Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Основная идея проекта заключается в проверке гипотезы о наличии у стромальных клеток тканеспецифичных особенностей самоорганизации и организации других типов клеток, сохраняющей ex vivo и отражающей программу, реализуемую на этапе развития и затем - при обновлении и регенерации ткани во взрослом организме Первый этап реализации проекта включал характеристику культивируемых ex vivo стромальных клеток и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК) человека из различных источников (жировая ткань, кожа, эндометрий). Помимо оценки иммунофенотипа и дифференцировочной способности в адипо- и остеогенном направлениях также была изучен способность к самоорганизации с формированием многослойных, обогащенных белками матрикса, структур в виде клеточных пластов. Также нами была дана структурная характеристика такого феномена как анизотропия, возникающая в клеточных пластах и заключающаяся в формировании очагов высокой и низкой плотности клеток. Наконец, нами была изучена тканеспецифичность организации стромальными клетками эндотелиоцитов при их непосредственном сокультивировании. Данная особенность важна с позиции возможного участия стромальных клеток в процессах регенерации и репарации ткани, в которых капилляро- и ангиогенез играют важную роль как при восстановлении нативной структуры, так и при фиброзировании зоны повреждения. По итогам реализации первого этапа проекта были получены следующие ключевые научные результаты: 1) Фибробласты кожи, МСК эндометрия и жировой ткани имели одинаковый иммунофенотип МСК (CD90/105/73+) и показали себя способными к адипо- и остеогенной индуцированной дифференцировке, что соответствует актуальному определению принадлежности к МСК. 2) Была показана тканеспецифичность дифференцировки МСК эндометрия, в которых менее активно шло накопление липидных капель и депонирование солей кальция. Также по данным FACS для МСК эндометрия характерно присутствие большой (до 80%) доли клеток, несущих маркер CD146, ассоциированный с фенотипом перицитов или эндотелиальных предшественников 3) При длительном культивировании МСК жировой ткани и фибробласты кожи самоорганизуются в гетерогенные многослойные клеточные структуры (пласты), обогащенные белками внеклеточного матрикса с выраженной анизотропией, заключающейся в формировании участков высокой и низкой плотности клеток. При этом МСК эндометрия, обладая таким же иммунофенотипом, как и два упомянутых типа клеток, показали иной паттерн самоорганизации, характерный, скорее, для эпителиальных культур с плотно организованными в монослой клетками. 4) При исследовании характера депонирования белков ВКМ мы установили, что в составе клеточных пластов из МСК жировой ткани высокая плотность клеток сопровождается выраженным депонированием коллагена I и ламинина, но не EDA-фибронектина. 5) В клеточных пластах мы обнаружили единичные, длительно существующие CD31+ продолговатые структуры эндотелиальной морфологии, колокализованные с ламинином и коллагеном IV (белками базальной мембраны кровеносных сосудов.) Такого рода структуры наблюдались нами исключительно в участках с высокой плотностью клеток. 6) Проверка рабочей гипотезы о возможной стабилизации HIF в участках высокой плотности клеток показала отсутствие отличий экспрессии HIF-1а в МСК в составе клеточного пласта, что делает сомнительным участие данного транскрипционного фактора в формировании анизотропии и появлении клеток с эндотелиальным фенотипом 7) В модели сокультивирования стромальных клеток и эндотелия был установлен ряд тканеспецифичных различий стромальных клеток из различных источников, проявляющихся при взаимодействии с клетками эндотелия. Наиболее выраженным про-ангиогенным потенциалом обладали МСК жировой ткани, в определенной степени им уступали фибробласты кожи, а МСК эндометрия показали ранее не описанное поведение, выражающееся в подавлении ангиогенного поведения клеток эндотелия. Механизм данного феномена еще предстоит выяснять, однако нельзя исключать, что высокая продукция ламинина в культуре МСК эндометрия может оказывать тормозящее действие на пролиферацию и организацию HUVEC через специфические рецепторы на их поверхности. Таким образом, на данном этапе в проекте имеется весь необходимый набор материалов и методов, позволяющих исследовать феномен тканеспецифичности организациоцнной функции стромальных клеток и получен ряд интересных результатов, позволяющих сформулировать направления для развития проекта на 2-ом году.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе выполнения второго года проекта нами были завершены все работы, которые предусматривались заявкой, а также решены задачи, которые не удалось закончить в течение первого года из-за пандемии COVID-19. В результате завершения проекта нами были получены результаты, вносящие вклад в развитие фундаментальных представлений о феномене тканеспецифичности МСК. На отчетном этапе была завершена сравнительная характеристика всех 4-х использованных в проекте культур МСК, полученных из жировой ткани (ЖТ), дермы, костного мозга (КМ) или ткани эндометрия, отделяемой при менструальном цикле. Все 4 исследованных культуры обладали фенотипом МСК по данным проточной цитометрии и обладали способностью к дифференцировке в хондроциты, адипоциты и остеобласты. После завершения характеристики МСК КМ нами было показано, что 3 из 4 культур активно формировали клеточные пласты - минимальные тканеинженерные конструкции, представляющие собой многослойную структуру из жизнеспособных МСК, объединенных наработанным ими внеклеточным матриксом. Эти конструкции характеризовались выраженной анизотропией плотности клеток со спонтанно возникающими фокусами компактизации МСК. Кроме этого, депонирование белков соединительной ткани (коллагена I и ЭД-А фибронектина) также характеризовалось анизотропией, которая спонтанно формировалась по мере культивирования и формирования пласта. Единственной культурой, в которой данные свойства практически отсутствовали, оказались эМСК. Практическое использование клеточных пластов, которые могут быть легко и относительно быстро собраны из МСК дермы, жировой ткани и костного мозга в будущем представляется нам связанным с применением в хирургии, лечении ожогов, травм кожи и пролежней. Такого рода тканеинженерные конструкции удобны для трансплантации на протяженные дефекты покровных тканей или слизистых и могут обладать высокой регенераторной компетентностью, стимулируя заживление и уменьшая фиброз в зоне заживления. Нами было показано, что наибольшей степенью тканеспецифичности обладали МСК эндометрия (эМСК). Для них были установлены следующие тканеспецифичные свойства, которые могут быть важны для регенерации и репарации: 1) Формирование компактных сфероидов при хондрогенной дифференцировке, что отражает их внутреннюю программу наработки компонентов соединительной ткани. эМСК, вероятно, не склонны активно участвовать в росте соединительной ткани, что приводило к минимальному объему сфероида, хотя дифференцировка в хондроциты у них не отличалась от МСК ЖТ, дермы или КМ. 2) Отсутствие способности активно организовывать эндотелий (HUVEC) в сосудоподобные структуры при прямом сокультивировании. Наиболее вероятными факторами, определяющими это свойство, являются поверхностные молекулы на эМСК, так как при децеллюляризации и разрушении эМСК наработанный ими матрикс напротив обладал способностью активировать ангиогенные процессы в клетках эндотелия. В поисках ответа на вопрос о факторах, определяющих тканеспецифичные свойства эМСК, мы проанализировали физиологические свойства их секретома и обнаружили, что как и белки матрикса, вырабатываемые ими в ходе культивирования, растворимые факторы в составе секретома обладают проангиогенным действием, сопоставимым с эффектами секретома МСК ЖТ, которые были выбраны в качестве референсной культуры с хорошо известной способностью активировать и поддерживать ангиогенез. Важность исследованных нами свойств МСК из различных источников продиктована тем, что способность клеток стромы самоорганизовываться, формируя соединительную ткань и запускать ее васкуляризацию является важным компонентом ответа на повреждение. Рост на месте разрушенной ткани грануляций и степень их васкуляризации по данным литературы может играть важную роль в определении характера структуры, формируемой на этом месте в исходе ранозаживления. Отсутствие у эМСК выраженной способности нарабатывать компоненты объемной соединительной ткани и их способность стабилизировать васкуляризацию (или уменьшать избыточный рост сосудов) может приводить к замедлению формирования типичных грануляций, являющихся основой рубца. Все это может не только объяснять механизм заживления эндометрия без рубца, но и в будущем позволит идентифицировать потенциальные мишени для борьбы с фиброзом в других тканях (коже, миокарде, паренхиматозных органах). На отчетном этапе опубликовано 4 печатных работы: среди них 3 статьи (Wos/Scopus Q1) и 1 тезисы (Scopus). Также по материалам работы сделано 3 доклада и опубликованы материалы в СМИ: https://www.popmech.ru/science/news-676573-v-menstrualnoy-krovi-nashli-veshchestvo-predotvrashchayushchee-poyavlenie-rubcov/ https://www.mk.ru/science/2021/02/26/menstrualnaya-krov-okazalas-sposobna-lechit-travmy-i-ozhogi.html https://indicator.ru/medicine/v-menstrualnoi-krovi-obnaruzheno-predotvrashayushee-poyavlenie-rubcov-veshestvo-04-03-2021.htm https://nauka.tass.ru/nauka/10788433