Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Целью выполнения предлагаемого проекта является исследование пространственной структуры ионотропных рецепторов человека и их взаимодействия с лигандами методами просвечивающей крио-электронной микроскопии (крио-ПЭМ). В качестве объектов исследования выбраны малоизученные ионотропные рецепторы человека: никотиновый ацетилхолиновый рецептор а7-nAChR и кислото-чувствительный канал ASIC3. На первом этапе проекта было опробовано несколько подходов для рекомбинантной продукции канала ASIC3 человека и никотинового ацетилхолинового рецептора а7 типа человека. Несмотря на большой арсенал примененных подходов, не удалось добиться миллиграммовых выходов исследуемых белков, необходимых для исследований с помощью крио-ПЭМ. На втором этапе проекта планируется применить для продукции обоих белков бакуловирусной системы продукции, которая сейчас часто используется для похожих задач, или ферментацию клеток млекопитающих в биореакторах большого объема. Для последующей инкорпорации исследуемых рецепторов в липид-белковые нанодиски были получены миллиграммовые количества аполипопротеина MSP2N2. Кроме того, для повышения стабильности липид-белковых нанодисков, была получена конструкция для получения ковалентно циклизованных нанодисков с применением интеиновой технологии, позволяющая получать циклизованный MSP2N2 непосредственно в культуре клеток E. coli. Для стабилизации и очистки а7-nAChR нами было опробовано несколько мембраномоделирующих сред: мицеллы детергентов DDM/CHS, липид-белковые нанодиски и амфиполы А8 и PMAL. Нанодиски собирали упрощенным способом (Шенкарев и др, 2018): к мембранной фракции, солюбилизированной в DDM/CHS, до очистки сразу добавляли MSP2N2, инкубировали 2 часа и детергент удаляли с помощью специального сорбента Bio-Beads. Из-за низкого выхода экспрессии а7-nAChR классический способ сборки нанодисков (уже для очищенного в детергенте препарата) применить не удалось, так как для него требуется значительно большее количество целевого белка. Какая мембраномоделирующая среда подходит лучше для стабилизации рецептора в растворе будет исследовано методами крио-ЭМ на следующем этапе проекта. В ходе выполнения первого этапа проекта, используя ранее разработанную систему продукции в клетках P. pastoris, были получены миллиграммовые количества рекомбинантного внеклеточного домена a7-nAChR (химера внеклеточного домена и ацетилхолин-связывающего белка [Li et al, 2011]). Для исследования методами крио-ЭМ и удаления углеводных групп (сахаров), возникших в ходе пострансляционного гликозилирования, домен подвергали гидролизу ферментом endoH, и дополнительно очищали с помощью гель-фильтрации. Для дальнейшего анализа домена с помощью плазмонного резонанса и криоЭМ выделяли фракцию, соответствующую пентамеру домена. Функциональная активность химерного внеклеточного домена a7-nAChR была продемонстрирована в экспериментах по взаимодействию с а-бунгаротоксином методом плазмонного резонанса (оптический SPR-биосенсор Biacore 3000). Была показана высокая функциональная активность химерного домена a7-nAChR. Однако, как оказалось, этот метод не подходит для изучения взаимодействия домена как с бета-амилоидным пептидом (для которого не удалось получить активные чипы), так и с обратимо связывающимися модуляторами a7-nAChR, имеющими низкое сродство к рецептору (в сравнении с а-бунгаротоксином, трехпетельные лиганды a7-nAChR человека демонстрируют IC50 ~ 30 мкМ). Для того, чтобы иметь возможность детектировать образование комплекса лиганд/химера, был разработан новый метод. Формирование комплекса химеры a7-nAChR c лигандами человека (SLURP-1, SLURP-2, Lynx1, фрагмент петли Lynx1) и «слабого» токсина из яда кобры Naja kaouthia WTX было исследовано с помощью гель-фильтрации в присутствии флуоресцентного лиганда. Для этого исследуемые лиганды были ковалентно помечены флуоресцентным красителем CF647 (Sigma) и проинкубированы с химерным доменом в соотношении лиганд/рецептор ~10:1. О формировании комплекса судили по появлению пика в канале флуоресценции с временем элюции, близким к времени элюции домена a7-nAChR. Этот метод позволил предсказать формирование комплексов для лигандов человека, а также токсина WTX. В случае лигандов Lynx1 и SLURP-1 наблюдалось также образование высокомолекулярных агрегатов, сходящих с колонки заметно раньше химеры. На первом этапе выполнения проекта с помощью просвечивающего крио-электронного микроскопа Titan Krios 60-300 была исследована пространственная структура внеклеточного домена a7-nAChR, как сама по себе, так и в комплексе с бета-амилоидным пептидом и токсином WTX. Однако, во всех случаях наблюдалось наличие преференционных ориентаций объектов на сетках в слое аморфного льда, с подавляющим преобладанием ориентаций типа «вид сверху» или «вид снизу» с отсутствием боковых проекций. Для решения этой проблемы был получен набор изображений, снятых с наклоном держателя образца на 15° и 30°. Проекции, принадлежащие к отобранным классам, в дальнейшем были использованы для 3D реконструкции с учетом симметрии С5 и с использованием кристаллической структуры домена в качестве референсной структуры. Была получена трехмерная структура домена диаметром ~ 9 нм и высотой ~ 7 нм. Из-за наличия преференционной ориентации разрешение структуры составило не более 8 Å. Для решения проблемы с преференционной ориентацией был опробован ряд методов и их комбинаций: (1) добавление различных «мягких» детергентов в раствор домена в разных концентрациях (digitonin, LMNG, CHAPSO, Tween20); (2) использование различных типов сеток Quantifoil R 1.2/1.3 (медные, Graphene, Graphene Oxide, Graphene Oxide (модифицированные амином или PEG-амином), золотые; (3) использование разных типов антител (антитела на His-таг, антитела на внеклеточный домен a7-nAChR); (4) съёмка под разными углами (15°, 30°, 45°). Однако, ни один из подходов не позволил изменить ориентацию домена на сетках. Методами гель-фильтрации было показано, что «слабый» токсин WTX образует комплекс с химерным доменом a7-nAChR (см. выше). Для получения наиболее полной информации о структуре комплекса, было проведено два набора данных – в стандартном режиме (угол наклона держателя образцов 0°) и с наклоном держателя 15° и 30°. Результаты 2D классификации частиц комплекса внеклеточного домена a7-nAChR с токсином WTX после объединения данных, полученных под разными углами, продемонстрировали наличие пяти симметрично расположенных дополнительных плотностей, отсутствующих в образцах внеклеточного домена без WTX. В результате 3D классификации была получена трехмерная реконструкция комплекса домен/WTX. В полученную плотность комплекса с помощью программы DireX были вписаны кристаллическая структура домена (PDB-код 4HQP, Huang et al., 2013) и структура WTX, полученная ранее авторами проекта (PDB-код 2MJO, Lyukmanova et al, 2015). Это, несмотря на низкое разрешение структуры комплекса, позволило предсказать ориентацию токсина по отношению к домену и рецептору в целом. Видно, что токсин расположен в нижней части домена рецептора и, возможно, контактирует с мембранным окружением рецептора остатками третьей петли. Ранее наличие мембранной активности WTX было предсказано в работах авторов проекта (Lyukmanova et al, 2016) и (Шенкарев и др, 2018). На следующем этапе проекта планируется определить мембраноактивный сайт в молекуле токсина WTX и провести моделирование комплекса токсина с полноразмерным рецептором в мембранном окружении. Таким образом, основные задачи, поставленные на первый этап проекта, выполнены. Обозначены задачи, которым следует уделить большее внимание на втором этапе проекта (например, разработка эффективных систем продукции полноразмерных каналов ASIC3 и a7-nAChR).

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Целью проекта является изучение лиганд-рецепторных взаимодействий и установление механизмов действия протон-чувствительного канала ASIC3 человека, одного из ключевых рецепторов ноцицептивной системы, и никотинового ацетилхолинового рецептора а7 типа, играющего важную роль в регуляции когнитивных процессов. Оба объекта являются перспективными мишенями для разработки новых лекарств для лечения боли, а также нарушений памяти и обучения, однако, в настоящее время пространственная структура и механизм проведения сигнала этими рецепторами остаются малоизученными. В рамках выполнения второго этапа проекта была проведена оптимизация системы рекомбинантной продукции ASIC3 человека в связи с низким выходом целевого продукта. Для этого была использована система рекомбинантной продукции ASIC3, основанная на бакуловирусной экспрессии в клетках насекомых SF9. Были получены генно-инженерные конструкции для продукции полноразмерного и укороченного вариантов ASIC3. В этих конструкциях на N-конце ASIC3 находился красный флуоресцентный белок RFP, между генами RFP и ASIC3 была предусмотрена последовательность, кодирующая линкер, содержащий «таги» для очистки (10His-3ХFLAG), а также сайт для гидролиза слитного белка тромбином. Исследование функциональной активности полноразмерного и укороченного вариантов ASIC3 методами электрофизиологии в ооцитах X. Laevis показало активность полноразмерного варианта, близкую к активности природного канала, в то время как укороченный вариант оказался неактивен. В клетках E. coli (DH10Bac) был получен клон, содержащий бакмиду, кодирующую ген полноразмерного ASIC3, которую использовали для получения бакуловируса для заражения клеток насекомых SF9 и продукции рекомбинантного канала. Были подобраны условия экспрессии, выделения и очистки рекомбинантного ASIC3 из клеток насекомых SF9. Были опробованы две мембраномоделирующие среды для стабилизации ASIC3 в растворе: мицеллы детергента DDM и амфиполы А8-35. Для этого выделение и очистку ASIC3 осуществляли в присутствии мицелл детергента DDM, затем часть препарата ASIC3 оставляли в DDM, а часть переводили в амфиполы А8-35. Образцы ASIC3 в мицеллах детергента DDM и амфиполах А8-35 были исследованы методами крио-ПЭМ. Для препарата ASIC3, встроенного в мицеллы DDM, была проведена 2D классификация (906655 частиц на первом этапе и 47062 частиц на втором этапе). Для трехмерной реконструкции без применения симметрии было отобрано 4110 частиц, схожих по морфологии с ожидаемыми проекционными изображениями ASIC3. Полученная реконструкция позволяет предположить наличие симметрии С3 у наблюдаемого объекта. Реконструкция с применением С3 соответствовала ожидаемой форме ASIC3. Однако, полученные данные свидетельствуют о недостаточной концентрации частиц образца в слое аморфного льда. Для определения структуры с высоким пространственным разрешением необходима дальнейшая оптимизация условий подготовки образца и увеличение его концентрации. Анализ препарата ASIC3 в амфиполах А8-35 показал наличие частиц, схожих по морфологии с ожидаемыми проекционными изображениями ASIC3, однако ASIC3 в мицеллах детергента продемонстрировал бОльшую схожесть структуры с ожидаемой. Вероятно, мицеллы детергента DDM являются более подходящей мембраномоделирующей средой для структурных исследований ASIC3. Таким образом, разработана система эффективной рекомбинантной продукции полноразмерного рецептора ASIC3 человека, позволяющая получать белок в количествах, достаточных для структурного анализа методами крио-ПЭМ. Более тонкий поиск условий для повышения чистоты препарата и полноценных структурных исследований ASIC3 (добавление и/или использование других детергентов, использование лигандов для стабилизации канала, повышение количества получаемого белка), будет продолжен в следующем году. Дальнейшая оптимизация параметров микроскопии и пробоподготовки позволит улучшить качество образцов и перейти в следующем году к определению структуры канала. Для исследования активности ASIC3 человека и последующего изучения методами крио-ПЭМ структуры комплексов этого канала с агонистами и антагонистами были получены миллиграммовые количества ноцистатина крысы, активирующего каналы ASIC в концентрациях 1 мМ и ниже, и токсина-ингибитора ASIC3 Ugr9-1 из морской анемоны. Функциональная активность полученных нейропептидов была подтверждена методами электрофизиологии в ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus laevis, экспрессирующих ASIC1а крысы и ASIC3 человека. Низкий уровень экспрессии а7-nAChR человека, полученный на первом этапе проекта в результате транзиентной экспрессии с использованием вектора pLVT/a7-nAChR в клетках HEK293GNTi-, побудил нас разработать альтернативную систему рекомбинантной продукции а7-nAChR, основанную на получении бакуловируса с геном а7-nAChR в клетках насекомых SF9, а затем заражении этим вирусом клеток млекопитающих НЕК293GNTi-, стабильно экспрессирующих NACHO, кофактора, необходимого для мембранной экспрессии функционального рецептора а7-nAChR. Было получено три моноклона клеток НЕК293GNTi-, демонстрирующих высокую экспрессию NACHO. В ходе выполнения третьего этапа проекта планируется провести подбор условий экспрессии a7-nAChR после заражения выбранных моноклонов бакуловирусом, варьируя концентрацию вируса, концентрацию клеток и время после трансдукции. Пока проводилась работа по получению моноклонов, стабильно экспрессирующих NACHO, была получена конструкция на основе вектора pVAX1, кодирующая ген 10His-FLAG/а7-nAChR, в котором по сравнению с прошлым годом был добавлен полигистидиновый таг и увеличен FLAG таг. Были подобраны условия выделения и очистки 10His-FLAG/а7-nAChR из клеток НЕК293GNTi-. Рецептор выделяли из клеток в присутствии детергентной смеси DDM/CHS и a-бунгаротоксина, - ингибитора а7-nAChR, который добавляли для стабилизации рецептора. Сравнительный анализ условий очистки 10His-FLAG/а7-nAChR на FLAG-Sepharose и метал-хелатной смоле TALON выявил бОльший выход рецептора в последнем случае. Анализ вестерн-блотом с помощью антител к His-тагу и гель-фильтрации на колонке Superdex-200 Increase (10/300) показал высокую гомогенность препарата. Таким образом нами были подобраны условия солюбилизации и очистки 10His-FLAG/а7-nAChR. Общеизвестным альтернативным способом получения молекул для структурных исследований, является выделение белков из природных источников, экспрессирующих целевой объект в большом количестве. Используя химерный внеклеточный домен a7-nAChR в качестве реперного образца, мы смогли определить концентрацию a7-nAChR в лизате мозга крысы методом иммунодетекции. Рассчитанная концентрация оказалась равной ~ 0.6 мг на 1 г ткани головного мозга. Столь высокая концентрация рецептора в мозге позволяет рассматривать выделение нативного рецептора из мозга крысы как реальную альтернативу рекомбинантной продукции. Использование синтетического фрагмента центральной петли нейромодулятора человека Lynx1, обладающего микромолярной аффинностью по отношению к α7-nAChR и полученного ранее авторами проекта в миллиграммовых количествах, позволило экстрагировать a7-nAChR из мозга крысы, что было подтверждено с помощью SDS-ПААГ c окраской по серебру, вестерн-блотом с использованием антител к a7-nAChR и методом гель-фильтрации на колонке Superdex-200 Increase (10/300). Микроскопия полученных образцов методом негативного контрастирования также показала наличие частиц, сходных по размеру и форме с a7-nAChR, однако количество частиц, экстрагированных с помощью выбранного лиганда было слишком мало, что, возможно, связано с низкой аффинностью фрагмента Lynx1 и невысокой чистотой полученного препарата рецептора. Поэтому для выделения рецептора из гомогената мозга крысы был предложен другой лиганд a7-nAChR, обладающий наномолярной активностью по отношению к рецептору, - конотоксин ImI (IC50~50 нМ). Была разработана система рекомбинантной продукции ImI в составе слитного белка с мальтозосвязывающим белком MBP, полигистидиновым тагом и сайтом для гидролиза тромбином. На следующем этапе проекта будут получены миллиграммовые количества слитного белка MBP-ImI, что позволит произвести аффинную экстракцию a7-nAChR из гомогената мозга крысы за MBP-ImI, иммобилизованный на смоле TALON или NHS-Sepharose. Элюцию комплекса a7-nAChR/ImI планируется осуществить в результате гидролиза слитного белка тромбином прямо на аффинной смоле. В случае успешной реализации задуманного протокола, будет получен комплекс a7-nAChR/ImI в количествах, достаточных для структурных исследований. В ходе выполнения первого этапа проекта методами крио-ПЭМ выяснилось, что для внеклеточного химерного домена а7-nAChR (a7-ECD) наблюдается наличие префереционных ориентаций объекта в слое аморфного льда, с подавляющим преобладанием ориентаций типа «вид сверху» или «вид снизу» и отсутствием боковых проекций, связанных с наличием His-тага на С-конце молекулы домена. На втором этапе проекта был получен рекомбинантный домен 6His-a7-ECD, в котором 6His был перенесен на N-конец и отщеплялся с помощью тромбина. Для оценки влияния отсутствия His-тага на появление боковых проекций мы решили исследовать комплекс a7-ECD с высоко аффинным лигандом, - а-бунгаротоксином, для которого ранее также наблюдались только префереционные ориентации. Двумерная классификация изображений комплекса, полученных методами крио-ПЭМ, продемонстрировала наличие различных проекций частиц внеклеточного домена в слое аморфного льда. На полученных классовых суммах наблюдались 5 симметрично расположенных дополнительных плотностей, соответствующих а-бунгаротоксину. Использование проекционных изображений частиц без учета ориентации типа «вид сверху» позволило получить реконструкцию комплекса с разрешением 3.7Å в программе CryoSPARC. Трехмерная реконструкция в программе Relion с учетом симметрии С5 позволила получить структуру комплекса a7-ECD/а-бунгаротоксин со средним разрешением 3.37Å. Таким образом, нами была получена структура комплекса а7-ECD/а-бунгаротоксин с хорошим разрешением и было подтверждено, что наличие His-тага может сильно влиять на ориентацию домена в аморфном льду. В рамках выполнения первого этапа проекта методами крио-ПЭМ была получена структура комплекса а7-ECD/WTX с низким разрешением 6Å. Низкое разрешение было обусловлено подавляющим преобладанием ориентаций комплекса типа «вид сверху» или «вид снизу» с отсутствием боковых проекций. Несмотря на низкое разрешение структуры, было замечено, что ориентация токсина WTX в комплексе с доменом допускает взаимодействие токсина с мембранным окружением рецептора. Наличие мембраноактивного сайта в молекуле WTX было подтверждено методами ЯМР-спектроскопии с использованием 15N-меченого токсина. Информация о расположении WTX относительно а7-ECD совместно с данными ЯМР-спектроскопии о локализации мембраноактивного сайта токсина и данными о рецептор-связывающем сайте, расположенном в центральной петле токсина, ранее полученными авторами проекта, позволили методами компьютерного моделирования построить модель комплекса полноразмерного рецептора a7-nAChR с токсином WTX в мембранном окружении, близком по составу к нейрональной клеточной мембране, что в свою очередь позволило впервые описать новый тип взаимодействия нейротоксин/рецептор. В результате молекулярной динамики комплекса длительностью ~ 500 нс был проведён анализ лиганд-рецепторных и лиганд-мембранных взаимодействий, что позволило выявить новые остатки WTX (K13 и R18), играющие важную роль при взаимодействии с a7-nAChR и мембраной. Таким образом, впервые совокупностью методов крио-ПЭМ, ЯМР-спектроскопии, сайт-направленного мутагенеза и компьютерного моделирования была реконструирована структура полноразмерного a7-nAChR в комплексе со слабым токсином WTX в мембранном окружении. Результаты выполнения проекта были представлены на XXVIII Российской конференции по электронной микроскопии, прошедшей в г. Черноголовка. Кроме того, результаты выполнения проекта были опубликованы в виде трех статей (Q1) в рецензируемых журналах, индексируемых в базе данных Web of Science.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Целью проекта является изучение лиганд-рецепторных взаимодействий и установление механизмов действия протон-чувствительного канала ASIC3 человека и никотинового ацетилхолинового рецептора а7 типа. Оба объекта являются перспективными мишенями для разработки новых лекарств, однако, в настоящее время многие вопросы, связанные с пространственной организацией этих рецепторов, а также с механизмами, лежащими в основе регуляции их функции остаются малоизученными. В ходе исследований методами крио-ПЭМ комплекса внеклеточного химерного домена а7-nAChR (a7-ECD) с токсином WTX на предыдущих этапах проекта наблюдалась преобладающая ориентация a7-ECD типа «вид сверху». Для решения этой проблемы, была разработана конструкция pPICZaA/6His-a7-ECD, в которой 6His-tag находился на N-конце молекулы a7-ECD и мог быть отщеплен с помощью тромбина. Были получены миллиграммовые количества a7-ECD без 6His-tag. Однако, как и в случае с His-тагом, для комплекса а7-ECD/WTX наблюдались только ориентации типа «вид сверху» с отсутствием боковых проекций. Для выяснения роли аминокислотных остатков, формирующих мембраноактивный сайт WTX и предсказанных на предыдущем этапе проекта, были получены мутантные варианты WTX с заменами K13А, R18А и R18A/E21A. Титрование образцов мутантов липосомами показало, что оба мутанта K13А и R18А демонстрируют пониженное сродство к липидным везикулам по сравнению с токсином дикого типа, при этом двойной мутант R18A/E21A демонстрировал еще более низкое сродство к мембране по сравнению с одиночным мутантом R18A и токсином дикого тип, что указывает на важную роль остатков, расположенных в «голове» молекулы WTX для взаимодействия с мембраной. Для исследования роли мембранного сайта в молекуле WTX для взаимодействия с нативным рецептором а7-nAChR, мы исследовали конкуренцию мутантов WTX и TRITC-меченного а-Bgtx за взаимодействие с а7-nAChR, экспрессированным в клетках HEK293 методом проточной цитометрии. Одиночные мутации K13A и R18A существенно не меняли сродства токсина к а7-nAChR, в то время как двойная мутация R18A/E21A полностью инактивировала токсин. Таким образом, взаимодействие WTX с мембранным окружением играет ключевую роль для взаимодействия с природным рецептором. Анализ последовательностей трехпетельных нейротоксинов змей выявил, что большинство необычных (non-conventional) трехпетельных нейротоксинов (77%) содержит участок, похожий на мембраноактивный сайт WTX, у коротких а-нейротоксинов такой сайт встречается в 20% последовательностей, и лишь 11% длинных а-нейротоксинов имеют подобную последовательность. Таким образом, присутствие заряженных остатков в мембранно-связывающем сайте может служить предсказанием взаимодействия трехпетельного нейротоксина с мембранным окружением рецептора. Был продолжен подбор мембраномоделирующей среды для структурных исследований канала ASIC3. Проведен поиск наиболее эффективных детергентов для солюбилизации канала из клеточных мембран. Были опробованы детергенты Triton-X100 и DDM в разных концентрациях. Было установлено, что использование Triton-X100 позволяет получить наибольшее количество солюбилизированного ASIC3. Также была подобрана смола для аффинной очистки. Наибольший выход белка при очистке обеспечивала смола TALON, однако количество примесных белков было существенно меньше при использовании FLAG-агарозы, поэтому для дальнейшей работы мы остановились на использовании этой смолы. После очистки на ANTI-FLAG M2 agarose ASIC3, выделенный с 6 л культуры клеток Sf9, встраивали в мембрано-моделирующие среды на основе амфипола А8-35 и липид-белковых нанодисков (ЛБН). Уже на этапе очистки с помощью гель-фильтрации было выявлено, что ЛБН значительно лучше стабилизируют ASIC3 в растворе и позволяют получать бОльший выход ренатурированного белка. Эти выводы были подтверждены также анализом методом ПЭМ с негативным контрастированием. Мы провели сравнительный анализ эффективности экстракции ASIC3 из мембран клеток Sf9 при помощи панели различных мембраномоделирующих сред на основе полимеров SMALP, формирующих липодиски (SMALP 140, SMALP 140-I, SMALP 200, SMALP 300, DIBMA 10, DIBMA 12, DIBMA Glucosamine, DIBMA Glycerol). Было показано, что SMALP 300 и SMALP 140 наиболее эффективно экстрагируют ASIC3 из клеточной мембраны. Таким образом, нами подобраны условия очистки и стабилизации ASIC3 с помощью ряда мембраномоделирующих сред для дальнейших структурных исследований. В рамках текущего этапа проекта был проведен подбор условий для экспрессии полноразмерного a7-nAChR в клетках НЕК293, стабильно экспрессирующих молекулярный шаперон рецептора NACHO. Анализ показал очень низкий уровень экспрессии а7-nAChR при этом подходе. В качестве альтернативы, нами была использована методология ко-трансдукции клеток вирусами, содержащими гены а7-nAChR-bRIL и NACHO. Были получены бакмиды, содержащие ген а7-nAChR-bRIL-strep. Данный вариант а7-nAChR вместо подвижной внутриклеточной петли содержит белок bRIL, применяемый для повышения стабильности рецептора. Также были получены бакмиды, содержащие ген NACHO. Были отобраны 4 бакмиды, содержащие а7-nAChR, и исследована степень инфицирования клеток Sf9 при использовании разных клонов и вирусных стоков Р1 и Р2. Клоны 1, 3 и 4 демонстрировали наибольшую (~ 80 %) степень инфицирования. Также были отобраны три клона бакмид, содержащих NACHO, и показано, что все они инфицируют клетки SF9 почти со 100% эффективностью. Высокая степень трансдукции клеток SF9 свидетельствует о возможности получения более высокого титра вируса для трансдукции клеток млекопитающих на следующем этапе проекта. Для экстракции а7-nAChR из гомогената мозга грызунов на прошлом этапе проекта нами был получен рекомбинантный высокоаффинный лиганд а7-nAChR, - конотоксин ImI, в виде слитного белка с MBP. Однако, конотоксин в слитной конструкции с МВР оказался неактивен, поэтому, мы разработали несколько альтернативных конструкций для получения конотоксина ImI в составе слитных белков с партнерами, способствующими корректному замыканию дисульфидных связей. Рекомбинантный ImI был получен в составе слитных белков с тиоредоксином (TRX-ImI) и глутатион-S-трансферазой (GST-ImI), в линкере которых содержался 6His-tag для очистки с помощью Ni2+-Sepharose. Эффективность экстракции а7-nAChR из гомогената мозга мыши с помощью TRX-ImI оказалась крайне низкой, в то время как использование слитного белка GST-ImI позволило выделить рецептор. Способность слитного белка GST-ImI ингибировать ток через канал а7-nAChR была подтверждена методом two-electrode voltage clamp на ооцитах Xenopus laevis. В качестве альтернативного лиганда для экстракции а7-nAChR из гомогената мозга был предложен высокоэффективный лиганд этого рецептора (LT), разработанный ранее руководителем проекта на основе нейротоксина II (Lyukmanova et al., JBC, 2007). Были разработаны системы продукции LT в составе слитных белков с TRX и GST и подобраны условия их очистки. Анализ пространственной структуры TRX-LT и GST-LT с помощью ЯМР-спектроскопии показал, что только в составе слитного белка с TRX LT обладает корректной пространственной структурой. Таким образом, для дальнейшей работы для экстракции а7-nAChR из гомогената мозга помимо GST-ImI нами был отобран еще и белок TRX-LT. Разработан протокол экстракции нативного а7 рецептора из мозга грызунов с использованием слитных белков GST-ImI и TRX-LT. Почищенный в мицеллах детергента комплекс а7-nAChR/(гибридный белок) встраивали в мембраномоделирующие среды такие как мицеллы DDM, амфиполы А8-35 или ЛБН. Результаты очистки продемонстрировали возможность экстракции нативного рецептора как при помощи слитного белка GST-ImI, так и с использованием TRX-LT. Однако, использование для очистки 6His-tag привело к значительному содержанию примесных белков как в самих препаратах GST-ImI и TRX-LT, так и на стадии экстракции рецептора из гомогената мозга, что в итоге затрудняло анализ частиц а7-nAChR/токсин методами ПЭМ. Поэтому 6His-tag в линкере слитных белков был заменен на двойной Strep-tag, что значительно повысило чистоту слитных белков и препарата а7-nAChR, экстрагированного из гомогената мозга. Сравнительный анализ экстракции а7-nAChR из гомогената мозга мышей при помощи панели полимеров SMALP показал, что наибольший выход наблюдается при использовании SMALP 300 и SMALP 140. С использованием GST-Strep-ImI было проведено выделение a7-nAChR из гомогената мозга в полимерах SMALP 300 и SMALP 140. Таким образом нами были разработаны системы рекомбинантной продукции аффинных лигандов а7-nAChR: ImI и LT в виде слитных конструкций с рядом белков-партнеров. Осуществлена наработка слитных белков в миллиграммовых количествах, подтверждена их функциональная активность и корректная пространственная структура. Показано, что полученные лиганды GST-ImI, TRX-LT и GST-strep-ImI способны экстрагировать а7-nAChR из гомогената мозга мышей. Эффективность экстракции рецептора с помощью TRX-strep-LT анализируется в настоящее время. Таким образом, был проведен подбор условий очистки рецептора а7-nAChR в различных мембранных миметиках (мицеллы DDM, амфипол А8-35, липид-белковые нанодиски, липодиски). Исследование методом ПЭМ с негативным контрастированием а7-nAChR, полученных с использованием моноклонов, экспрессирующих NACHO, в составе мицелл DDM и амфипола А8-35 показало очень низкое содержание частиц ожидаемой формы, что видимо связано с низким выходом и высоким содержанием примесей. Напротив, использование TRX-LT и GST-ImI позволило экстрагировать а7-nAChR из гомогената мозга в необходимом количестве, но с высоким содержанием примесей. Применение GST-strep-ImI и полимеров SMALP 300 и SMALP 140 позволило получить изображения с высокой степенью чистоты и содержащие частицы ожидаемой пентамерной формы. Анализ очистки а7-nAChR, а также частиц с помощью ПЭМ указал на более эффективное встраивание рецептора в липодиски на основе SMALP 140.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Использованные для аффинной очистки таги 6-His и FLAG не обеспечили достаточную чистоту препарата RFP-ASIC3 для структурных исследований. Поэтому, мы разработали новую генетическую конструкцию pFastbac/RFP-ASIC3-StrepTag для продукции ASIC3 в клетках насекомых SF9, содержащую Strep-tag. Были протестированы различные условия пробоподготовки и мембраномоделирующие среды для стабилизации RFP-ASIC3-StrepTag в растворе (липид-белковые нанодиски, амфиполы и липодиски). Исследование методами крио-ЭМ выявило низкую стабильность и высокую конформационную подвижность ASIC3, полученного с использованием этой конструкции, во всех использованных миметиках (амфиполы, липид-белковые нанодиски, липодиски). Для повышения стабильности, три неспаренных остатка цистеина в молекуле ASIC3 (С25, С267 и С461) были заменены на остатки серина. Отсутствие влияния этих замен на функциональную активность канала была подтверждена методами электрофизиологии в ооцитах Xenopus. Изначально эта работа не была запланирована и сделана сверх плана. Для продукции мутантного варианта ASIC3 была использована генетическая конструкция pFastbacDual/ASIC3-3mut-StrepTag, при использовании которой происходит независимая экспрессия RFP, позволяющая следить за эффективностью трансдукции и уровнем продукции белков. На 4м этапе проекта была разработана новая мембраномоделирующая среда на основе смеси липидов, холестерина и мицелл DDM. Исследование препарата ASIC3-3mut-StrepTag в этой среде методами ПЭМ показало наличие частиц, схожих по морфологии с ожидаемыми. 2D классификация полученных изображений выявила изображения треугольной формы, соответствующие виду «сверху» тримерного канала ASIC3. Однако, изображения были нечеткие с едва различимой вторичной структурой, что указывает на большую подвижность и нестабильность канала. Вероятно, требуются дальнейшие модификации (например, делеции) подвижных участков молекулы ASIC3-3mut для стабилизации и исследования структуры этого канала методами крио-ПЭМ. В 2022 г в рамках другого проекта мы обнаружили, что мамбалгин-2 из яда черной мамбы взаимодействует не только с гомомерным каналом ASIC1, как было описано в литературе ранее, но и с гетероканалом ASIC1/a-ENac/g-ENac (Sudarikova et al., 2022). Мы предположили, что мамбалгин-2 может взаимодействовать и с ASIC3. Действительно, мамбалгин-2 ингибировал токи, индуцированные через канал ASIC3 закислением окружения, с IC50 ~ 34 мкМ, что указывает на возможность использования этого токсина для дополнительной стабилизации канала для структурных исследований. Эта работа также была не запланирована и сделана сверх заявленного плана. В ходе выполнения 3го этапа проекта для экстракции а7-nAChR из гомогената мозга были получены конструкции для продукции гибридных белков GST-Strep-ImI и TRX-strep-LT, содержащих Strep-tag в линкере между белком-партнером и токсинами-лигандами рецептора. Методами электрофизиологии была исследована аффинность гибридных белков GST-Strep-ImI и TRX-strep-LT по отношению к а7-nAChR, экспрессированному в ооцитах X. laevis. GST-Strep-ImI при концентрации 10 мкМ и инкубации в течение 10 минут ингибировал ионные токи, вызванные ацетилхолином, на 30%, при этом IC50 Trx-Strep-LT составила ~ 1 мкМ. Так как токсин LT в составе гибридного белка Trx-Strep-LT обладает корректной пространственной структурой (см. отчет 3го этапа), и ингибирующей способностью, превосходящей активность GST-Strep-ImI, для дальнейшей работы в качестве «наживки» для экстракции а7-nAChR из гомогената мозга был выбран Trx-Strep-LT. В рамках 4го этапа проекта был опробован ряд дополнительных условий получения а7-nAChR из гомогената мозга, включающих оптимизацию гидролиза Trx-Strep-LT/а7-nAChR тромбином, гидролиза комплекса на аффинной смоле или после очистки, а также элюцию комплекса Trx-Strep-LT/а7-nAChR со смолы не биотином, а избытком а-бунгаротоксина (ингибирует а7-nAChR с IC50 ~ 1 нМ). Анализ методами ПЭМ показал, что комплекс LT/а7-nAChR, встроенный в липодиски на основе SMALP140, по форме соответствует пентамерному а7 рецептору. Регуляторный белок 14-3-3 взаимодействует с фосфорилированными белками, обогащенными внутренне неупорядоченными областями, и влияет на стехиометрию α4β2-nAChR. Мы обнаружили, что не структурированная внутриклеточная петля а7 рецептора также содержит сайт связывания 14-3-3. Анализ методом иммуноблоттинга с антителами на His-таг, содержащийся в белке 14-3-3, и с помощью гель-фильтрации подтвердил связывание белка 14-3-3 с фософорилированным а7-nAChR. Таким образом, были подобраны следующие условия экстракции а7-nAChR из гомогената мозга: использование в качестве экстрагирующего лиганда Trx-Strep-LT, мембранный миметик на основе SMALP140, предварительное фосфорилирование внутриклеточной петли рецептора и ее стабилизация с помощью белка 14-3-3. Исследование взаимодействия а7-nAChR с 14-3-3 не было запланировано и сделано сверх заявленного плана. Анализ образца LT-а7-nAChR/14-3-3, полученного в результате препаративной экстракции рецептора из гомогената мозга и стабилизированного с помощью SMALP140, методами крио-ЭМ показал наличие частиц, по форме соответствующих пентамерному каналу а7-nAChR. Однако для полученных изображений наблюдалась преимущественная ориентация «вид сверху», боковые проекции полностью отсутствовали. Анализ изображений, полученных под наклоном сеток на 30°, показал отсутствие электронной плотности, соответствующей мембранной и внутриклеточной частям рецептора. Учитывая корректную массу рецептора по данным иммуноблоттинга и гель-фильтрации, эти результаты указывают на высокую конформационную подвижностью мембранной и внутриклеточной частей рецептора в окружении SMALP140, что делает их «невидимыми» для крио-ЭМ. Использование липид-белковых нанодисков также оказалось недостаточным для стабилизации комплекса LT/а7-nAChR. Исследование комплекса LT/а7-nAChR в липид-холестерин-DDM содержащей среде методами ПЭМ с негативным контрастированием показало наличие частиц с ожидаемой морфологией, но детализация структуры была недостаточной для структурных исследований. Это еще раз указывает на высокую подвижность и негомогенность полноразмерного рецептора а7, экстрагированного из гомогената мозга. Таким образом, для дальнейших структурных исследований взаимодействия а7 рецептора с лигандами, был выбран вариант рецептора, экспрессированный в НЕК293 с укороченной внутриклеточной петлей и встроенной в нее белком BRIL, часто используемым для стабилизации подвижных участков. Исследование препарата а7-nAChR-BRIL-Strep в липид-холестерин-детергентной смеси методами ПЭМ выявил частицы ожидаемой морфологии. Анализ полученных данных с последующей 3D реконструкцией (разрешение 14.5 и 21.7 Å в случае комплекса рецептора с ацетилхолином и а-бунгаротоксином, соответственно) продемонстрировали наличие частиц, похожих на а7-nAChR. В случае добавления а-бунгаротоксина наблюдалась дополнительная электронная плотность, соответствующая 5 молекулам токсина, связанным на интерфейсе внеклеточных доменов соседних субъединиц рецептора. Примечательно, что уже на уровне анализа данных ПЭМ наблюдались отличия в конформации внутриклеточной части и поры а7-nAChR, связанного с ацетилхолином (агонистом) и а-бунгаротоксином (антагонистом), что указывает на хорошую структурированность рекомбинантного рецептора и его функциональную активность в выбранном мембранном миметике. С помощью крио-ЭМ был проведен скрининг образцов а7-nAChR-BRIL-Strep в липид-холестерин-детергентной смеси в присутствии и в отсутствие ацетилхолина. Было показано наличие частиц ожидаемой формы, и проведена 3D реконструкция рецептора без ацетилхолина и с агонистом с разрешением 10.7 и 10.5 Å, соответственно, с осью симметрии пятого порядка. Анализ полученных электронных плотностей показал, что рецептор в подобранной мембранной среде обладает корректной пространственной структурой, что открывает перспективу дальнейших структурных исследований комплексов а7-nAChR со своими лигандами.