еще одним направлением работы по проекту в этом году было получение клеток, экспрессирующих вместо белка YB-1 его мутантные формы имеющие преимущественно ядерную локализацию, и анализ транскриптома и транслатома в этих клетках. Ранее нами были получены три генетические конструкции для синтеза в эукариотических клетках белка YB-1nuc (4 мутации в петле между 3 и 4 бета-тяжами домена холодового шока, I91A, K92A, N94A, Y99A), YB-1S102D и YB-1S102A. В отчетный период были предприняты несколько попыток получения клеточных линий на основе клеток HEK293T YB-1-/- (не экспрессируют YB-1) стабильных линий, в которых синтезируются указанные белки, однако это не удалось. Мутантные белки обнаруживались далеко не во всех клетках, а кроме того YB-1S102D детектировался не в ядре, как ожидалось, а в цитоплазме. Возможной причиной данной ситуации является тот факт, что ядерная локализация YB-1 приводит к несовместимым с нормальным клеточным ростом и делением последствиям и выживают в основном клетки, каким-либо образом избавившиеся от его синтеза или переводящие мутантный YB-1 в цитоплазму. В последнем случае, не исключено, имеет место активация фосфорилирования мутантного белка YB-1S102D по остатку S209. Как было нами показано, такая модификация способствует сохранению YB-1 в цитоплазме даже в случае фосфорилирования YB-1 по остатку S102. Приняв во внимание полученные результаты, было решено выполнить эксперименты RNA-Seq и Ribo-Seq на клетках HEK293T YB-1-/-, в которых синтез мутантных форм и белка дикого типа (контроль) обеспечивался временной трансфекцией клеток плазмидами, кодирующими мутантные формы YB-1. После базовой обработки данных секвенирования и предварительного анализа данных можно сделать следующие выводы. С одной стороны, при оверэкспрессии любого варианта YB-1 изменяется количество схожего набора РНК (отличает клетки с и без YB-1). С другой стороны, кластеризация образцов с экспрессией ядерных вариантов говорит о том, что ядерные варианты YB-1 регулируют схожие наборы РНК. Стоит отметить, что клетки, экспрессирующие YB-1 (4mut), наиболее сильно отличаются от клеток, экспрессирующих белок дикого типа. Анализ дифференциальной экспрессии генов позволил обнаружить, что количество мРНК, чьи продукты вовлечены в формирование сплайсосомы, убиквитин-лигазного комплекса, гистон-метилтрансферазного комплекса и ядерной мембраны, увеличивается при экспрессии любого из мутантных вариантов YB-1. Можно предположить, что в этом случает YB-1 может вовлекаться в регуляцию транскрипции мРНК данных групп и именно экспрессию этих групп регулирует YB-1, когда находится в ядре. Кроме того, количество мРНК рибосомных белков сильно упало только в клетках, экспрессирующих белок YB-1 дикого типа. При экспрессии белков YB-1 S102A и S102D снижение количества мРНК рибосомных белков незначительно, а при экспрессии YB-1 4mut изменения в количестве мРНК рибосомных белков вообще не наблюдается. Еще одна функциональная группа, количество мРНК в которой снижается специфично при экспрессии только YB-1 дикого типа в клетках HEK293TΔYB-1, - это мРНК, чьи продукты участвуют в окислительном фосфорилировании. Таким образом, для регуляции количества указанных мРНК важно наличие YB-1 в цитоплазме либо его отсутствие в ядре. Еще одна задача проекта в этом году состояла в выявлении наборов мРНК, связывающихся с YB-1 и YB-3 в клетках HEK293T∆∆+YB-1+YB-3. Было необходимо сопоставить эти данные с полученными ранее данными Ribo-Seq и RNA-Seq для клеток HEK293T, не экспрессирующих YB-белки или экспрессирующих оба белка (YB-1 и YB-3). Итоговое количество чтений полученных библиотек RIP-Seq составило около 0.5 млн чтений, что можно было использовать лишь для проведения предварительного анализа. Стоит отметить, что образцы наборы мРНК из иммунопреципитатов за антитела против YB-1 и YB-3 хорошо коррелируют, что свидетельствует о том, что YB-1 и YB-3 связывают эти РНК с похожей эффективностью. Выяснилось также, что эффективность связывания YB-1 и YB-3 с мРНК не имеет глобальной корреляции с изменениями в стабильности РНК, количестве РНК и изменениями в уровне трансляции при экспрессии белков YB-1 и YB-3 по сравнению с клетками HEK293TΔYB-1ΔYB-3 (HEK293T ΔΔ). Однако, если проанализировать как взаимодействуют YB-1 и YB-3 с мРНК, чья трансляция упала или возросла в клетках HEK293T ΔΔ+YB-1+YB-3 по сравнению с клетками HEK293TΔΔ, то оказывается, что в группе мРНК, чья трансляция возросла, есть существенная доля мРНК, взаимодействующих с YB-1 и YB-3 сильнее, чем в среднем по транскриптому. В этой группе обнаружены мРНК, продукты трансляции которых задействованы в метаболизме РНК (транспорт + сплайсинг :PNN, EIF5B, SRRM1, UPF2, THOC2, PPIG, MPHOSPH10, LUC7L3, RBBP6, CCAR1) и в клеточном делении (HSP90AA1, SMC3, AKAP9, CEP290, ATRX, RB1CC1, CCDC88A). Это те же группы мРНК, что были обнаружены нами ранее при анализе наборов мРНК, чья трансляции изменяется при экспрессии YB-белков в клетках HEK293TΔΔ. Вероятно, YB-1 и YB-3 непосредственно участвуют в регуляции трансляции именно этой группы мРНК.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В отчетный период проекта была завершена обработка данных высокопроизводительного секвенирования библиотек BRIC-Seq для определения эффекта YB-белков на стабильность клеточных мРНК. Для этого был проведен дополнительный эксперимент по определению стабильности мРНК альтернативным методом с обработкой клеток ингибитором транскрипции (флавопиридол) с последующим исследованием транскриптома клеток. Сопоставление результатов двух экспериментов (BRIC-Seq и RNA-Seq с флавопиридолом), а также использование специально разработанного нами метода нормализации данных позволило сделать следующие выводы. YB-белки оказывают общее стабилизирующее действие на клеточные мРНК, поскольку в их отсутствие распад мРНК заметно усиливается. При этом наибольшая стабилизация, по нашим оценкам, наблюдается в клетках, где экспрессированы оба YB-белка, а наименьшая, в клетках, экспрессирующих только YB-3. Однако помимо общего эффекта нокаута на стабильность РНК нами также были определены транскрипты, особенно чувствительные к наличию в клетке белков YB-1 и YB-3. К мРНК, которые стабилизируются Y-бокс-связывающими белками сильнее, чем остальные клеточные мРНК, относятся мРНК белков, участвующих в биогенезе рибосом, и мРНК белков, участвующих в клеточном дыхании. Интересно, что трансляция схожих наборов мРНК также специфически контролируется YB-белками, что было определено нами ранее. Поэтому именно эти группы РНК наиболее интересны с точки зрения дальнейшего изучения детального механизма специфического влияния YB-белков на экспрессию генов. Кроме того, в этом году был проведен анализ данных по влиянию трёх мутантных форм YB-1, имеющих ядерную локализацию, на экспрессию генов. Анализ транскриптома и транслатома в этих клетках показал, что ядерные варианты YB-1 регулируют схожие наборы РНК, а их эффект заметно отличается от эффекта белка YB-1 дикого типа. Анализ дифференциальной экспрессии показал, что количество мРНК белков, участвующих в биогенезе рибосом, сильно упало только в клетках, экспрессирующих белок YB-1 дикого типа. При экспрессии мутантных форм YB-1 снижение количества мРНК рибосомных белков незначительно. Еще одна функциональная группа, количество мРНК в которой снижается специфично при экспрессии только YB-1 дикого типа - это мРНК, чьи продукты участвуют в окислительном фосфорилировании. Таким образом, для регуляции количества указанных мРНК важно наличие YB-1 в цитоплазме, либо его отсутствие в ядре. Кроме того, данный результат еще раз подчеркивает важную роль YB-1 в регуляции количества, трансляции и стабильности упомянутых групп мРНК. Наконец, еще одна задача, которая решалась в рамках проекта в 2022 году, состояла в выявлении наборов мРНК, связывающихся с YB-1 и YB-3, что необходимо для сопоставления данных об эффективности связывания этих белков с их влиянием на экспрессию генов. Однако выявились проблемы затрудняющие интерпретацию результатов. Во-первых, это наличие фракции неспецифической сорбции в иммунопреципитате, от вклада которой можно избавиться только нормировкой на контрольную иммунопреципитацию (иммунопреципитация с контрольными преимунными антителами). Во-вторых, и самое главное, это факт отсутствия глобальной корреляции силы связывания с мРНК белков YB-1 и YB-3 с изменениями в стабильности РНК, количестве РНК и изменениями в уровне трансляции при экспрессии белков YB-1 и YB-3 по сравнению с клетками HEK293TΔYB-1ΔYB-3 (HEK293T ΔΔ), что противоречит имеющимся в литературе данным и данным, полученным в ходе данного проекта. Это может говорит о том, что репертуар мРНК, определенный методом RIP-Seq является не вполне правильным. Возможно, это связано с тем, что этим методом выделяются мРНК, взаимодействующие не только непосредственно с YB-белками, но и мРНК взаимодействующие с YB-белками опосредованно, через другие РНК-связывающие белки. Определить с какой частью мРНК взаимодействует белок методом RIP-Seq невозможно. Ситуация с иммунопреципитацией комплексов YB-1-РНК осложняется еще и тем, что YB-1 может взаимодействовать с рибосомными субчастицами, и через них взаимодействовать со случайными мРНК. Решением данной проблемы может служить определение мест взаимодействия YB-белков с мРНК и эффективности связывания YB-белков с мРНК методом eCLIP, что необходимо сделать в рамках проекта-продолжения.