Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. Ранее было показано, что фрагменты геномной РНК вирусов растений, являющиеся 3’-концевыми усилителями трансляции (3’CITE), могут связывать различные компоненты белок синтезирующего аппарата растительных клеток. В частности, c участием сотрудников научного коллектива, была изучена 3’-концевая нетранслируемая область (3’-НТО) вируса деформирующей мозаики гороха (PEMV), содержащая целых три близкорасположенных 3’CITE, связывающих фактор инициации eIF4E, малую и большую субчастицы рибосом. Первой задачей проекта было создание короткой молекулы РНК, связывающей как фактор инициации eIF4F (через его субъединицу eIF4E), так и 40S субчастицу рибосом, с целью стабилизации положения фактора в составе преинициаторных рибосомных комплексов. Были синтезированы фрагменты геномной РНК PEMV2 разной длины, содержащие как индивидуальные 3’CITE, kl-TSS (связывает 40S) и PTE (связывает eIF4F(eIF4E)), так и их комбинацию. Был отобран фрагмент 8-klTSS-PTE длиной 179 нуклеотидов, являющийся дуплексом klTSS-PTE и обеспечивающий наиболее эффективное ингибирование трансляции репортерной мРНК в системе из зародышей пшеницы. Методом седиментационного анализа было доказано, что фрагмент 8-klTSS-PTE действительно связывается с 40S субчастицами, находящимися в составе преинициаторных комплексов. С целью получения изучаемого комплекса в препаративных количествах мы подобрали условия его формирования из очищенных 40S субчастиц, фрагмента вирусной гРНК и безрибосомного высокосолевого экстракта S100, содержащего все необходимые факторы инициации. С помощью седиментационного анализа было показано, что стабильный комплекс 40S субчастицы и фрагментов 8-klTSS-PTE образуется только в присутствии экстракта S100, и что количество комплекса увеличивается пропорционально увеличению концентрации S100 в реакционной смеси. Поскольку eIF4F является единственным фактором инициации, который представлен в зародышах пшеницы в большом недостатке по отношению к 40S рибосомной субчастице (4%) полученные данные являются дополнительным доказательством того, что именно eIF4F критически важен для связывания изучаемых фрагментов РНК с 40S субчастицей, и что насыщения комплексов этим фактором можно добиться, добавляя в систему избыток фракции S100. 2. Нами были получены штаммы E.coli, необходимые для исследования структуры рибосом и рибосомных субчастиц, собранных в клетках в отсутствие фактора RbfA и рибосомных белков L1 и L5. Cконструированные нами ранее штаммы с делециями генов rplA и rplE, а также полученный из независимых источников штамм с делецией гена rbfA были использованы для перенесения участков ДНК с упомянутыми делециями в штамм E.coli D10, дефицитный по РНКазе I (для получения рибосомных субчастиц, содержащих интактную рибосомную РНК) и в эталонный лабораторный штамм E.coli MG1655. Так как L5 является жизненно-важным белком в E.coli, в клетки с нокаутом гена этого белка была введена комплементирующая плазмида, обеспечивающая регулируемый синтез белка L5 in trans. Кроме того, нами была отработана методика выделения 70S рибосом из клеток E.coli, позволяющая получать высокоочищенные препараты, подходящие для структурных исследований с помощью крио-ЭМ. 3. Был проведен поиск экспрессионных штаммов E.coli для сверхпродукции белка Hfq этого организма в системе Штудиера и выбран штамм, в котором продукция белка была максимальной. Подобраны условия оптимального роста клеток, белок Hfq был выделен по разработанной нами методике с использованием многостадийной очистки. Полученный препарат белка был протестирован на гомогенность с помощью гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования. Было показано, что полученный препарат белка Hfq гомогенен и пригоден для структурных исследований. 4. Решена структура «референсных» препаратов 40S субчастиц пшеничных рибосом и 70S рибосом E.coli методом крио-электронной микроскопии и оценен уровень полученного разрешения. В сотрудничестве с НИЦ "Курчатовский институт" мы получили структуры 40S субчастиц и 70S рибосом с разрешением 4Å и 3Å, соответственно. Полученное значение разрешения структуры 40S – 4Å – по-видимому, ограничивается подвижностью отдельных ее доменов. Одной из задач данного проекта является решение структуры преинициаторного комплекса, содержащего, кроме 40S субчастицы, также факторы инициации, включая фактор инициации eIF4F. Мы предполагаем, что в составе преинициаторного комплекса подвижная голова 40S субчастицы будет зафиксирована факторами инициации в определенной конформации, что может обеспечить получение лучшего разрешения. Уже достигнутое нами высокое значение разрешения в случае 70S рибосом (3Å) должно позволить в дальнейшем надежно интерпретировать крио-ЭМ карту плотности интермедиатов рибосом, собранных in vivo в отсутствие рибосомного белка L1 или L5.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Первой задачей проекта является использвание коротких молекул РНК для стабилизации фактора eIF4F в составе преинициаторных рибосомных комплексов с целью определения его положения на рибосомной субчастице методом криоэлектронной микроскопии. В прошлом отчетном году мы синтезировали фрагмент РНК растительного вируса деформирующей мозаики гороха (8-klTSS-PTE), который способен одновременно связывать малую рибосомную субчастицу и фактор инициации eIF4F, и показали, что он образует комплексы с 40S субчастицей в присутствии безрибосомного высокосолевого экстракта S100 из зародышей пшеницы. В связи с этим была поставлена задача разработать схему препаративного получения и выделения комплексов 40S субчастиц с факторами инициации трансляции (43S преинициаторный комплекс, 43S PIC). Была разработана процедура препаративного получения и очистки комплексов 40S субчастиц с факторами инициации, основанная на использовании фракций экстракта зародышей пшеницы. Электрофоретический анализ подтвердил присутствие факторов инициации eIF3 и eIF2 не менее чем в 50% полученных рибосомных комплексов, и фактора eIF4F в несколько меньшем их количестве. Полученные препараты были использованы для крио-ЭМ анализа. Был собран набор из 675 000 проекций частиц. Поскольку образец обладает существенной гетерогенностью по составу, решение структуры, требующее процедуры глубокой классификации и большого времени компьютерной обработки данных, не закончено и продолжается в настоящий момент. Было изучено связывание полученных комплексов с фрагментом вирусной РНК. Было показано, что, в отличие от очищенных 40S рибосомных субчастиц, не содержащих факторов инициации, полученный нами комплекс субчастицы с факторами связывает фрагмент 8-klTSS-PTE, что подтверждает перспективность выбранного подхода. 2. Второй задачей проекта являются структурные исследования интермедиатов сборки бактериальных рибосом Escherichia coli, формирующихся в клетках в отсутствие универсально-консервативных рибосомных белков L1 и L5 при помощи крио-электронной микроскопии. В этом отчетном году мы получили препараты контрольных 50S рибосомных субчастиц дикого типа, а также 70S рибосом и «дефектных» 50S рибосомных субчастицы, которые формируются в штамме E. coli ∆L1, нокаутированном по гену рибосомного белка L1. Также были получены препараты 45S частиц (незрелых 50S рибосомных субчастиц), которые накапливаются в клетках E. coli в отсутствие рибосомного белка L5. Структуры контрольных 50S субчастиц, а также 70S рибосом и «дефектных» 50S субчастиц ∆L1 штамма были определены с высоким разрешением при помощи крио-ЭМ. Было впервые обнаружено, что в «дефектной» 50S субчастице помимо L1 отсутствует ряд других рибосомных белков. Это указывает на то, что белок L1, играет важную роль в сборке in vivo большой рибосомной субчастицы у бактерий, в отличие от сборки субчастицы in vitro. 3. В третьей части проекта планируется с помощью криоэлектронной микроскопии локализовать положение нового фактора биогенеза рибосомы (Hfq) на незрелой малой рибосомной субчастице E. coli. В этом году выделены незрелые 30S субчастицы из штаммов E. coli ∆rbfA и ∆hfq. Проанализирован белковый состав пре-30S субчастиц с помощью двумерного гель-электрофореза. Обнаружена немодифицированная форма белка S18 в препарате пре-30S ∆rbfA. С помощью крио-ЭМ впервые получены карты электронной плотности для пре-30S ∆rbfA и пре-30S ∆hfq. Каждая структура определена с разрешением 4.5 Å. Обнаружена дестабилизация спирали h44 и изменения в конформациях «головки» и «шпоры» в незрелых 30S субчастицах. Подтверждено, что Hfq, как и другие факторы биогенеза, принимает участие в формировании декодирующего центра, в частности, спирали h44. Протестировано связывание Hfq c пре-30S и получен препарат комплекса пре30S•Hfq, пригодный для дальнейших структурных исследований. 4. В текущем 2020 году были получены семь образцов рибосом и рибосомных комплексов с чистотой и гомогенностью, достаточной для их анализа с помощью крио-ЭМ. Для всех образцов были собраны наборы проекций для анализа методом одиночных частиц. Шесть структур были решены с высоком разрешением.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. Были получены крио-ЭМ данные для 40S субчастиц со связанным тройственным комплексом (фактор инициации eIF2, аминоацилированная инициаторная тРНК и нерасщепляемый аналог ГТФ) и проведена предварительная 3D реконструкция. Впервые было обнаружено, что в отсутствие мРНК тройственный комплекс может взаимодействовать не с мРНК-связывающим каналом, а с с боковой поверхностью головы 40S субчастицы образуя структуру, препятствующую спонтанной инициации трансляции на внутренних участках мРНК, гарантируя свойственную всем эукариотам 5’-конец-зависимую инициацию. Был проведен крио-ЭМ анализ структуры комплекса малой субчастицы рибосомы пшеницы с фрагментом вирусной РНК и фактором eIF4F. Предварительная 3D классификация полученных данных позволила выделить два класса частиц, в одном из которых наблюдалась добавочная электронная плотность на границе интерфейса и внешней стороны тела 40S субчастицы, в предполагаемом месте связывания фактора eIF4F. На основании ранее полученных крио-ЭМ данных высокого разрешения была построена и проанализирована атомная модель 40S субчастицы рибосомы пшеницы. Это первая модель субчастицы рибосом растений полученная с суб-3Å разрешением (2.7 Å). В существующие структурные данные было внесено большое количество дополнений и исправлений. Были определены или существенно перестроены структуры участков белков S4, S8, S11, S13, S17 и S9. 2. Методом крио-ЭМ была определены структуры 45S рибосомных субчастиц, собранных в клетках E. coli в отсутствие рибосомного белка L5, и «дефектных» 50S рибосомных субчастиц из ∆L1 штамма при субоптимальной концентрации ионов магния. Показано, что такие частицы лишены рибосомных белков L16, L18, L25, L27, L31, L33, L35 и L36, в них отсутствует 5S рРНК и центральный протуберанец, и увеличена подвижность латеральных выступов. 3. Определены крио-ЭМ структуры шести классов интермедиатов сборки 30S субчастиц, выделенных из клеток штамма с делетированным геном фактора биогенеза рибосом RbfA (∆rbfA). Эти классы отражают этапы созревания 30S субчастиц: от ранних интермедиатов, лишенных 3’-головного домена и с несформированным псевдоузлом до поздних – со сформированными головой, телом и платформой, но с незрелой конформацией верхнего сегмента спирали 44 декодирующего центра. Крио-ЭМ структуры незрелых ∆rbfA 30S субчастиц (∆rbfA пре-30S) были депонированы в банк PDB ( https://www.rcsb.org/structure/7oi0, https://www.rcsb.org/structure/7OE0 ) и банк данных электронной микроскопии (https://www.ebi.ac.uk/emdb/EMD-12855; https://www.ebi.ac.uk/emdb/EMD-12916; https://www.ebi.ac.uk/emdb/EMD-12854; https://www.ebi.ac.uk/emdb/EMD-12856 ). Структурный анализ полученных крио-ЭМ данных позволил сделать вывод, что RbfA глубоко вовлечен в процесс созревания 30S рибосомной субчастицы и участвует в двух его стадиях: ранней– формировании центрального псевдоузла, включая созревание головного домена, и поздней – правильном позиционировании спирали h44 в декодирующем центре 30S субчастицы рибосомы. Полученные нами структуры ∆rbfA 30S субчастиц позволят произвести оценку структурных изменений, происходящих в пре-30S частицах с участием факторов биогенеза. По результатам проделанной работы была опубликована статья в журнале International Journal of Molecular Sciences (https://www.mdpi.com/1422-0067/22/11/6140), входящем в первый квартиль и индексируемом основными наукометрическими базами данных. В этом отчетном году нами были собраны и предварительно обработаны крио-ЭМ данные для комплекса незрелых ∆rbfA 30S субчастиц с новым фактором биогенеза Hfq. Было определено три места посадки активной гексамерной формы белка Hfq на незрелую 30S субчастицу. Все результаты являются приоритетными и получены впервые.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Был проведен крио-ЭМ анализ 43S инициаторных комплексов. Доля хорошо разрешенных проекций 40/43S субчастиц в общем исходном пуле проекций составила ~25%. Трехмерная классификация дала три класса, структура одного из которых имела добавочные электронные плотности, соответствующие факторам инициации. Разрешение этих участков позволило визуализировать общую форму факторов и их положение на малой субчастице рибосомы. Было обнаружено, что положение и ориентация базовой части фактора eIF3 в 43S комплексе близко к описанным ранее для инициаторных 48S комплексов эукариот. Электронная плотность в зоне контакта субъединицы eIF3c с 40S субчастицей в 48S комплексе отсутствовала, указывая на то, что в 43S комплексе основным является взаимодействие субъединицы eIF3a с белком eS1 и 18S рРНК. Плотность, соответствующая тройственному комплексу, подтвердила отсутствие взаимодействия антикодоновой шпильки тРНКi с мРНК-связывающим каналом. Нами было улучшено разрешение электронной плотности 40S субчастицы рибосомы пшеницы и уточнена ее атомная модель. Разрешение полученной структуры составило 2,52 Å. Впервые была определена структура дистальной части головы 40S субчастицы рибосом растений и построена ее атомная модель. Удалось существенно уточнить структуру выступающих подвижных участков рибосомной РНК, так называемых RNA expansions. Были построены подробные карты 2'-O-метилирования и псевдоуридинилирования нуклеотидов 18S РНК пшеницы. 2. В ходе проекта мы при помощи крио-ЭМ изучили структуру больших рибосомных субчастиц (БРС) Escherichia coli, которые формируются in vivo в отсутствие одного из двух универсально-консервативных рибосомных белков: L5 и L1. Было показано, что в отсутствие белка L5 формируются только «дефектные» 45S БРС, в которых отсутствует электронная плотность, соответствующая белкам и рРНК центрального протуберанца. Отсутствие же рибосомного белка L1 приводит к формированию существенного количества тупиковых продуктов сборки БРС. Такие «дефектные» БРС лишены рибосомных белков L16, L35 и L36, нарушена структура некоторых элементов 23S рРНК. Кроме того, эти БРС являются внутренне нестабильными: при понижении концентрации магния в растворе происходит их декомпактизация. Пропадает плотность, соответствующая 5S рРНК, домену V 23S рРНК, ряду спиралей, принадлежащих домену II и домену IV, а также большому количеству рибосомных белков, которые в норме ассоциированы с соответствующими элементами рРНК. Стало очевидным, что, вопреки устоявшемуся мнению, белок L1 играет весомую роль в сборке БРС у бактерий. 3. Впервые с помощью крио-ЭМ было определено место связывания Hfq на незрелой малой рибосомной субчастице. Было показано, что «дистальной» стороной Hfq специфически связывается с А-богатыми нуклеотидными повторами апикальной части спирали 44h 16S рРНК Е.coli (1492-1504 н.о.; AAGUCGUAACAAG). Аденины располагаются в гидрофобных карманах Hfq, формируя ряд водородных связей и стэкинг взаимодействия с ароматическими группами консервативных аминокислотных остатков белка. Полученные нами результаты находятся в хорошем согласии с биохимическими данными, известными из литературы. Был сделан вывод, что Hfq принимает участие на поздних стадиях созревания 30S субчастицы и необходим для образования «продуктивных» структур 5'- и 3'-концов 17S рРНК для дальнейшего их процессинга и позиционирования спирали h44. Кроме этого, нами было установлено, что в условиях дефицита фактора биогенеза RbfA, белок Hfq способствует формированию центрального псевдоузла и стабилизации 3’-головного домена на ранних стадиях сборки 30S субчастицы. В дополнение, обнаруженное нами взаимодействие Hfq со зрелой 30S субчастицей, наводит на мысль, что Hfq может осуществлять регуляцию трансляции мРНК непосредственно на рибосоме, а не вне ее, как считалось ранее; требуются дальнейшие эксперименты.