Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Первый год выполнения проекта был посвящен в большей степени проведению экспериментальных исследований (на крысах) методом скоростной спектральной мультимодальной оптической когерентной томографии (ММ ОКТ) для in vivo оценки изменения интрамуральной микроциркуляции (ангиографический режим ОКТ или ОКА) и микроструктуры тканей (кросс-поляризационный режим ОКТ или КП ОКТ) при артериальной (окклюзия брыжеечной артерии) и артериовенозной (ущемление кишки с брыжеечными артериями и венами) острой ишемии тонкой кишки с верификацией процессов флуоресцентной микроскопией и гистологическим исследованием. Исследование проведено со стороны серозной оболочки. Выбранный транссерозный доступ, в отличие от эндоскопического трансмукозного, позволяет с максимальной скоростью прецизионно исследовать любой сегмент тонкой кишки на всем ее протяжении, что в наибольшей степени соответствует задачам абдоминальной хирургии. При этом интрамуральные сосуды, расположенные под серозной оболочкой и в подслизистом слое стенки кишки (их состояние является определяющим в развитии ишемии) легко доступны для изучения методом ММ ОКТ. Модели острой ишемии крыс использованы для понимания общих закономерностей изменений структуры слоев кишечной стенки и ее микроциркуляции при их in vivo визуализации методом ММ ОКТ для последующей экстраполяции в клинику. В соответствии с разработанным протоколом проведена 1-ая серия экспериментальных исследований (на крысах, n=35) методом ММ ОКТ для оценки интрамуральной микроциркуляции и микроструктуры тканей в норме (n=12), при артериовенозной (ущемление кишки с брыжеечными артериями и венами) (n=11) и артериальной (окклюзия брыжеечной артерии) (n=12) острой ишемии тонкой кишки с верификацией процессов флуоресцентной микроскопией и гистологическим исследованием. Объем полученных данных при острой артериовенозной/артериальной ишемии тонкой кишки составил 455/536 ММ ОКТ изображений, 32/36 флуоресцентных изображения, 220/240 гистологических препаратов. Результаты ММ ОКТ исследования кишечной стенки в норме представлены в статье (WoS), опубликованной по результатам исследований: Ryabkov M.G., et al. Trans-serosal multimodal optical coherence tomography for visualization of microstructure and blood circulation of the small intestine wall. Sovremennye tehnologii v medicine. 2020. 12(2): 56-64. doi: 10.17691/stm2020.12.2.07. http://stm-journal.ru/en/numbers/2020/2/1630/pdf. Было показано, что: 1) кишечная стенка визуализируется на всю толщину, до просвета кишки; 2) серозно-мышечный и слизисто-подслизистый слои хорошо дифференцируются на структурных КП ОКТ изображениях, что возможно благодаря наличию множества функционирующих кровеносных сосудов и специфическому кросс-рассеянию от соединительной ткани подслизистого слоя; 3) на ОКА изображениях наблюдаются многочисленные кровеносные сосуды разных диаметров, включая крупные парные сосуды (артерии и вены) и отходящие от них микрососуды, равномерно распределенные по изображению. Результаты ММ ОКТ исследования кишечной стенки при острой артериовенозной ишемии представлены в статьях (WoS), опубликованных по результатам исследований в 2020 году: Ryabkov M.G., et al. Trans-serosal multimodal optical coherence tomography for visualization of microstructure and blood circulation of the small intestine wall. Sovremennye tehnologii v medicine. 2020. 12(2): 56-64. doi: 10.17691/stm2020.12.2.07. http://stm-journal.ru/en/numbers/2020/2/1630/pdf.; Kiseleva E.B., et al. Observations of the bowel wall in the case of acute ischemia: optical coherence tomography, FLIM macro-imaging and histological analysis data. Proc SPIE. 11232, 112320M. doi: 10.1117/12.2550667. https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/11232/112320M/Observations-of-the-bowel-wall-in-the-case-of-acute/10.1117/12.2550667.short?SSO=1. После ущемления петли кишки КП ОКТ картина слоев ее стенки динамично изменялась: в области ворсинок пропадал характерный вертикальный рисунок, что вызвано как их прогрессирующим некрозом, так и исчезновением теней от кровеносных сосудов, что соответствовало уменьшению глубины визуализации ткани в кросс-канале, в просвете кишки визуализировались пузырьки газа, со временем начинала визуализироваться противоположная сторона кишечной стенки. Результаты соответствуют данным, полученным при гистологическом исследовании. Прекращение кровоснабжения сразу после ущемления кишки привело к заметному уменьшению числа визуализируемых кровеносных сосудов на ОКА изображениях, фон становился почти черным. Через 90 минут на всех ОКА изображениях ущемленной петли кишки наблюдались единичные обрывочные крупные артерии, признаки кровотока в подавляющем объеме микрососудистой сети отсутствовали. Это соответствовало картине, наблюдаемой в разные временные точки методом флуоресцентной микроскопии и подтверждено гистологическим исследованием. Результаты ММ ОКТ исследования кишечной стенки при острой мезентериальной ишемии показали, что по сравнению с кишкой до ишемии, структурные 2D и 3D КП ОКТ изображения с гистологически подтвержденным некрозом слизистого и подслизистого слоев характеризовались истончением стенки на кросс-изображении, наличием неровных, неоднородных структурных элементов в нижнем слое, прилежащем к просвету кишки, а в секторах с гистологически подтвержденным трансмуральным некрозом – ярким гетерогенным сигналом по всей толщине кишечной стенки. Визуальное сопоставление ОКА изображений в ишемизированной и интактной кишке показало, что окклюзия мезентериальной артерии в 40% сопровождалась уменьшением «разветвленности» сосудистой сети в сравнении с интактной кишкой, «обрывом» и выпадением части мелких кровеносных сосудов, что гистологически подтверждено спаданием стенок сосудов или наличием тромбов в кровеносных сосудах подслизистого и слизистого слоев с некрозом большинства ворсинок, в сосудах серозно-мышечного слоя серьезных нарушений микроциркуляции выявлено не было. При этом на ОКА изображениях кишки с трансмуральным некрозом или тотальным некрозом слизистой оболочки (60% секторов ишемизированной кишки) яркость фона, создаваемая густой сетью капилляров, значительно уменьшалась и была схожа с ОКА картиной при артериовенозной ишемии, однако крупные (диаметром порядка 90-200 мкм) парные сосуды сохранялись, что свидетельствует о сохранении функции притока и оттока крови. Помимо качественного анализа данных ММ ОКТ, сопоставления структурных изображений с гистологическими препаратами, ОКА изображений с флуоресцентной микроскопией, проведена их количественная оценка. На структурных КП ОКТ изображениях определены различия в общей толщине кишечной стенки и толщине слизисто-подслизистого и серозно-мышечного слоев для разных моделей ишемии в сравнении с интактной кишкой. По ОКА изображениям показаны статистически значимые различия в общей длине функционирующих кровеносных сосудов стенки кишки в норме и при интестинальной ишемии. Таким образом, анализ структуры кишечной стенки крыс методом ММ ОКТ в норме и при разных вариантах острой ишемии кишки подтвердил возможность визуализации и квантификации изменений в структуре слоев и состоянии функционирующих артериальных и венозных сосудов с локализацией на различной глубине: от относительно крупных субсерозных сосудов до артериол и венул ворсинок слизистой оболочки. В первый год выполнения проекта с помощью ММ ОКТ проведены пилотные клинические исследования (6 пациентов без ишемии кишки и 6 пациентов с острой интестинальной ишемией кишки), важные для понимания возможностей метода в клинических условиях, обозначен круг технических задач, решение которых в последующие годы реализации проекта позволит использовать метод с максимальной пользой. В общей сложности получено 170 трехмерных ОКТ изображений, проанализировано более 1200 двухмерных КП ОКТ изображений и 72 ангиограммы, 68 гистологических срезов тощей и подвздошной кишки. Дополнительно, при проведении ММ ОКТ исследования у пациентов с острой интестинальной ишемией удалось сравнить границы нежизнеспособной стенки кишки, определяемые традиционным (визаульно-пальпаторным) способом и ММ ОКТ методом. В итоге границы нежизнеспособных тканей и резекции кишки, определенные по данным ММ ОКТ, были уже, чем диагностированные традиционным способом. Методика и результаты интраоперационного исследования описаны в статье (WoS): Kiseleva E.B., et al. Intraoperative use of optical coherence angiography in ischemic bowel disease: a pilot study. Proc. SPIE 11457, 114570B. doi:10.1117/12.2559615. https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/11457/114570B/Intraoperative-use-of-optical-coherence-angiography-in-ischemic-bowel-disease/10.1117/12.2559615.short. В следующий год выполнения проекта будет продолжаться накопление клинических ММ ОКТ данных, будет проведен более подробный и детальный анализ как структурных, так и ангиоргафических ОКТ изображений. В рамках задачи разработки усовершенствованных способов постобработки ММ ОКТ данных для визуализации кровеносных сосудов с целью максимальной компенсации движений при работе в условиях операционной был разработан и апробирован алгоритм, позволяющий существенно снизить влияние движений, что выражается в уменьшении характерных полос на ангиографических изображениях. На основе проведенных экспериментальных исследований на животных и пилотных исследований на пациентах было установлено, что для безопасной и комфортной работы в условиях операционной и последующего эффективного анализа данных требуется усиление герметизации и повышение термостойкости рабочей части ММ ОКТ зонда для возможности его стерилизации и отказа от стерильных чехлов по нормам СанПиН 2.1.3.2630-10; целесообразна разработка способов атравматичной фиксации кишки относительно датчика; требуется доработка программного обеспечения: как программы записи ММ ОКТ данных, так и их просмотра (автоматическое сохранение двухмерных изображений по заданному алгоритму). В ходе реализации первого года выполнения проекта была проведена разработка методики регистрации эндогенной флуоресценции с временным разрешением методом FLIM-макроимиджинга в ткани кишки экспериментальных животных. Были выбраны следующие параметры для регистрации флуоресценции эндогенных флуорофоров в ткани кишки: возбуждение флуоресценции в однофотонном режиме на длине волны 375 нм и регистрация в диапазоне 435-485 нм, с мощностью 12 мВт; получены первые результаты по разнице метаболизма ишемизированных и нормальных тканей тонкой кишки, что носит новаторский характер. Показано, что изменение флуоресцентных параметров НАД(Ф)Н со стороны серозной оболочки кишки может быть использовано как критерий ответа внутренних слоев на ишемию, когда развивается некроз ворсинок и подслизистого слоя, но в поверхностных (серозном и мышечном слоях) некрозы не обнаруживаются. Результаты этой части исследований представлены в статье (WoS): Kiseleva E.B., et al. Observations of the bowel wall in the case of acute ischemia: optical coherence tomography, FLIM macro-imaging and histological analysis data. Proc SPIE. 11232, 112320M. doi: 10.1117/12.2550667. https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/11232/112320M/Observations-of-the-bowel-wall-in-the-case-of-acute/10.1117/12.2550667.short?SSO=1, опубликованной в рамках Проекта. Необходимо отметить, что транссерозное ММ ОКТ исследование кишечной стенки экспериментальных животных и пациентов также как и FLIM-макроимиджинг проведено впервые в мире.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Второй год выполнения проекта был посвящен как экспериментальным исследованиям (на крысах, кроликах и минипигах) с использованием метода скоростной спектральной мультимодальной оптической когерентной томографии (ММ ОКТ), так и анализу возможной экстраполяции полученных в экспериментах данных на пациентов с острой интестинальной артериальной и артериовенозной ишемией с учетом физиологических различий объектов исследования. Экспериментальная часть включала транссерозное применение ММ ОКТ: 1) для объективизации состояния микроциркуляции и структуры тонкой кишки при моделировании острой интестинальной ишемии с последующей резекцией нежизнеспособных участков и применением разных тактик хирургической обработки культи тонкой кишки: стомированием, обструктивной резекцией и шунтированием (объектом исследования служили крысы). На основании анализа комплекса данных: визуальных, о состоянии микроциркуляции и микроструктуры кишечной стенки in vivo, а также ex vivo (гистологическое исследование), можно утверждать, что хирургическая техника обработки культи кишки после ее экстренной резекции по поводу острой интестинальной ишемии существенно меняет состояние тканей в период до наложения отсроченного анастомоза. Наименее выраженные и наиболее сбалансированные изменения происходят в приводящем и отводящем отделах кишки в случае ее шунтирования по сравнению со стомированием и обструктивной резекцией. Однако для рекомендации шунтирования кишки в качестве хирургической техники для преимущественного применения необходима разработка надежных, безопасных и эффективных инструментов шунтирования. 2) для объективизации состояния микроциркуляции при сравнительной оценке эффективности традиционных и оригинальных способов восстановления перфузии в ишемизированной тонкой кишке (объектом исследования служили кролики). Традиционный способ регионарной терапии основан на внутриартериальной катетеризации магистральной артерии и инфузии антикоагулянтных и спазмолитических препаратов. Несмотря на распространенность в клинической практике, данный способ обладает рядом существенных недостатков и ограничений. За оригинальный способ восстановления перфузии в ишемизированной тонкой кишке пациентов мы взяли ранее разработанный участниками научного коллектива Проекта способ катетеризации артерии-аркады при острой интестинальной ишемии (патент РФ на изобретение № 2635486 от 13.11.2017), позволяющий осуществлять подведение спазмолитического раствора непосредственно к месту поврежденной кишки, увеличивая регионарную концентрацию лекарственных препаратов и, одновременно, объемную скорость кровотока в артериях, кровоснабжающих ишемизированные участки кишки. Результаты оптической когерентной ангиографии показали, что введение инфузионной среды и спазмолитического препарата в брыжеечную артерию-аркаду после моделирования острой артериальной ишемии сопровождалось существенным изменением/улучшением картины микроциркуляторного русла и количественных показателей оптической когерентной ангиографии (возвращением к норме) по сравнению с традиционным способом проведения терапии, где микроциркуляция и показатели остались на уровне ишемии тканей и по сравнению с состоянием без терапии, где микроциркуляция и показатели существенно снизились. Данные о состоянии интестинальной микроциркуляции, полученные in vivo, были подтверждены гистологическим исследованием. В результате данного этапа работ были разработаны критерии оптической когерентной ангиографии для оценки эффективности восстановления кровообращения в кишке при острой интестинальной ишемии, которые были успешно апробированы на пациентах. В текущем году были продолжены пилотные клинические ММ ОКТ исследования на пациентах с острой мезентериальной ишемией. На полученных структурных и ангиографических изображениях были подробно описаны признаки, характерные для нормальной, ишемизированной и некротизированной тонкой кишки человека. Учитывая большую толщину кишечной стенки человека по сравнению с экспериментальными животными (крысами, кроликами), ММ ОКТ критерии оценки жизнеспособности кишки, сформулированные на основе экспериментальных данных, были скорректированы. Было показано, что на структурных ОКТ изображениях кишечной стенки человека удается лучше наблюдать изменения в серозной и мышечной оболочках (межмышечный отек, изменения в лимфатических сосудах). В результате, предложена методика оценки жизнеспособности кишки методом ММ ОКТ, которая заключается в получении и анализе ММ ОКТ данных последовательно от зон визуально нежизнеспособных тканей к периферии и определения границ, где данные оптической когерентной ангиографии и кросс-поляризационной ОКТ свидетельствуют о нормальной микроциркуляции и ненарушенной структуре кишечной стенки. Дополнительно, проведен эксперимент на нормальной тонкой кишке минипигов, в ходе которого выявлены особенности визуализации крупных кровеносных сосудов с относительно высокими скоростями движения крови (200-500 мм/сек и выше) используемым в данной работе методом оптической когерентной ангиографии. Это позволит сделать шаг в направлении усовершенствования алгоритма для адекватной визуализации сеток кровеносных сосудов крупных лабораторных животных (минипигов) и пациентов в реальном времени, поскольку до настоящего момента система оптической когерентной ангиографии была «заточена» на выявление преимущественно микрокапиллярного звена с малыми скоростями движения крови (порядка 1-100 мм/сек). Достигнуты результаты в численном анализе структурных ММ ОКТ данных, полученных в экспериментальных исследованиях. Построение цветокодированных карт на основе расчета оптических коэффициентов (коэффициентов затухания) позволило создать задел для задачи быстрой и объективной оценки структурной составляющей тканей при возникновении ишемии, запланированной на 3 год выполнения Проекта. Также, в ходе реализации второго года выполнения Проекта было проведено in vivo исследование эндогенной флуоресценции с временным разрешением тканей тонкой кишки экспериментальных животных (крыс) в норме и при ишемии с целью оценки жизнеспособности ткани. Эндогенную флуоресценцию возбуждали с помощью пикосекундного лазера на длине волны 375 нм, детектировали в диапазоне 435-485 нм. В данном диапазоне детектируется преимущественно метаболический кофактор никотинамидадениндинуклеотид - НАД(Ф)Н. Проведен расчет двух параметров: средне-взвешенное время жизни флуоресценции tm и вклад короткой компоненты а1. Выявлены различия в метаболизме ишемизированных и нормальных тканей, а также получены первые результаты по влиянию хирургической техники (стомирование, обструктивная резекция и шунтирование) на метаболизм культи тонкой кишки при отсроченном наложении анастомоза, что носит новаторский характер. Основные результаты Проекта за 2020-2021 годы были представлены и обсуждены исполнителями Проекта на 1-ой международной и 5-ти российских конференциях (всего 6 докладов). По результатам Проекта за отчетный год опубликовано и принято к печати 2 статьи в изданиях, индексируемых в WoS, одна из них в журнале Q1; 1 - РИНЦ (было запланировано 3 статьи WoS или Scopus).

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Основной целью третьего года выполнения проекта была разработка способа временной атравматичной фиксации кишечной стенки к торцу ОКТ зонда для получения качественных сеток кровеносных сосудов. В противном случае множественные артефакты движения обесценивали функцию ангиографии (ОКА) - важной модальности мультимодальной (ММ) ОКТ системы при исследовании целевых объектов: крупных лабораторных животных и пациентов. В итоге, было сконструировано устройство и придуман способ его использования с ОКТ системой (вакуумный прижим) что в 9,5 раз повысило качество получаемых ОКА изображений и существенно сократило общее время проведения ММ ОКТ исследования (готовится заявка на изобретение). Несомненным преимуществом изобретения стала возможность проведения непрерывного мониторинга одной и той же области ткани, наблюдения за процессами угнетения/восстановления кровообращения при ишемии, терапии и прочих воздействиях, приводящих к нарушению исходного состояния интрамурального кровотока. Применение вакуумной фиксации тканей позволило получить ряд данных, которые можно считать новаторскими и уникальными в сфере применения ОКТ/ОКА для такого сложного объекта как кишечник. В частности, получены серии ОКА изображений (на тонкой кишке минипигов), демонстрирующие динамику снижения кровоснабжения участка ишемизированной кишки, а затем частичного восстановления кровотока за счет компенсации из сосудов-коллатералей смежных (не подвергнутых ишемии) участков тканей. Мониторинг одного и того же участка осуществлялся в течение 12-30 минут. В другой серии экспериментов (на тонкой кишке крыс) мониторинг за состоянием кровеносных сосудов методом ОКА проведен в течение 3ч после моделировании острой мезентериальной ишемии. Было установлено, что в деваскуляризированном секторе кишки с сохраненным коллатеральным кровотоком в течение первого часа ишемии значения показателя, отражающего средний диаметр сосудов, сократились на 9,2 % по сравнению с исходными значениями, что, вероятно, является отражением увеличения тонуса сосудистой стенки. Однако к 180 минуте наблюдения тенденция изменилась: площадь перфузируемого русла восстановилась, вместе с тем сократилась суммарная длина сосудистой сети, индекс диаметра сосудов превысил исходный уровень на 12,9 % (p=0,045). Расширен спектр состояний, приводящих к изменению интрамуральной микроциркуляции тонкой кишки: в экспериментах на минипигах с использованием разработанного вакуумного прижима методом ОКА показана динамика изменения микроциркуляции тонкой кишки на фоне применения адреналина и при нарушениях общей гемодинамики организма - при острой кровопотере вследствие травмы печени. Продолжены клинические ММ ОКТ исследования у пациентов, в том числе проведена апробация разработанного вакуумного устройства. Структурные и ангиографические данные получены во время операции по резекции нежизнеспособных тканей кишки, а затем с поверхности и изнутри кишечной стомы на разные сроки в послеоперационном периоде. Показано, что проведение ММ ОКТ исследования во время операции по резекции нежизнеспособных участков кишки помогает более точно определить границы жизнеспособных тканей одновременно по критериям сохраненной структуры и кровотока. Послеоперационный мониторинг стомированной кишки может быть полезным для принятия решения об оптимальных сроках повторной реконструктивной операции или о корректировке состава получаемой после операции терапии. В текущем году достигнуты положительные результаты в количественной обработке структурных ОКТ изображений, полученных как в экспериментальных, так и в клинических условиях. Построение цветокодированных карт на основе расчета коэффициента затухания позволило объективировать и ускорить послойную оценку тканей: верифицировать локализацию и распространенность некроза по слоям кишечной стенки, отличать отек и воспалительную реакцию ткани в состоянии ишемии. Проведено ex vivo исследование эндогенной флуоресценции с временным разрешением тканей тонкой кишки пациентов c мезентериальным тромбозом, Болезнью Крона и аденомами слепой кишки с целью апробации метода макро-FLIM для оценки метаболизма тканей кишки. Рассчитаны параметры времени жизни флуоресценции. Подобные исследования проведены для серозной и слизистой оболочек кишки впервые. Сверх поставленных задач, проведена адаптация лимфангиографии на основе ОКТ к новому для этого метода объекту – кишечной стенке лабораторных животных (кроликов). Проведенные пилотные экспериментальные исследования по одновременной визуализации кровеносных и лимфатических сосудов кишки при ее симпатический денервации выявили взаимозависимые изменения в функционировании обоих систем (и кровеносной, и лимфатической). Установлено, что в остром периоде после симпатической деиннервации кишки происходит сокращение количества визуализируемых кровеносных сосудов за счет выпадения артериол и капилляров из кровеносного русла, соответственно, изменяется (уменьшается) и количество (объемная плотность) визуализируемых лимфатических сосудов, поскольку их наполнение напрямую зависит от количества межтканевой жидкости. Мы считаем направление лимфангиографии на основе ОКТ перспективным для выяснения патогенеза хронического воспаления и мальабсорбции, возникающих у пациентов с нарушенной иннервацией кишечника. Заявленные на 3 год реализации Проекта задачи выполнены полностью и перевыполнены. Основные результаты Проекта за 2021-2022 годы были представлены и обсуждены исполнителями Проекта на 4-х международных и 1-ой российской конференции (всего 6 докладов). По результатам Проекта за отчетный год опубликовано и принято к печати 4 статьи: 3 - WoS и 1 - Scopus (было запланировано 4 статьи WoS или Scopus) и глава в книге «Мультимодальная оптическая когерентная томография в клинической медицине» (издательство ФИЗМАТЛИТ).