КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-75-00063

НазваниеИсследование динамики реакции глии в гиппокампе крыс на провоспалительный стресc в раннем постнатальном онтогенезе

РуководительМанолова Анна Олеговна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук, г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2019 - 06.2021 

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-106 - Нейробиология

Ключевые словамикроглия, астроглия, гиппокамп, стресс, онтогенез, нейровоспаление, цифровая обработка фотографий, фрактальная размерность, автоматизация

Код ГРНТИ34.39.17


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
На настоящий момент показано, что стресс в раннем онтогенезе приводит к тому, что микро- и астроглия становятся более чувствительными к стрессирующим событиям в более взрослом возрасте. Следствием этого является большая подверженность различным социально значимым психическим и нейродегенеративным заболеваниям у тех индивидуумов, которые в детстве перенесли стресс (например, инфекционное заболевание или разлучение со значимым взрослым). Для выяснения механизмов такого изменения чувствительности и реакции глиальных клеток необходимо проведение как можно более полного анализа состояния глиальных клеток. Такой анализ должен включать в себя оценку морфологических характеристик в динамике. Для увеличения продуктивности и уменьшения влияния человеческого фактора, кажется логичным использование автоматических (или полуавтоматических) способов обработки микрофотографий срезов мозга с целью получения данных для анализа морфологических характеристик микро- и астроглии. Однако на сегодня компьютеризованный подход используется крайне редко. Целью предлагаемого проекта является провести анализ состояния микро- и астроглии в гиппокампе крыс в ответ на стресс в раннем постнатальном онтогенезе с использованием количественного критерия морфологии клеток. Преимущество данного проекта в том, что в нем будет исследована реакция двух типов глиальных клеток (микроглии и астроцитов) на стресс в раннем онтогенезе в динамике и с учетом полового диморфизма. Исследования, учитывающего все перечисленные характеристики, на сегодняшний день нет. Еще одним преимуществом проекта является использование автоматизированного подхода, который уменьшает время обработки, позволяя проанализировать большие объемы данных, и при этом получить объективные и надежные результаты.

Ожидаемые результаты
По окончании проекта будет представлен полный анализ влияния стресса в раннем онтогенезе на состояние микро- и астроглии в гиппокампе крыс. Анализ будет проведен с учетом пола животного и в трех временных точках: в инфантильном, в ювенильном и во взрослом возрастах. Морфологические характеристики клеток будут оценены разработанным в нашей лаборатории полуавтоматическим методом, что исключает влияние человеческого фактора и делает возможным сопоставление результатов с полученными другими исследователями в аналогичных экспериментах. На настоящий момент подобного полного анализа состояния глии после стресса в раннем онтогенезе в мировой литературе нет. Проведение такого анализа позволит приблизить выяснение механизмов возникновения и развития социально значимых психических и нейродегенеративных заболеваний.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Среди механизмов возникновения таких социально значимых заболеваний, как аутизм, шизофрения и депрессия, часто называют стресс в раннем детском возрасте. Одной из моделей такого стресса является провоспалительная провокация: введение эндотоксина, приводящее к активации не только иммунной системы, но и системы стресс-реакции организма. Такое воздействие отражается на всех клеточных элементах развивающегося мозга. В глиальных клетках происходит, так называемое, «праймирование», закладывающее способ реагирования клеток на молекулярные индикаторы стресса на протяжении всей последующей жизни. Дисфункция глиальных клеток в норме и/или в ответ на стрессирующие события может способствовать возникновению вышеупомянутых заболеваний. Подобное изменение глиальных клеток можно обнаружить не только с помощью молекулярных и биохимических методов исследования, но и по оценке таких показателей как число клеток и их морфологическое состояние. В нашей лаборатории была разработана методика оценки морфологии клеток микроглии с помощью автоматического анализа, который позволяет описать морфологию клетки одним показателем — фрактальной размерностью. Объекты, обладающие сложной формой, такой, например, как ветвящиеся отростки рамифицированных клеток микроглии имеют фрактальную размерность близкую к 2. У объектов с редуцированными отростками, по форме более близких к кругу, фрактальная размерность будет ближе к 1. Оценивая фрактальную размерность клеток микроглии и плотность их популяции, можно определить степень их активированности. Такие данные позволят судить о масштабе влияния провоспалительного процесса на состояние микроглии, а значит, помогут в выяснении этиологии социально значимых психоневрологических заболеваний. Для исследования глиальных изменений, вызванных стрессом в раннем онтогенезе (СРО), мы использовали модель введения липополисахарида (компонент клеточной стенки бактерий, эндотоксин) на 3 и 5 постнатальные дни (ПД). Эндотоксин вводили подкожно, в дозе 50 мкг/кг. Контрольным крысятам вводили физ. раствор в эквивалентном объеме. В дальнейшем исследовали влияние СРО на поведенческие характеристики крыс и на состояние микроглии в гиппокампе. Для исследования поведения проводили тесты: открытое поле (ОП), приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) и тест Порсолта, в двух возрастах — подростковом (1 мес.) и взрослом (3 мес.). Исследование микроглии проводили в полях СА1 и СА3 и в хилусе зубчатой фасции дорсального и вентрального отделов гиппокампа для двух возрастов: ювенильного (ПД18) и подросткового (1 мес.). Для исследования изменений микроглиальных клеток в лаборатории была доработана методика автоматической оценки морфологического состояния микроглии и подобраны параметры фильтров, используемых для обработки изображений. Исследование поведения и состояния микроглии в ответ на СРО проводили в контексте рассмотрения половых различий. Исследование микроглии в гиппокампе контрольных крыс ювенильного и подросткового возрастов показало достоверное уменьшение числа клеток микроглии в полях СА1 и СА3 гиппокампа с возрастом, независящее от пола животных. Для ювенильного возраста (ПД18) мы наблюдали некоторый след реакции микроглии на СРО. Он проявлялся в уменьшении фрактальной размерности клеток микроглии в поле СА3 гиппокампа, что говорит об отставленном более активированном по сравнению с контролем состоянии клеток. В дополнение к этому у самок, подвергнутых СРО, в хилусе зубчатой фасции число клеток микроглии было уменьшено по сравнению со своим контролем и с числом клеток в этом отделе мозга у самцов. Указанные изменения обнаружены только в дорсальном отделе гиппокампа. В подростковом возрасте (1 мес.) указанные отличия микроглии контрольных крыс и крыс, подвергнутых СРО, пропадали. Более того, нам не удалось обнаружить какого бы то ни было влияния СРО на состояние клеток микроглии ни у самцов, ни у самок. Однако при этом начал ярче проявляться половой диморфизм. Если в ювенильном возрасте достоверность различий по фактору «пол» проявлялась только в контексте последствий влияния СРО, то в подростковом возрасте различия по фактору «пол» были независимы от фактора «СРО». Так, например, в большинстве исследованных областей гиппокампа фрактальная размерность клеток микроглии у самок была несколько ниже, чем у самцов. Достоверности это различие достигало только в поле СА1 вентрального гиппокампа, а в поле СА3 дорсального гиппокампа и в хилусе зубчатой фасции обоих отделов гиппокампа носило характер тенденции. В дополнение число клеток микроглии в хилусе зубчатой фасции дорсального гиппокампа было достоверно выше у самок крыс, чем у самцов. В поле СА1 дорсального гиппокампа мы наблюдали аналогичное различие, но лишь на уровне тенденции. Интересно, что именно в возрасте 1 месяца у крыс начинает проявляться половой диморфизм в поведении (M. Bell, 2018). В нашем эксперименте половой диморфизм поведения проявился в тесте ПКЛ: самки вели себя более тревожно. Это проявлялось в достоверно меньшем числе входов в открытые рукава лабиринта и достоверно меньшем времени, проведенном в открытых рукавах и в центре лабиринта, по сравнению с самцами. Как и в случае с отличиями, обнаруженными в состоянии глиальных клеток, отличия в поведении в ПКЛ не зависели от наличия СРО. Зато эффект СРО проявился в тесте ОП. Здесь и самцы, и самки, подвергнутые СРО, проходили меньшую дистанцию и делали меньше выходов в центр. При этом у групп животных, подвергнутых СРО, было увеличено число актов груминга. Такой паттерн поведения говорит о повышении уровня тревожности животного. Во взрослом возрасте (3 месяца) паттерн поведения крыс, подвергнутых СРО, в тестах ОП и ПКЛ изменился. В тесте ОП больше не было отличий между группами по фактору «СРО», но появились отличия по фактору «пол». Так, самки крыс проходили большее расстояние, но делали меньшее число стоек, чем самцы. Это различие характерно для крыс и хорошо описано в литературе, но стоит отметить, что проявилось оно только уже во взрослом возрасте. В тесте ПКЛ наоборот пропало наблюдавшееся нами у крыс подросткового возраста межполовое различие. При этом как самцы, так и самки крыс, подвергнутые СРО, делали статистически достоверно меньше входов в открытые рукава лабиринта и проводили в них меньшее время (на уровне тенденции). Подобное поведение также трактуют как повышенный уровнь тревожности животных. Другой интересной особенностью крыс взрослого возраста, выявленной в поведенческих тестах, является наличие разнонаправленных изменений поведенческих показателей, чего мы не наблюдали у крыс подросткового возраста. Так, для пройденной дистанции в тесте ОП есть достоверное взаимодействие факторов «пол» и «СРО», что при учете средних значений позволяет сделать предположение о том, что СРО приводит к уменьшению пройденного расстояния за время теста у самцов, но к увеличению — у самок. Однако post hoc анализ показал лишь различие между группами самцы и самки, подвергнутые СРО, но не для различий между контрольными и подвергнутыми СРО самцами или контрольными и подвергнутыми СРО самками. Сходные, но менее выраженные различия мы наблюдали и для числа выходов в центр в тесте ОП, и для числа переходов между рукавами в тесте ПКЛ. Схожая ситуация разнонаправленных изменений, но с противоположным знаком, обнаружена для числа актов груминга в тесте ОП: у самок СРО приводил к снижению их числа, а у самцов — к увеличению. Однако и в этом случае достоверного взаимодействия факторов не было, а post hoc анализ выявил лишь достоверное отличие по этому показателю групп самцы, подвергнутые СРО, и самки, подвергнутые СРО. В тесте Порсолта мы наблюдали аналогичную картину: время пассивного плавания во второй день теста было увеличено по сравнению с контролем у самцов, но уменьшено у самок. Таким образом, по нескольким поведенческим показателям, отвечающим за уровень тревожности (число выходов в центр в ОП, число актов груминга) и за проявление депрессивно-подобного поведения (время пассивного плавания во второй день теста Порсолта), проявления последствий СРО имели разнонаправленный характер для самцов и самок крыс. По этим изменениям можно предположить, что СРО приводил скорее к повышению уровня тревожности у самок и одновременно к продепрессивно-подобному поведению у самцов. Однако, мощности статистических тестов недостаточно, чтобы с полной уверенности говорить о наличии таких разнонаправленных изменений. Таким образом, в целом за прошедший отчетный период в ходе работы по настоящему гранту получены данные о влиянии СРО на поведение крыс в подростковом и взрослом возрастах. При этом в обоих возрастах обнаружены признакои повышенной тревожности у крыс обоих полов, подвергнутых СРО. У крыс взрослого возраста было обнаружено также различие по проявлению влияния СРО на поведение между самцами и самками. Также в ходе работы по гранту получены данные о динамике изменений микроглии в здоровом мозге у самцов и самок крыс: показано регион-специфичное уменьшение числа клеток микроглии у крыс обоих полов при переходе от ювенильного возраста к подростковому. И наконец, получены данные о влиянии СРО на состояние микроглии в ювенильном и подростковом возрастах крыс. У ювенильных крысят обнаружено наличие последствий СРО, причем оно было специфичным как для исследованных структур, так и для пола животных. У крыс подросткового возраста не было выявлено эффектов СРО, но был обнаружен некоторый половой диморфизм состояния микроглии в гиппокампе. В следующем отчетном периоде планируется получение данных о состоянии микроглии у взрослых крыс, а также получение данных о состоянии астроглии в гиппокампе у самцов и самок всех трех исследуемых возрастов и влиянии СРО на состояние астроглии. Эти данные позволят получить полную картину отставленного эффекта СРО на микро- и астроглию гиппокампа самцов и самок крыс в разные возрастные периоды, необходимую для понимания степени вовлечения глии в этиологию социальнозначимых психоневрологических заболеваний.

 

Публикации

1. А.О. Манолова, В.А. Аниол, Н.В. Гуляева СТРЕСС В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ ПРИВОДИТ К ИЗМЕНЕНИЮ ПРОЦЕССОВ НЕЙРОВОСПАЛЕНИЯ И НЕЙРОГЕНЕЗА ActaNaturae (II ОБЪЕДИНЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ, VI СЪЕЗД ФИЗИОЛОГОВ СНГ - НАУЧНЫЕ ТРУДЫ), спецвыпуск, т.1, стр. 51-52. (год публикации - 2019).

2. Кудряшова И.В., Степаничев М.Ю., Манолова А.О., Гуляева Н.В. Deficit of Long-Term Potentiation Induction, but Not Maintenance, in the Juvenile Hippocampus after Neonatal Proinflammatory Stress Developmental Neuroscience, 5:1-9 (год публикации - 2020).

3. Манолова А.О., Степаничев М.Ю., Аниол В.А., Квичанский А.А., Гуляева Н.В. ВЛИЯНИЕ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ ПРОВОКАЦИИ В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ НА СОСТОЯНИЕ МИКРОГЛИИ В МОЗГЕ КРЫС ЮВЕНИЛЬНОГО ВОЗРАСТА Сборник трудов XVI международного междисциплинарного конгресса ДОСТИЖЕНИЯ МЕЖДИСЦИПЛИНАРНОЙ НЕЙРОНАУКИ В XXI ВЕКЕ, стр. 316-317 (год публикации - 2020).