Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проект направлен на поиск и оценку эффективности способов коррекции мозговых дисфункций различного генеза с помощью насыщенных жирных кислот со средней длиной цепи (каприловой и каприновой). Проводимая в первый год реализации Проекта работа была направлена на выбор наиболее оптимальных способов и дозы введения триглицеридов среднецепочечных насыщенных жирных кислот (СЦТ), основываясь на максимальных положительных эффектах на показатели памяти при минимальных негативных воздействиях на интегральные и молекулярные показатели функционирования организма и его отдельных систем. Для этого в эксперименте на крысах-самцах Вистар проводили предварительное поведенческое тестирование в тестах «Трёхлучевой лабиринт» для оценки рабочей памяти и «Открытое поле» для оценки ориентировочно-исследовательского поведения, после чего формировали группы животных, получавших СЦТ либо орогастрально в дозах 1, 3 и 6 г/кг в день, либо без ограничений в виде обогащённого данными триглицеридами корма. Контрольные животные получали орогастральные введения воды и лярда, богатого длинноцепочечными жирными кислотами, либо имели неограниченный доступ к корму, обогащённому лярдом. После 3 недель введений поведенческое тестирование повторяли, а также проводили изучение качества пространственного запоминания в тесте «Водный лабиринт Морриса». Для выявления механизмов действия СЦТ ставили целью определение показателей интенсивности энергетического обмена, уровня окислительного стресса и провоспалительных маркеров в крови, интенсивности катаболических и анаболических процессов в печени и интенсивности течения пластических процессов в мозге животных. По причине введения карантинных мер в связи с распространением инфекции COVID-19 не удалось завершить проведение одной серии поведенческого эксперимента, поэтому анализ проведён на неполных выборках и является предварительным. Кроме того, не удалось провести молекулярные анализы материала, полученного от животных основного эксперимента. Тем не менее, были проведены работы по изучению уровня показателей метаболизма в крови и экспрессии генов, вовлечённых в регуляцию нейропластичности, в медиальной префронтальной коре животных из ранее проведённого пилотного исследования, поведенческие данные из которого, свидетельствующие об улучшении показателей памяти животных при введении триглицеридов среднецепочечных жирных кислот, легли в основу заявки на настоящий грант. Проведённый предварительный анализ эффектов продолжительного введения триглицеридов среднецепочечных насыщенных жирных кислот на показатели памяти животных, показал, что при повторном тестировании в тесте «Трёхлучевой лабиринт» и «Открытое поле» наблюдается снижение качества запоминания у животных контрольных групп, в том числе, и получавших лярд. Потребление СЦТ в форме модифицированного корма не приводит к видимым улучшениям показателей памяти ни в одном из использованных тестов. При этом введение фиксированной дозы СЦТ улучшает показатели памяти животных в использованных поведенческих тестах, и это улучшение носит дозозависимый характер. Прямое сравнение контрольной группы и группы, получавшей 6 г/кг СЦТ в день, выявляет эффекты, схожие с таковыми, обнаруженными в пилотном исследовании, где использовалась доза СЦТ 3 г/кг, но введения производили ежедневно после 6-часового периода голодания. Такие результаты позволяют предполагать, что краткое голодание, предшествующее введению СЦТ, способно усиливать положительный эффект СЦТ, вероятно, способствуя большему повышению уровня кетоновых тел в крови. Анализ биохимических показателей в крови животных из пилотного эксперимента показал повышение уровня β-гидроксимасляной кислоты (являющейся одним из кетоновых тел), в крови животных, получавших 3 г/кг СЦТ в день после 6-часового периода изъятия корма. Уровень глюкозы при этом не изменяется относительно контрольной группы, однако обнаруженный более низкий уровень пировиноградной кислоты в крови животных, получавших СЦТ (по сравнению с контролем) позволяет предполагать у таких животных более активное протекание цикла Кребса за счёт использования кетоновых тел, а не пирувата, для синтеза кофермента-А, что позволяет увеличить возможности цикла Кребса за счёт перенаправления пирувата на образование оксалоацетата. Проведённый анализ уровня экспрессии генов субъединиц ионотропных глутаматных NMDA- и AMPA-рецепторов в медиальной префронтальной коре выявил увеличение уровня мРНК GluN2a- и GluN2b-субъединиц и снижение отношения GluN2a/GluN2b мРНК NMDA-рецепторов, а также увеличение уровня экспрессии генов GluA1- и GluA2-субъединиц AMPA-рецепторов в коре животных, получавших СЦТ, по сравнению с контрольными животными. Такие изменения субъединичного состава NMDA-рецепторов и в целом повышении экспрессии генов AMPA-рецепторов в коре характерны при установлении более прочных синаптических связей между нейронами, что может отражать один из молекулярных механизмов положительных эффектов введения СЦТ на показатели памяти и обучения. В целом, проводимое исследование указывает на наличие кумулятивного положительного эффекта СЦТ и прерывистого голодания, в связи с чем для дальнейшего изучения эффектов СЦТ на когнитивную функцию в моделях индуцированных когнитивных нарушений будут использованы орогастральные введения СЦТ либо в дозе 6 г/кг в день, либо в дозе 3 г/кг в день после непродолжительного периода изъятия корма у животных. Оптимальная доза и схема введения будет окончательно определена после завершения тестирования 3-й когорты животных, полного статистического анализа результатов, полученных на более объёмных выборках, и молекулярного анализа как механизмов положительного влияния MCT, так и возможных побочных эффектов на функции различных систем и органов.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проект направлен на поиск и оценку эффективности способов коррекции мозговых дисфункций различного генеза с помощью насыщенных жирных кислот со средней длиной цепи (каприловой и каприновой, СЦЖК). Проведённая во второй год реализации Проекта работа была направлена на оценку эффектов среднецепочечных жирных кислот, вводимых в дозе 6 г/кг/день в течение 28 дней, на показатели ориентировочно-исследовательского поведения, рабочей памяти и пространственного обучения животных при индукции когнитивного дефицита путём однократного введения субсептической дозы липополисахарида. Для этого в эксперименте на крысах-самцах Вистар проводили предварительное поведенческое тестирование в тестах «Трёхлучевой лабиринт» для оценки рабочей памяти и «Открытое поле» для оценки ориентировочно-исследовательского поведения, после чего формировали группы животных, получавших однократно внутрибрюшинную инъекцию физ. раствора либо ЛПС (1 мг/кг) и незамедлительно после инъекции начинавшие получать орогастрально воду (контроль), лярд либо СЦЖК. После 3 недель введений поведенческое тестирование повторяли, а также проводили изучение качества пространственного запоминания в тесте «Водный лабиринт Морриса». Для выявления механизмов действия СЦЖК ставили целью определение показателей интенсивности энергетического обмена, уровня окислительного стресса и провоспалительных маркеров в крови, интенсивности катаболических и анаболических процессов в печени и интенсивности течения пластических процессов в мозге животных. В результате проведённой работы показано снижение пищевой мотивации животных после введения ЛПС по сравнению с животными, получившими введение физ. раствора: у таких животных снижено потребление корма и снижается набор массы тела в течение 1-й недели после инъекции. При введении СЦЖК непосредственно после ЛПС снижение пищевой мотивации выражено в меньшей степени по сравнению с животными, которым орогастрально ввели воду или лярд. Ещё одним свидетельством противовоспалительного эффекта введения СЦЖК служит тот факт, что у животных, получавших ЛПС и не получавших СЦЖК, увеличена относительная масса селезёнки через 28 дней после введения эндотоксина по сравнению с животными, которым вводили физ. раствор. При этом у животных, получавших СЦЖК после введения ЛПС, увеличения относительной массы селезёнки не выявлено. В тестах Открытое поле и Водный лабиринт Морриса наблюдается слабо выраженное улучшение когнитивной функции у животных, получавших СЦЖК. Такие животные проходят меньшую дистанцию при повторном тестировании в Открытом поле, по сравнению крысами, которым после введения ЛПС давали воду либо лярд. В Водном лабиринте Морриса у животных, получавших СЦЖК, отмечается более быстрая динамика обучения поиску скрытой под водой платформы по сравнению с животными других групп, при чём данный эффект виден как после введения физ. раствора, так и после введения ЛПС. Нами не было выявлено различий между группами животных по доле времени, проведённого в целевом секторе в тестовой попытке без платформы. Полученные интегральные и поведенческие данные требуют более детального анализа. Уровни экспрессии генов нейропластичности в структурах мозга и генов липидного и углеводного обмена в печени будут измерены в ближайшее время. С этой целью нами подобраны оригинальные последовательности праймеров и TaqMan-зондов, показывающих высокую эффективность в мультиплексных реакциях. Одной из задач работы была оценка острых и хронических эффектов введения триглицеридов среднецепочечных насыщенных жирных кислот (СЦЖК), вводимых в разных дозах, на показатели энергетического обмена и метаболического здоровья в крови животных. Острые эффекты были оценены в отдельном эксперименте: животные получали 3 г/кг СЦЖК, лярда либо равный объём воды, а затем их умерщвляли через 30 или 120 мин. Кровь собирали для биохимического анализа. Оценивали уровни глюкозы, лактата, пирувата, ацетоацетата, β-гидроксибутирата (БГБ), общего и ЛПВП-холестерина, триглицеридов, малонового диальдегида, активности аспартаттрансаминазы (АСТ) и аланинтрансаминази (АЛТ). Оценку эффектов хронических введений СЦЖК проводили в образцах сыворотки, полученных от животных в ходе первого года реализации Проекта. Хроническое введение ни одного из жиров не влияло на уровни глюкозы, триглицеридов, общего холестерина и холестерина ЛПВП в крови, не изменяло относительные массы органов (сердца, лёгких, тимуса, печени, селезёнки, забрюшинного белого и бурого жира), а также не приводило к изменению уровня серотонина, дофамина и его метаболитов в стриатуме. Введение СЦЖК повышало уровень БГБ в крови в течение 2 ч после введения, в то время как введение лярда и воды не изменяло данный показатель. Введение лярда, но не СЦТ, увеличивало уровень триглицеридов, холестерина и активности АЛТ в крови в течение 2 ч после введения. Таким образом, ежедневное введение СЦЖК в качестве добавки к стандартному корму приводит к лёгкому прерывистому кетозу и улучшению когнитивной функции в различных поведенческих тестах. Ни хроническое, ни острое введения СЦЖК не оказывает неблагоприятного воздействия на маркеры метаболического здоровья. Данную модель на животных можно использовать для изучения механизмов эффектов СЦЖК на когнитивные функции как в норме, так при моделировании мозговых нарушений различного генеза.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проект направлен на поиск и оценку эффективности способов коррекции мозговых дисфункций различного генеза с помощью насыщенных жирных кислот со средней длиной цепи (каприловой и каприновой, СЦЖК) а также на изучение механизмов эффектов употребления СЦЖК. Проведённая в третий год реализации Проекта работа была направлена на оценку эффектов применения триглицеридов СЦЖК на фоне кормления стандартным кормом, вводимых орогастрально в дозе 3 г/кг в день самцам и самкам половозрелых крыс Вистар, на поведение и обучение, а также на интенсивность протекания процессов нейропластичности на фоне развития когнитивного дефицита, индуцированного путём введения умеренно пирогенной дозы липополисахарида (ЛПС) на этапе раннего постнатального онтогенеза (модель перинатальных нарушений у человека, связанных с провоспалительной активацией), а также определение возможных побочных на функции различных органов и систем и выраженность воспалительной реакции. Для этого крысятами в возрасте 2 нед производили внутрибрюшинные введения раствора ЛПС (25 мкг/кг) либо физ.раствора в качестве контроля. В возрасте 2.5 мес проводили предварительное поведенческое тестирование в тестах «Трёхлучевой лабиринт» (ТЛЛ) для оценки рабочей памяти и «Открытое поле» (ОП) для оценки ориентировочно-исследовательского поведения, после чего животных обоих полов разделили на группы, в течение 28 дней получавшие орогастрально лярд (3 г/кг/день) либо триглицериды СЦЖК (3 г/кг/день). После 3 недель введений поведенческое тестирование повторяли, а также проводили изучение качества пространственного запоминания в тесте «Водный лабиринт Морриса» (ВЛМ). На следующий день животных декапитировали, производили измерение массы внутренних органов, а также забирали мозговые структуры и кровь с последующим отбором сыворотки для последующего анализа. Кроме того, в отдельном эксперименте, сыворотку крови и некоторые отделы мозга забирали у самцов и самок половозрелых крыс через 30, 60, 120, 180 минут после однократного орогастрального введения воды (контроль), либо СЦЖК (3 г/кг). В третий год реализации проекта были также проведены биохимические и молекулярно-генетические анализы образцов, полученных от животных-самцов в ходе второго года реализации Проекта, которым ЛПС вводили в субсептической дозе (1 мг/кг), а СЦКЖ и лярд вводили в концентрации 6 г/кг в день в течение 28 дней, и которые подвергались поведенческому тестированию по описанному выше протоколу. Кроме того, в образцах, забранных у животных из пилотного эксперимента, получавших 2 мл/кг СЦЖК, был проанализирован микробиотный состав кишечника. В результате проведённой работы выявлено снижение потребления корма и набора массы тела после введения ЛПС в субсептической дозе (1 мг/кг). Введение ЛПС достоверно повысило относительную массу селезёнки, при этом хроническое введение СЦЖК снижало массу селезёнки до нормальных значений, свидетельствуя о наличии противовоспалительных свойств введения СЦЖК. Животные, получавшие СЦЖК после введения ЛПС, показали снижение локомоторной активности при повторном тестировании в ОП по сравнению с животными, получавшими лярд или воду, свидетельствуя о лучшем запоминании окружающей обстановки. В тесте ВЛМ животные СЦЖК группы быстрее обучались находить скрытую под водой платформу, свидетельствуя об улучшении пространственного обучения при употреблении СЦЖК. При использовании ЛПС в умеренно пирогенной дозе (25 мкг/кг), у крыс-самцов, но не самок, наблюдался более быстрый набор массы тела по сравнению с контролем при употреблении лярда, но не СЦЖК (3 г/кг). В ходе предварительного тестирования в ОП были выявлены межполовые различия. Так, только у самок ЛПС вызывал снижение общей пройденной дистанции, и только у самцов – более быстрое угашение локомоторной активности. При повторном тестировании на фоне введение жиров, введение СЦЖК самцам приводило к исчезновению межгрупповых различий по показателям внутрисессионного угашения локомоторной активности, тогда как у самок, напротив, введение СЦЖК приводило к увеличению показателей угашения. В ВЛМ было выявлено взаимодействия факторов ЛПС x MCT при отсутствии межполовых различий. Животные, получавшие в раннем возрасте физ.р-р, а в зрелом СЦЖК, демонстрировали повышение дистанции в целевом квадранте относительно контрольной группы, получавшей лярд. Примечательно и неожиданно, введение ЛПС в раннем возрасте также приводило к повышению качества пространственного запоминания по сравнению с контрольной группой, при этом введение СЦЖК не обладало аддитивным эффектом. При анализе эффектов хронического применения СЦЖК после ранних постнатальных инъекций ЛПС было выявлено дифференциальное действие на уровни многих цитокинов и хемокинов (интерферон-гамма, ИЛ-1бета, ИЛ-10, ИЛ-18, ФНО, IP 10, RANTES, MCP-1, EGF, фракталкин) и не выявлено различий по уровню ИЛ 2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-12p70, ИЛ-17, MIP-1a, MIP-2, VEGF, LIX, лептина. После однократного введения СЦЖК (3 г/кг) наблюдалось схожая динамика изменения уровня ряда цитокинов (особенно ИЛ-1бета, ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-4) – резкое падение уровня через 30-60 мин после введения с последующим постепенным увеличением до исходных или ниже исходных значений. При анализе динамики изменения показателей энергетического обмена и метаболического здоровья после однократного введения ожидаемо было выявлено повышение уровня бета-гидроксибутирата (БГБ) в крови при введении СЦЖК (3 г/кг), но не лярда. Этот показатель достигал пиковых значений через 120 минут после введения СЦЖК на фоне употребления стандартного корма и снижался через 180 минут после введения, свидетельствуя о развитии интервального кетоза. Введение лярда увеличивало уровень триглицеридов, концентрацию общего холестерина и ЛПВП-холестерина, а также активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) в крови, в то время как СЦЖК – нет. Введение СЦЖК имело легкий гипогликемический эффект через 30 минут после введения. Анализ тех же показателей после 28 дней хронического введения не выявил их изменений через 18–22 часа после последнего введения. Для изучения влияния введения СЦЖК на экспрессию генов нейропластичности в мозге был проведён анализ стабильности экспрессии референсных генов-кандидатов в медальной префронтальной коре (мПФК) и дорзальном гиппокампе (ДГ) и вентральном гиппокампе (ВГ). Гены Hprt1 и B2m были наиболее стабильны во всех структурах и были использованы в качестве референсных. В мПФК и ВГ не выявлено различий между группами в относительной экспрессии всех изученных нами генов нейропластичности (Mmp9, Timp1, Bdnf, Gdnf, Fgf2, Gsk3b, EAAT2, GluN1, GluN2a, GluN2b, GluA1, GluA2 и др). В ДГ введение ЛПС в раннем возрасте повышало уровни экспрессии генов GluN1, GluN2a, отношения GluN2a/GluN2b (NMDA), GluA2 (AMPA), Glut1, а введение СЦЖК снижало их уровень до контрольных значений. При однократном введении СЦЖК наблюдалось изменение уровня экспрессии генов Mmp9, Fgf2, Glut3, GluN1 и GluN2a, но не GluN2b. При этом наблюдалась достоверная обратная корреляционная зависимость между общим уровнем кетоновых тел в крови и относительным уровнем мРНК генов субъединиц NMDA-рецепторов GluN1 и GluN2a в гиппокампе взрослых самцов. Анализ кишечной микробиоты в кале животных, получавших СЦЖК (2 мл/кг) на протяжении 4 нед выявил повышенное содержание Bacteroidota и сниженное содержание Patescibacteria по сравнению с контрольными животными. Таким образом, ежедневное введение СЦЖК в качестве добавки к стандартному корму приводит к лёгкому прерывистому кетозу и улучшению когнитивной функции в различных поведенческих тестах. Ни хроническое, ни острое введения СЦЖК не оказывает неблагоприятного воздействия на маркеры метаболического здоровья. Применение СЦЖК существенно влияет на уровни про- и противовоспалительных цитокинов и хемокинов, экспрессию генов нейропластичности, глюкозного транспорта и глутаматергической нейротрансмиссии, а также на состав кишечной микробиоты. Данную модель можно использовать для дальнейшего изучения механизмов эффектов СЦЖК на когнитивные функции как в норме, так при моделировании мозговых нарушений различного генеза.