Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На базе ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России были получены и очищены вирусоподобные частицы HBc и 4M2E-Hbc в количествах 10 мг и 100 мг белковых частиц соответственно то есть в достаточных для проведения криоэлектронной микроскопии количествах. Отработана методика хранения, транспортировки и измерений на криоэлектронном микроскопе. Получены экспериментальные данные крио-электронной микроскопии частиц HBc, демонстрирующие высокое качество очистки образца и его гомогенность. Предварительные данные трехмерной реконструкции подтверждают наличие икосаэдрической симметрии, а также находятся в согласии с ранее опубликованной структурой коровых частиц по данным крио-ЭМ. Разработан оригинальный протокол выделения белка из биомассы продуцента E.coli, при использовании которого в процессе выделения образовывались нонамеры белка NP вируса гриппа, содержащие фрагменты бактериальной РНК. На базе ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России было получено более 200 мг белковых частиц рекомбинантного белка NP вируса гриппа А/H1N, что достаточно для проведения экспериментов методом криоэлектронной микроскопии. Получен предварительный набор изображений. Построена полноатомная молекулярно-динамическая модель нонамеров нуклеопротеина вируса гриппа. Получены полноатомные модели девятимерных колец и 24-мерных филаментов РНК-несущего комплекса белка NP из вируса гриппа А. С использованием молекулярно-динамического моделирования в явном растворителе получены траектории для нонамеров нормального белка NP и белка из холодоадаптированного штамма, несущего аминокислотную замену E292G. Результаты анализа показали, что, несмотря на практически полное сходство интерфейсов между мономерами в 9-мере и в функциональном 24-мере белка и наличие аллостерического влияния изучаемой мутации на подвижность комплекса, мутация в компонентах нонамера не влияет на структуру функционально значимых сайтов NP. Результаты анализа влияния мутации E292G на структуру и функциональные домены 24-мера белка представлены в виде препринта статьи по материалам гранта (Yana Zabrodskaya, Alexey Shvetsov, Dmitry Lebedev, Aram Shaldzhyan, et al. Cold and distant: structural features of the nucleoprotein complex of a cold-adapted influenza A virus strain, https://doi.org/10.1101/847608). Выделены и охарактеризованы методами динамического светорассеяния, анализа траекторий наночастиц и проточной цитометрии внеклеточные везикулы из плазмы крови человека, спинномозговой жидкости (СМЖ), асцитической жидкости и культуральной среды. Показано, что основная фракция детектируемых частиц представляет собой везикулы с диаметром 40-150 нм, что соответствует размеру экзосом. Количество везикул в равном объеме исходной биологической жидкости человека значительно уменьшается в ряду: асцитическая жидкость > плазма крови > ликвор > культуральная среда. Методом криоэлектронной микроскопии получена визуализация и морфологическая характеристика внеклеточных везикул из различных источников. Впервые были получены разнообразные изображения экзосом, выделенных из СМЖ человека. Среди полученных изображений преобладали одиночные везикулы круглой формы, но также наблюдали и наличие вариантов везикул, окруженных бислойной мембраной, включая «двойные» (одна в другой), «тройные» и многослойные частицы; везикулы не круглой формы (гантелеобразные, овальные и т.д.); частицы с различной электронной плотностью внутри мембраны. В результате оптимизации процедур экспрессии и очистки клонированной ранее высокостабильной β-галактозидазы (DaβGal) из гипертермофильной археи Desulfurococcus amyloliticus нам уже в этом году удалось получить практически гомогенный препарат фермента дикого типа без концевых меток в количествах достаточных для сбора ограниченного количества крио-ЭМ данных на приборной базе Курчатовского комплекса НБИКС-технологий (крио-ПЭМ Titan Krios 60-300) и первоначального анализа трансгликозилирующей активности фермента. Мы установили, что при использовании нитрофенол-галактозидов в качестве донора, хорошими альтернативными акцепторами являются глицерин, этиленгликоль и низшие спирты (метанол, этанол, изопропанол, н-бутанол). Менее эффективно фермент производит перенос галактозы на более крупные акцепторы: сорбит, дульцит, фруктозу, ксилозу и лактозу. Полученные данные о каталитической активности β-галактозидазы в реакции трансгликозилирования в совокупности с проведёнными нами ранее исследованиями гидролитических свойств фермента позволили составить кинетическую схему работы фермента. Мы получили грубую структуру DaβGal с разрешением 7 Å, используя в качестве предварительных данных 116 тысяч крио-ЭМ изображений индивидуальных частиц фермента. Симметрия полученной структуры свидетельствует о димерной форме активного фермента, по крайней мере при концентрациях выше 1 мг/мл. Молекулярная динамика сконструированного гипотетического димера β-галактозидазы Trichoderma reesei (TrβGal), имеющей схожесть аминокислотной последовательности с DaβGal на уровне 27%, демонстрирует стабильность такого комплекса при симуляции длительностью 100 нс. Основываясь на структуре TrβGal, построили атомарную модель каталитического домена DaβGal и установили его каталитические остатки. Изучено влияние термостабилизирующих аминокислотных замен, найденных с помощью направленной эволюции, на структуру ГА. Данные молекулярной динамики и алгоритма расчёта изменения свободной энергии CROOKS при внесении точечных аминокислотых замен показали, что стабилизация структуры достигается за счет образования новых водородных связей, увеличения жесткости петель и усиления гидрофобных взаимодействий. При этом удалось сделать предположение о причине нелинейных эффектов увеличения стабильности ГА при совмещении в мутантных формах стабилизирующих и дестабилизирующих замен, что в дальнейшем позволит создавать термостабильные формы ГА с множественными заменами. Результаты молекулярного моделирования включены в публикацию (A. Schmidt, A. Shvetsov, E. Soboleva, Yu. Kil, V. Sergeev, M. Surzhik, Thermostability improvement of Aspergillus awamori glucoamylase via directed evolution of its gene located on episomal expression vector in Pichia pastoris cells, Protein Engineering, Design, and Selection, http://dx.doi.org/10.1093/protein/gzz048 принята в печать). Получены монодисперсные устойчивые к агрегации образцы глюкоамилазы из Asp. awamori со степенью очистки, достаточной для исследований на крио-электронном микроскопе. Получены данные масс-спектрометрического анализа рекомбинантной глюкоамилазы, которые указывают на наличие N-гликозидов, содержащих от 9 до 15 манноз ((GlcNAc)2Man9 – (GlcNAc)2Man15), и О-гликозидов со степенью полимеризации маннозы от 1 до 4. В результате разделения альдитов О-гликозидов на тонкослойной хроматографии показано, что основное количество углеводов представлено димерами и тримерами маннозы, в то время как мономеры и тетрамеры присутствуют в меньшем количестве. На основе плученных в результате компьютерного моделирования данные по структуре комплексов RecA – ДНК (переходные состояния при обмене нитями) определен набор возможных структур и ожидаемые пространственные параметры олигомеров. Эксперименты in vitro показали необходимость изменения процедуры пробоподготовки для измерений подобных комплексов методом крио-ЭМ и использования в дальнейших экспериментах пептидных моделей или ортологов RecA.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В рамках выполнения проекта с использованием полученных данных криоэлектронной микроскопии коровых частиц вируса гепатита со вставками антигена M2E (HBc-M2E) осуществлена трехмерная реконструкция их структуры с разрешением 3.02 Å (в области кора). Определено положение основания подвижной иммунодоминантной петли, показано, что она находится снаружи коровой частицы. Выделены рибонуклеопротеиновые частицы вируса гриппа А, сформированные из белка нуклеопротеина, несущего и не несущего замену E292G и показано, что для восстановления структурных параметров рибонуклеопротеиновых частиц оптимальным является использование набора данных, полученных с использованием просвечивающей электронной микроскопии. Получены наборы изображений выделенных комплексов, сформированных из нуклеопротеина, несущего и не несущего замену E292G, нанесённые при температурах (26 и 39 градусов Цельсия), пригодные для дальнейшей обработки с целью восстановления пространственных параметров комплекса, изменение температурных зависимостей которых связано с возникновением холодоадаптированного фенотипа вируса гриппа А. Выполнили подбор условий подготовки образца для проведения криоЭМ эксперимента, снижающие агрегацию β-галактозидазы из Desulfurococcus amyloliticus. Оптимальные результаты были получены при концентрации фермента 5 мг/мл, добавлении 100 mM NaCl для экранирования зарядов а.к. остатков фермента. Перед нанесением на сетки осуществляли предварительный прогрев препарата при 65°С в течение 15 мин. С использование такого протокола провели автоматизированный набор криоЭМ экспериментальных данных, увеличив количество изображений индивидуальных частиц фермента до 1050287. Разрешение восстановленного по изображениям распределение электронной плотности оцененное по критерию FSC=0.143 составило 3.44Å, и позволило реконструировать фрагменты структуры димера бета-галактозидазы. Частично решенная на данный момент структура гипертермостабильной β-галактозидазы из Desulfurococcus amyloliticus даёт возможность проследить расположение в пространстве каталитического домена фермента, имеющего топологию альфа-бета бочонка и окружающих его доменов с топологией jelly roll. Методами ЯМР спектроскопии (1H и 13С-HSQC) исследовали специфичность действия β-галактозидазы, используя в качестве субстрата пара-нитрофенил-β-D-галактопиранозид. Анализ полученных ЯМР-спектров позволяет заключить, что исследуемая β-галактозидаза функционирует по механизму сохранения аномерной β-конфигурации атома С1 галактозида, и предположить, что синтезируемые в результате реакции трансгликозилирования продукты будут соединены ковалентно β-связью. При выполнении проекта разработан и апробирован новый способ выделения внеклеточных везикул из плазмы крови, с использованием реагента SubXTM. Метод основан на создании крупных конгломератов везикул за счет взаимодействия фосфатных групп мембранных фосфолипидов, возникающего в присутствии SubXТМ. В исследовании проведена сравнительная оценка препаратов везикул, выделенных с помощью SubXТМ реагента и другими методами, описанными ранее, по ряду параметров: размер, концентрация, морфология, наличие примесей невезикулярной природы, содержание в мембране экзосомальных тетраспанинов, содержание белка и тотальной РНК. Использованы методы: анализ траекторий наночастиц, лазерная корреляционная спектроскопия, атомно-силовая микроскопия, криоэлектронная микроскопия, проточная цитометрия. Для апробируемого нового метода выделения везикул в присутствии SubXТМ реагента с помощью крио-ЭМ визуализированы везикулы, ограниченные двухслойной биологической мембраной Размер визуализируемых частиц около 100 нм, что соответствует размеру везикул экзосомального происхождения. Таким образом, новый способ выделения экзосом, разработанный в рамках выполнения проекта может быть выбран как рутинный метод выделения экзосом из плазмы крови человека. Представленные результаты включены в публикацию T. Shtam, V. Evtushenko, R. Samsonov et al. Evaluation of immune and chemical precipitation methods for plasma exosome isolation. 2020. PLoS ONE 15(11): e0242732. https://journals.plos.org/plosone/article/authors?id=10.1371/journal.pone.0242732 С использованием криоэлектронной микроскопии нами были охарактеризованы пулы экстраклеточных везикул (экзосом), выделенных из спинномозговой жидкости (СМЖ) пациентов с болезнью Паркинсона и плазмы периферической крови пациентов с болезнью Гоше. В последнее время широко обсуждается общность патогенеза данных заболеваний. В представленном исследовании впервые показано разнообразие морфологии экстраклеточных везикул СМЖ, что предполагает разнообразие их функций (Emelyanov, A.; Shtam, T.; Kamyshinsky, et al., Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One 2020, 15, 1–11 https://journals.plos.org/plosone/article/comments?id=10.1371/journal.pone.0227949 ) Кроме того, именно с помощью крио-ЭМ нам впервые удалось визуализировать изменения, происходящие в пуле экзосом плазмы крови пациентов с наследственным нарушением в гене лизосомного фермента, глюкоцереброзидазы. Так, везикулы, выделенные из плазмы крови пациентов с болезнью Гоше характеризуются увеличенным средним размером и более разнообразной морфологией. Таким образом, полученные результаты крио-ЭМ подтверждают выдвинутое в начале исследования предположение об изменениях, происходящих в пуле экзосом плазмы крови пациентов с генетически детерминированной дисфункцией лизосом (Shtam T., Naryzhny S., Kulabukhova D., Garaeva L. et al., Altered level of plasma exosomes in patients with Gaucher disease. European Journal of Medical Genetics 63 (2020) 104038. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1769721220303062 ). В рамках выполнения проекта c помощью крио-ЭМ впервые была детально охарактеризована морфология экзосом, выделенных из цельной крови пациентов с раком молочной железы и здоровых доноров и включающих в себя экзосомы, ассоциированые с поверхностью форменных элементов крови. Среди полученных изображений преобладали одиночные везикулы круглой формы, но также наблюдали и наличие «экзотических» вариантов везикул, окруженных бислойной мембраной, включая «двойные» (одна в другой), «тройные» и т.д. частицы; частицы с различной электронной плотностью внутри мембраны. Результаты работы включены в публикацию M. Konoshenko, G. Sagaradze, E. Orlova, T. Shtam et al., Total Blood Exosomes in Breast Cancer: Potential Role in Crucial Steps of Tumorigenesis. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7341. https://www.mdpi.com/1422-0067/21/19/7341

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. Главным достижением третьего этапа работы по изучению гиперстабильной архейной β-галактозидазы стало решение атомной структуры димера фермента комбинированными методами и подходами криоЭМ и молекулярного моделирования. Мы описываем новый фермент, обладающий лишь определённой гомологией с известными бета-галактозидазами в области каталитического домена, имеющего укладку альфа-бета бочонок, информация о нём в базах данных структур биологических молекул отсутствует. Поэтому потребовалось дополнительно провести набор крио-ЭМ данных и большой объём работы в ручном режиме для решения структуры de novo в программных пакетах Coot и Phenix, основываясь на накопленном на предыдущих этапах опыте работы с данным объектом. Часть отсутствующей в модели структурной информации была восстановлена с помощью методов молекулярного моделирования, в частности, достроили подвижную петлю, задаваемую последовательностью QRSSTG между остатками E739 и E746, добавили N-концевые остатки L973-T97, замкнули дисульфидные связи между остатками цистеина 5-32, 333-357, 483-485, 527-567 и рассчитали зарядовое состояние аминокислотных остатков димера при pH 6.0, используя алгоритм proPka. Укладку полипептидной цепи DaβGal в третичную и четвертичную структуры сравнили с укладкой широко применяемого в биотехнологии мезофильного грибного фермента из Aspergillus niger – AnβGal (код PDB 5JUV). Прежде всего, необходимо отметить, что в отличии от AnβGal исследуемый фермент характеризуется в растворе димерной, а не мономерной формой. Доменная организация DaβGal также существенно отличается от AnβGal: в отличие от последнего, каталитический домен окружают 6, а не 5 доменов, имеющих топологию бэта-сэндвичей (рулета jelly roll). Полипептидная цепь дважды в прямом и обратном направлениях насквозь пронизывает домены 3, 4, 5, таким образом общий ход цепи через домены можно представить как 1-2-3-4-5-6-5-4-3. Также большое количество существенных отличий наблюдается и в структурной организации активных центров этих ферментов. Молекулярное моделирование возможных вариантов связывания четырёх дигалактозидов со связями (1→6), (1→4), (1→3) и (1→2) в активном центре фермента позволяет сделать предположение, что DaβGal в реакции гидролиза дигалактозидов обладает региоселективностью в отношении гликозидных связей (1→6) и (1→4). В целом, решение задачи получения полной атомной структуры новой архейной гипертермостабильной β-галактозидазы (лактазы) открывает нам перспективы для рационального дизайна фермента с целью улучшения его биотехнологических характеристик, для выявления молекулярных механизмов работы фермента и выяснения природы термостабильности высокостабильных белков и ферментов. 2. Экстраклеточные везикулы (ЭВ), в частности экзосомы, представляют собой окруженные липидным бислоем нановезикулы, секретируемые многими клетками. На сегодняшний день, в силу того что экстраклеточные везикулы являются природными частицами, способными переносить большое количество нуклеиновых кислот и белков, сохраняя их стабильность, разработка систем доставки терапевтических биомолекул на основе ЭВ вызывает широкий интерес у научного сообщества. Тем не менее, на пути использования полученных из биологических жидкостей ЭВ в качестве доставщиков терапевтических агентов стоит ряд этических и производственных ограничений. Поэтому внеклеточные везикулы растительного происхождения (PEVs) являются более перспективными для решения таких задач. Считается, что PEVs из съедобных растений биосовместимы, биоразлагаемыми и могут быть получены в значительном количестве. В ходе выполнения проекта нам удалось оценить эффективность доставки экзогенных функциональных белков растительными везикулами к клеткам человека in vitro. В настоящей работе PEVs из грейпфрутового сока были выделены методом ультрацентрифугирования, после чего охарактеризованы по размеру, концентрации и морфологии при помощи анализа траектории наночастиц, динамического светорассеяния, атомно-силовой микроскопии и криоэлектронной микроскопии, что позволило получить высококачественные изображения мембранных везикул грейпфрута. Большая часть везикул имела сферическую форму, образованную липидным бислоем. Используя модели культивирования клеток in vitro, было показано, что внеклеточные везикулы грейпфрута (GF-EVs) высокоэффективны для доставки экзогенных белков бычьего сывороточного альбумина (BSA) и белка теплового шока (HSP70), меченных Alexaflour 647, в клетки аденокарциномы толстой кишки человека HCT-116 и DLD1. Кроме того, была подтверждена функциональная активность белков, доставленных в клеточные линии человека при помощи растительных везикул in vitro. В ходе работы была также произведена оценка распределения в тканях GF-EVs, нагруженных BSA, меченным радиоактивным 125I (125I-BSA) in vivo. Биораспределение оценивали количественно с помощью гамма-подсчета ex vivo. Радиоактивность наблюдалась в легких, мочевом пузыре, матке и яичниках, в печени, селезенке, почках, сердце, а также в образцах мозга. Было продемонстрировано, что 125I-BSA, нагруженный в GF-EVs, более эффективно распределяется по кровотоку и накапливается в различных тканях организма. Результаты данного исследования доказывают возможность использования нативных PEVs в системах доставки терапевтических агентов. Полученные данные вошли в публикацию по проекту: L. Garaeva, R. Kamyshinsky, Yu. Kil, E. Varfolomeeva, N. Verlov, E. Komarova, Yu. Garmay, S. Landa, V. Burdakov, A. Myasnikov, I. A. Vinnikov, B. Margulis, I. Guzhova, A. Кagansky, A.L. Konevega, T. Shtam. Delivery of functional exogenous proteins by plant-derived vesicles to human cells in vitro. Sci Rep 11, 6489 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-85833-y 3. На основе полученных экспериментальных данных негативного контрастирования, малоуглового рассеяния нейтронов и анализа гликозилирования белка, методами молекулярного моделирования была построена трехмерная полноатомная модель глюкоамилазы (ГА). Данная структура была использована при моделировании термоинактивации глюкоамилазы и поиску ее термолабильных участков. Далее проводили сайт-насыщающий мутагенез кодонов, лежащих в термолабильных регионах, и осуществляли поиск термостабильных форм белка методами направленной эволюции. Были получены 5 мутантых форм глюкоамилазы с улучшенной термостабильностью и изучены их каталитические свойства. Значения каталитической активности термостабильных форм ГА L60I и V64F незначительно отличались от значений белка дикого типа, значения форм L66A, N313G и 3DN – превышали на 30%. Наиболее термостабильным оказался вариант ГА с заменой N313G, изменение свободной энергии ddG для которой относительно ГА дикого типа составляло 1,74, 2,56 и 3,38 кДж/моль при 70, 75 и 80°C, соответственно. 4. Для вирусоподобных частиц Hbc-M2E методом криоэлектронной микроскопии были получены карты электронной плотности с разрешением 3A для частиц с топологиями T3 (180 мономеров) и T4 (240 мономеров). В обоих случаях по вписанным в электронную плотность структурам можно сделать вывод об ориентации антигенной петли, содержащей вставку M2E наружу вирусоподобной частицы. При этом получить полноатомную структуру антигенной петли со вставкой M2E не представляется возможным ввиду её высокой конформационной подвижности. 5. Для системы модельных ДНК-связывающих пептидов были получены предварительные структуры их комплексов с ДНК в виде фибрил.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Экстраклеточные везикулы (ЭВ) представляют собой мембранные везикулы клеточного происхождения, которые играют важную роль в межклеточных коммуникациях и физиологии. В данном исследовании мы впервые охарактеризовали ЭВ, секретируемые висцеральной (ВЖТ) и подкожной жировой тканью (ПЖТ) пациентов с ожирением и сахарным диабетом второго типа (СД2) с помощью криоэлектронной микроскопии. Криоэлектронная микроскопия позволила визуализировать гетерогенную популяцию ЭВ различного размера и морфологии, в том числе одиночные ЭВ и ЭВ с внутренней мембранной структурой в образцах пациентов с ожирением, а также в контрольной группе. Преобладали единичные везикулы (до 85% для ПЖТ, до 75% для ВЖТ), а для ВЖТ характерна более высокая доля ЭВ с внутренними мембранными структурами по сравнению с ПЖТ. Уменьшенный размер одинарных и двойных везикул ПЖТ по сравнению с везикулами ВЖТ, большая доля многослойных везикул и всех видов частиц со структурами внутренней мембраны, секретируемыми ВЖТ, отличали пациентов с ожирением с/без СД2 от контрольной группы. Эти результаты могут поддержать идею модифицированного биогенеза внеклеточных везикул при ожирении и сахарном диабете второго типа. Полученные данные вошли в подготовленную и к настоящему моменту прошедшую 2 этапа рецензирования публикацию: V.V. Miroshnikova, K.V. Dracheva, R.A. Kamyshinsky, E.V. Yastremsky, L.A. Garaeva, I.A. Pobozheva, S.B. Landa, K.A. Anisimova, S.G. Balandov, Z.M. Hamid, D.I. Vasilevsky, S.N. Pchelina, A.L. Konevega, T.A. Shtam. Cryo-electron microscopy of adipose tissue extracellular vesicles in obesity and type 2 diabetes mellitus. PlosOne. 2023. Under review. 2. В ходе выполнения проекта проведен анализ субпопуляций микровезикул плазмы крови человека методами криоэлектронной и атомно-силовой микроскопии. На сегодняшний день методы характеристики экстраклеточных везикул (ЭВ) чрезвычайно разнообразны, среди них вклад атомно-силовой микроскопии (АСМ) часто ограничивается распределением по размерам. В проведенном исследовании мы сосредоточились на наномеханической характеристике выделенных из плазмы крови ЭВ с помощью АСМ в жидкости и корреляции полученных данных с происхождением ЭВ, а также их морфологии, определенной с помощью крио-ТЭМ. Результаты исследований отражены в публикации: https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2022.130139 3. Растительные экстраклеточные везикулы (РЭВ)– наноразмерные частицы, окруженные липидным бислоем, способные переносить белки и нуклеиновые кислоты, что потенциально делает их перспективными участниками систем доставки терапевтических молекул. На данный момент, недостаточно данных об их структурных, функциональных особенностях, более того нет исследований, демонстрирующих возможность их нагрузки и захвата клетками млекопитающих. В отчетный период проекта проведены работы по изучению физических свойств растительных везикул из продуцентов, ранее не представленных в литературе, а также оценка эффективности нагрузки и доставки экзогенных биомолекул к клеткам человека in vitro. В ходе работы впервые были получены и охарактеризованы везикулы растительного происхождения из 7-ми продуцентов, ранее не представленных в литературе. Более того впервые были получены и подробно охарактеризованы везикулы из таких представителей, как простейшие растения – зеленые одноклеточные водоросли (сhlamydomonas, сhlorella). По результатам данного исследования, на основе трех параметров: выход частиц на100 мл сока, размер частиц и нагрузочная способность, везикулы дыни, огурца и калины были определены в качестве наиболее перспективных доставщиков. Стоит отметить, что несмотря на малый выход, но доступность и эффективность доставки, продемонстрированной РЭВ хламидомонады, делают их также перспективными «контейнерами» для доставки экзогенных биомолекул к клеткам человека. В результате работы, были определены наиболее перспективные в индустриальном ключе продуценты РЭВ по соотношению эффективность доставки/эффективность выхода. 4. Бэта-галактозидазы различного происхождения, а также их мутантные формы, находят широкое применение в производстве безлактозных продуктов и различных галакто-олигосахаридов, включая пребиотики и лекарственные средства. В отчетном периоде мы продолжили изучение структурных особенностей и каталитических свойств (реакции гидролиза и трансгликозилирования) термостабильной β-галактозидазы DaβGal из гипертермофильной археи D. amyloliticus, с применением методов генной инженерии, биохимии, ЯМР-спектроскопии, вычислительных подходов и криогенной электронной микроскопии. Исследованием активности мутантных форм DaβGal E149Q и E221Q, созданных нами с использованием специально сконструированных генетических конструкций, подтвердили, что Glu149 и Glu221 выполняют функции кислотно-основного и нуклеофильного каталитического остатка соответственно. Установили, что мутантная форма белка E149Q, обладает более чем в 100 раз пониженной гидролитической активностью по сравнению с ферментом дикого типа, не способна расщеплять лактозу, что, по-видимому, способствует накоплению продуктов переноса галактозы на пНФ-галактозид. С помощью ЯМР-спектроскопии неразделенной реакционной смеси подтвердили, что DaβGal E149Q, как и фермент дикого типа обладает региоселективностью в отношении синтеза β-(1-4) гликозидной связи. Особенностью архейного фермента также оказалась несвойственная грибным β-галактозидазам повышенная в 3,5 раза активность в отношении пНФ-β-D-фукопиранозида, отличающегося от галактопиранозида отсутствием гидроксильной группы в положении C6. Продемонстрирована высокая термостабильность фермента DaβGal при анализе остаточной активности после прогрева в диапазоне температур от 65 до 100С. Показали, что стабилизация димерной структуры фермента обеспечивается обширной сетью ионных связей: 246 заряженных а.к. остатка образуют 80 ионных пар, организующихся в 53 графа различной топологии, в состав которых входит от двух до семи а.к. остатков. Стабилизация интерфейса димера осуществляется как электростатическими, так и гидрофобными взаимодействиями. 5. При изучении в рамках проекта комплекса эукариотической рибосомы с потенциальным ингибитором синтеза белка получены предварительные структурные и биохимические данные о возможном связывании айлантона (вещество, экстрагируемое из Ailanthus excelsa) с рибосомой человека. Несмотря на описанные в литературе и проверенные в рамках этого проекта терапевтические эффекты айлантона в отношении ряда онкологических заболеваний, его мишень в клетке и молекулярный механизм действия оставались неизвестными. В данной работе методами мРНК-трансфекции и in vitro трансляции мы показали, что айлантон ингибирует биосинтез белка в клетках млекопитающих. С помощью криоэлектронной микроскопии высокого разрешения была получена структура 80S рибосомы человека в комплексе с айлантоном. Идентификация мишени айлантона открывает возможности для его использования в клинике.