Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Для реализации настоящего проекта разработаны и утверждены «Этическим комитетом при ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» протокол исследования, информированное согласие (ИС), медицинская карта участников исследования. Разработаны 11-ть стандартных операционных процедур (СОПов), необходимых для сбора, подготовки и хранения биоматериала. Проведена экспериментальная верификация разработанных СОПов и оценка качества заполнения медицинской документации. Используя разработанные СОПы, собрано 4189 аликвот биоматериала от 158 женщин с анамнестическими и клинико-лабораторными данными. Создан электронный каталог коллекции. На хранение в объект инфраструктуры (РЦ «Центр Биобанк» Научного парка СПБГУ) передано 2664 аликвот биоматериала (цельная кровь, плазма, сыворотка, моча). Собраны образцы плаценты от 5-ти пациенток. На длительное хранение в объект инфраструктуры передано 30 образцов. Подобраны оптимальные условия для выделения РНК, включая микроРНК, из образцов крови с РНК-стабилизирующим буфером, образцов плаценты и лейкоцитов. Установлено, что наиболее предпочтительным является использование реагента “Trizol для первичной обработки биоматериала. Подобраны оптимальные условия для выделения РНК для жидких образцов (цельная кровь, плазма и сыворотка крови). Выделение малых РНК из плазмы и сыворотки крови подтверждено методом секвенирования следующего поколения. Апробирован метод детекции протеомных маркеров в образцах мочи на примере выявления амилоидных агрегатов у беременных с преэклампсией с помощью CRD-теста. Проведена оптимизация данного метода и создан его ускоренный вариант. Показана перспективность использования экспресс-теста для выявления беременных с риском преэклампсией.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Продолжен сбор образцов для исследования: за 2020 год собрано 3000 образцов от 72 пациенток, всего за время проекта собрано 7189 образцов от 208 пациенток с анамнестическими и клинико-лабораторными данными. На длительное хранение в объект инфраструктуры (РЦ «Центр Биобанк» Научного парка СПБГУ) передано 2826 образцов. Проведена апробация методов исследования микроРНК с помощью полногеномного секвенирования на объекте инфраструктуры с помощью секвенаторов следующего поколения Hiseq2500 и Miseq. Полученные данные позволили определить общее количество прочтений для секвенирования для каждого типа биообразцов, необходимое для достоверной обработки данных. Для лейкоцитов, цельной крови беременной, плаценты, пуповинной крови - 4-6 млн прочтений, сыворотки и плазмы крови беременной - 10-12 млн прочтений, мочи - более 18 млн прочтений. Разработаны девять стандартных операционных процедур (СОПов), необходимых для выделения малых РНК из собранного биоматериала, подготовки библиотек кДНК-копий малых РНК, оценки качества полученных РНК и библиотек, секвенирования библиотек с помощью высокопроизводительного секвенирования, а также для анализа образцов мочи на основе связывания белков с красителем Конго красным (экспресс-CRD-теста). Проведена экспериментальная верификация разработанных СОПов. В результате анализа публикаций и, используя методы биоинформатики, отобраны 55 микроРНК, потенциально являющихся маркерами наиболее распространенных осложнений беременности (преждевременных родов, гестационного сахарного диабета и преэклампсии). Оценена возможность детекции этих микроРНК в собранном биоматериале путем секвенирования библиотек кДНК-копий малых РНК, выделенных из плазмы и сыворотки крови 8 женщин без патологий беременности на разных сроках гестации. Все отобранные микроРНК были обнаружены в плазме и сыворотке крови женщин без осложнений беременности. Показана неэффективность использования CRD-теста для детекции амилоидных агрегатов в сыворотке крови беременных женщин с преэклампсией. Все окрашенные Конго красным образцы сыворотки крови беременных с преэклампсией и группы сравнения не сохраняли окраску после отмывки мембраны. Вместе с тем показана возможность детекции амилоидных агрегатов в сыворотке крови беременных с помощью красителя тиофлавина Т. С помощью экспресс-CRD-теста протестированы образцы мочи от 139 женщин, родоразрешившихся к августу 2020 года. Ни у одной из женщин не была диагностирована преэклампсия во время беременности, и ни один из образцов, не продемонстрировал аффинность к Конго красному (показатель CRR менее 15%).

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Продолжен сбор образцов для исследования: за 2021 год собрано 4302 образцов от 113 пациенток, всего за время проекта собрано 11491 образцов от 321 пациенток с анамнестическими и клинико-лабораторными данными. Получены данные об особенностях течения настоящей беременности, включая частоту преэклампсии (ПЭ) (10,4%), гестационного сахарного диабета (ГСД) (13,0%) и преждевременных родов (ПР) (14,1%). Разработаны критерии включения и исключения для формирования групп пациентов с ГСД, ПЭ, ПР и группы сравнения. Установлено, что в плазме крови беременных без акушерско-гинекологической патологии от первого и от второго к третьему триместру увеличивается содержание микроРНК miR-7853-5p, от первого к третьему триместру также увеличивается содержание микроРНК miR-200c-3p. В то время, как в сыворотке крови от первого к третьему триместру увеличивается содержание 5 микроРНК (miR-203a-5p, miR-495-3p, miR-4435, miR-340-5p, miR-4417) и уменьшается содержание 5 других микроРНК (miR-1266-5p, miR-4494, miR-134-3p, miR-5008-5p, miR-6756-5). Установлено, что в сыворотке значительно больше представлены 15 микроРНК, и меньше представлена 21 микроРНК по сравнению с плазмой. Результаты секвенирования подтверждены с помощью метода ПЦР в реальном времени на примере 3 микроРНК (miR-221-3p, miR-126-3p, miR-495-3p). Показано, что в плазме крови беременных без акушерско-гинекологической патологии от первого триместра к третьему увеличивается содержание 7 пиРНК (piR 000765, piR 020326, piR 019825, piR 020497, piR 015026, piR 001312, piR 017716), от первого ко второму триместру уменьшается содержание одной пиРНК (piR 019825), в то время как от второго триместра к третьему содержание данной пиРНК растет, увеличивается содержание и других РНК (piR 000765, piR 020326, piR 020497, piR 001312, piR 015026). Обнаружено, что в сыворотке значительно больше представлены 8 пиРНК (piR 000765, piR 020326, piR 019825, piR 015026, piR 020497, piR 001312, piR 017716, piR 004153) и только одна молекула - piR 018849 больше представлена в плазме по сравнению с сывороткой. Из общей выборки сформированы три группы беременных с ГСД (n=10), с ПЭ (n=10) и группа сравнения (n=10). С помощью технологии высокопроизводительного секвенирования определены 49 микроРНК, содержание которых повышено, и 22 микроРНК, содержание которых снижено в первом триместре в плазме крови пациенток, у которых позже сформировался ГСД или ПЭ. Также выявлены 6 микроРНК содержание, которых повышено и 18 микроРНК, содержание которых снижено во втором триместре в плазме при беременности, осложненной ПЭ или ГСД. Выполнена реконструкция молекулярно-генетических путей, ассоциированных с развитием ПЭ, ГСД и ПР, используя ресурсы биоинформатики, собственные данные и, исходя из данных литературы. Результаты исследования образцов мочи беременных, собранных в первом, втором и третьем триместре, демонстрируют, что CRD-тест позволяет диагностировать ПЭ на 19-20 неделе беременности.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Продолжен сбор образцов для исследования: за 2022 год собрано 2679 образцов от 87 пациенток, всего за время проекта собрано 16565 образцов от 355 пациенток с анамнестическими и клинико-лабораторными данными. Обновлены данные об особенностях течения настоящей беременности, включая частоту преэклампсии (ПЭ) (8,7%), гестационного сахарного диабета (ГСД) (10,4%) и спонтанных преждевременных родов (ПР) (7,9%). Увеличены группы пациентов с ГСД (до n=15), ПЭ (до n=15) и группа сравнения (до n=11) для исследования, сформирована группа с риском ПР (n=13) в соответствии с ранее разработанными критериями. Методом высокопроизводительного секвенирования получены данные о содержании микроРНК в плазме крови в первом и втором триместрах беременности у женщин с ГСД, ПЭ и высоким риском ПР. Не выявлено различий по профилю микроРНК между образцами группы сравнения и пациенток, у которых позже сформировался ГСД (pскорр>0,05) или ПЭ (pскорр>0,05). Также не обнаружены отличия между образцами, собранными во втором триместре, для группы сравнения и пациенток, у которых выявлен высокий риск ПР (FDR>0,05). Однако найдены 3 микроРНК, содержание которых повышено (miR-122-5p, miR-34a-5p, miR-34c-5p), и 12 микроРНК, содержание которых снижено (miR-487b-3p, miR-493-3p, miR-432-5p, miR-323b-3p, miR-369-3p, miR-134-5p, miR-431-5p, miR-485-5p, miR-382-5p, miR-369-5p, miR-485-3p, miR-127-3p) в первом триместре в плазме крови пациенток, у которых позже был выявлен высокий риск ПР (pскорр≤0,05). Результаты секвенирования верифицированы методом ПЦР в реальном времени на примере микроРНК miR-34a-5p. Показано, что содержание этой микроРНК повышено в первом триместре в плазме крови женщин, у которых позднее был диагностирован высокий риск ПР (p<0,05), что согласуется с данными секвенирования. Полученные результаты позволяют предположить, что идентифицированные микроРНК могут быть использованы в качестве биомаркеров ПР. Методом масс-спектрометрии получены данные о протеомных профилях в образцах мочи больных ПЭ и беременных женщин без гестационных осложнений. В процессе сравнения полных протеомных профилей не выявлено общих белков в составе агрегатов, которые бы не обнаруживались в образцах мочи. Определены 2 белка (ютероглобин и карбоновая ангидраза 1), которые входят в состав всех образцов мочи от больных ПЭ, но которые не обнаружены в моче женщин без осложнений беременности. Обнаружено, что в составе всех образцов группы сравнения встречается изоформа 2 белка синдекан 4, которая отсутствует в образцах ПЭ. В образцах мочи больных ПЭ обнаружены уникальные специфичные пептиды, которые являются фрагментами 6 белков. При сравнении образцов агрегатов выявлен общий специфичный пептид EYTDASFTNR в группе ПЭ, который является фрагментом белка церулоплазмина и может быть одним из факторов, участвующих в развитии ПЭ через его участие в формирование агрегатов. Для окончательных выводов, необходимы большие выборки и расширенный протеомный анализ. В результате анализа клинических и молекулярно-генетических данных определены параметры, которые могут быть использованы для ранней диагностики ПР и ПЭ. Для ПР к ним относятся содержание 15 микроРНК, ассоциированных с высоким риском ПР, в первом триместре в плазме крови, наличие привычного невынашивания беременности в анамнезе, формирование ретрохориальной отслойки плаценты, для ПЭ - присутствие амилоидных агрегатов в моче, наличие гипертонической болезни и сахарного диабета. На основе полученных данных предложены алгоритмы для ранней оценки риска ПР и ПЭ. Подготовлен прототип тест-системы скрининга ПЭ на основе модифицированного CRD-теста.