Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Фундаментальная задача проекта состоит в создании и изучении нового поколения регуляторов репродуктивной и тиреоидной систем на основе низкомолекулярных соединений, которые могут в дальнейшем применяться для лечения и профилактики заболеваний репродуктивной и тиреоидной систем, а также во вспомогательных репродуктивных технологиях для повышения фертильности и в качестве индукторов овуляции. В рамках проекта ведется разработка тиенопиримидиновых производных и других гетероциклических соединений с активностью аллостерических агонистов и антагонистов рецепторов лютеинизирующего гормона (ЛГ) и тиреотропного гормона (ТТГ) и изучение молекулярных механизмов и мишеней их действия в норме и при патологии. В течение первого года выполнения проекта были получены следующие важнейшие результаты. 1. Синтезированы, охарактеризованы и изучены три новых тиено[2,3-d]пиримидиновых производных (TP31, TP37, TP48), а также два гетероциклических соединения пиридо[3,4-d]пиримидин PP17 и пиримидо[4,5,6-de][1,6]нафтиридин PP10, регулирующих активность рецепторов ЛГ и ТТГ. Для синтеза TP31, TP37, TP48 использовали реакцию ацилирования 5-амино-4-(3-аминофенил)-N-трет-бутил-2-(метилсульфанил)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамида, их общего предшественника, что обеспечивало включение в целевую молекулу варьируемого заместителя. Для синтеза PP17 осуществляли замещение атома хлора в молекуле этилового эфира 7-амино-2-метилсульфанил-4-хлорпиридо[4,3-d]-пиримидин-8-карбоновой кислоты циклическим амином, что является новым подходом для синтеза таких производных. Для синтеза PP10, единственного представителя пери-конденсированных гетероциклов, использовали редкую циклизацию через окислительное нуклеофильное замещение в ароматическом ядре. Все соединения показали специфическую биологическую активность in vitro, как регуляторы аденилатциклазной системы в тестикулярных или тироидальных мембранах, и, за исключением PP10, были активны в условиях in vivo, влияя на продукцию стероидных и тиреоидных гормонов. 2. Впервые продемонстрированы черты сходства ранних стероидогенных эффектов аллостерического агониста рецептора ЛГ, ранее разработанного нами тиено-[2,3-d]пиримидина TP03, и хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) при их однократном введении самцам крыс. Установлено, что TP03 через 30 мин после введения самцам крыс стимулирует стероидогенез, и его стероидогенный эффект на начальном этапе сходен с таковым ХГЧ. Так TP03 и ХГЧ уже через 30 мин повышали в семенниках уровни тестостерона (Т) и его прекурсоров – 17-гидроксипрогестерона и андростендиона, и снижали уровень прегненолона, что указывает на его расходование для синтеза прогестерона и других предшественников Т. Экспрессия генов, кодирующих стероидогенные белки, через 30 мин не менялась, в то время как через 3 ч TP03 и ХГЧ значимо повышали экспрессию генов, кодирующих белок StAR и цитохром Р450-17alpha, ключевые регуляторы тестикулярного стероидогенеза. В группе, обработанной TP03, экспрессия гена, кодирующего дегидрогеназу HSD17beta, была достоверно ниже, чем в группе с обработкой ХГЧ. Поскольку продукция Т, индуцированная ХГЧ через 5 ч заметно снижалась, то стероидогенный эффект ХГЧ в этот временной промежуток был сопоставим с таковым TP03, несмотря на то, что через 1 и 3 ч он его превосходил. Эти изменения стероидогенного эффекта ХГЧ и TP03 предшествовали значимым различиям, которые выявлялись позднее, при длительной обработке крыс и были обусловлены различиями механизмов их действия на клетки Лейдига. 3. Установлено, что при длительном введении самцам крыс тиено-[2,3-d]пиримидинов, агонистов рецептора ЛГ, их стимулирующий эффект на тестикулярный стероидогенез превосходит таковой ХГЧ, в то время как при однократном введении соотношение их эффективностей обратное. В экспериментах in vitro показано, что ХГЧ и тиено-[2,3-d]пиримидины стимулируют активность аденилатциклазы (АЦ) в тестикулярных мембранах крыс, порядок их эффективности был следующим: ХГЧ>TP03>TP04=TP37. В экспериментах in vivo при однократном введении самцам крыс стероидогенный эффект ХГЧ (50 и 100 МЕ/крысу) существенно превосходил таковой TP03 и TP04 (15–50 мг/кг), в то время как при трехдневном введении он им по стероидогенному эффекту уступал. Основной причиной этого являются различия в паттерне регуляции экспрессии стероидогенных генов в семенниках крыс при длительной обработке ХГЧ и тиено-[2,3-d]пиримидинами. Ослабление эффекта ХГЧ обусловлено снижением экспрессии генов рецептора ЛГ и ключевого фермента стероидогенеза цитохрома Р450-17alpha, в то время как TP03 и TP04 на нее не влияли. Соединение TP37, сопоставимое по активности с TP03 и TP04 in vitro, при введении крысам не только быстро теряло способность стимулировать стероидогенез, но при трехдневном введении (50 мг/кг) снижало продукцию Т и подавляло интратестикулярную экспрессию цитохрома Р450-17alpha, что может быть обусловлено его деградацией, генерирующей антагонисты рецептора ЛГ. Полученные данные свидетельствуют об эффективности длительного применения TP03 и TP04 для стимуляции тестикулярного стероидогенеза, не вызывающего снижения чувствительности семенников к гонадотропинам. При этом необходимо учитывать возможность деградации тиено-[2,3-d]пиримидинов, способной привести к генерации ингибиторов стероидогенеза. 4. Разработаны низкомолекулярные антагонисты рецептора ЛГ на основе тиено-[2,3-d]пиримидина (TP31), пиридо[3,4-d]пиримидина (PP17) и пиримидо[4,5,6-de][1,6]нафтиридина (PP10), два из которых (TP31 и PP17) характеризовались активностью при введении самцам крыс в условиях in vivo. В экспериментах in vitro TP31, PP10 и PP17 (100 мкМ) ослабляли стимулирующие АЦ эффекты ХГЧ и TP03, причем TP31 ослаблял их в значительной степени. В экспериментах in vivo при интратестикулярном введении самцам крыс TP31, PP10 и PP17 (10 мг/кг) снижали базовый уровень Т в крови, в наибольшей степени в случае TP31, а их ингибирующий эффект нарастал во времени, и через 5 ч во всех группах уровень Т был достоверно снижен. Внутрибрюшинное введение TP31 и PP17 (45 мг/кг) снижало уровни Т через 3 и 5 ч, в то время как PP10 был при этом способе введения мало эффективным. Введение TP31 и PP17 за 20 мин до инъекции ХГЧ снижало стимулированный ХГЧ уровень Т, причем TP31 был более эффективным ингибитором. Таким образом, впервые установлено, что TP31 и PP17, производные тиено-[2,3-d]пиримидина и пиридо[3,4-d]пиримидина, функционируют как антагонисты рецептора ЛГ, препятствуя его стимуляции ХГЧ и аллостерическим агонистом TP03. По антагонистическому действию TP31 превосходит PP17, что обусловлено его более эффективным связыванием с аллостерическим сайтом рецептора, в основе чего лежит большее соответствие тиено-[2,3-d]пиримидина пространственной структуре этого сайта. В сравнении с TP31 и PP17, соединение PP10, производное пиримидо[4,5,6-de][1,6]нафтиридина, характеризовалось низкой антагонистической активностью в отношении рецептора ЛГ в условиях in vivo. Cоединение TP31 может быть использовано как прототип для создания препаратов для подавления стероидогенной функции при лечении гормонозависимых опухолей и для предотвращения синдрома гиперстимуляции яичников. 5. Предварительная обработка крыс тиено-[2,3-d]пиримидином TP03, аллостерическим агонистом рецептора ЛГ, усиливает стероидогенный эффект гонадотропинов с ЛГ-активностью. Впервые показано, что предварительная обработка крыс TP03 усиливает стимулирующий продукцию Т эффект ХГЧ (50 МЕ/крысу), что обусловлено аддитивностью эффектов ХГЧ и TP03 при активации ими рецептора ЛГ и потенцирующим действием TP03 на сигнальные пути гонадотропинов. Одним из возможных механизмов этого является функционирование TP03, как низкомолекулярного шаперона для рецептора ЛГ. После обработки TP03 паттерн ХГЧ-индуцированной регуляции экспрессии генов стероидогенеза в семенниках крыс избирательно меняется, затрагивая в основном экспрессию 3β-дегидрогеназы. Полученные данные важны для разработки подходов, направленных на усиление стероидогенного эффекта гонадотропинов с ЛГ-активностью, указывая на перспективность совместного применения ХГЧ и аллостерических агонистов рецептора ЛГ на основе тиено-[2,3-d]пиримидинов. 6. Тиено-[2,3-d]пиримидин TP03 восстанавливает андрогенный дефицит у самцов крыс с сахарным диабетом 1-го типа (СД1), обеспечивая при этом сохранение чувствительности семенников к эндогенному ЛГ. В условиях среднетяжелого СД1, как показано в исследованиях in vitro, чувствительность тестикулярной аденилатциклазной системы к ХГЧ, TP03 и гуаниновым нуклеотидам ослабляется, что обусловлено в основном снижением активности G-белков. У самцов крыс с СД1 развивался дефицит Т и ослаблялись стероидогенные эффекты однократно вводимых ХГЧ и TP03. Однако, при 5-дневной обработке СД1-крыс отмечали значительное снижение стероидогенного эффекта ХГЧ, в то время как эффект TP03 менялся слабо и в конце эксперимента был сопоставим с таковым ХГЧ. В отличие от ХГЧ, TP03 не снижал экспрессию гена рецептора ЛГ, предотвращая ослабление чувствительности семенников к гонадотропинам. Таким образом, TP03 является эффективным стимулятором синтеза Т при среднетяжелом СД1 с характерным для него сильно выраженным андрогенным дефицитом, и его длительное введение может иметь преимущества в сравнении с длительной терапией ХГЧ, как активатором стероидогенеза. 7. Разработан тиено-[2,3-d]пиримидин TP48 с активностью инверсионного агониста/антагониста рецептора ТТГ, снижающий продукцию тиреоидных гормонов при введении его самцам крыс. Новый тиено-[2,3-d]пиримидин (TP48) снижал стимулирующий АЦ эффект ТТГ в мембранах, выделенных из щитовидной железы крыс, а при в/б введении самцам крыс в дозе 40 мг/кг через 3.5 ч достоверно снижал базовые уровни свободного тироксина и трийодтиронина и стимулированные интраназально вводимым тиролиберином уровни свободного и общего тироксина. Все это указывает на присущие TP48 свойства аллостерического инверсионного агониста/антагониста рецептора ТТГ, который снижает продукцию тиреоидных гормонов при введении самцам крыс, в том числе при ее стимуляции тиролиберином. Одним из механизмов этого является TP48-индуцированное ингибирование экспрессии ряда генов в щитовидной железе крыс, ответственных за синтез тиреоидных гормонов, таких как Tg, Dio2 и Nis, кодирующих соответственно тиреоглобулин, дейодиназу 2-го типа и кодирующего Na+/I—-котранспортер, а также снижение экспрессии гена TshR для рецептора ТТГ в тироцитах. Полученные данные указывают на возможность создания на основе тиено-[2,3-d]пиримидинов эффективных ингибиторов функций щитовидной железы, активных в условиях in vivo. 8. Осуществлен молекулярный докинг в аллостерический сайт рецептора ЛГ тиенопиримидиновых производных с активностью агонистов, разработанных в рамках проекта Анализ компонентов скоринг-функции для серии разработанных нами тиенопиримидиновых производных показал, что критически важным для сайт-специфичного взаимодействия с рецептором ЛГ в их структуре является сочетание гидрофобных контактов с умеренным уровнем кулоновских взаимодействий. Лидирующие структуры обладают наилучшими показателями стабильности лиганд-белкового комплекса, что демонстрирует энергетическую выгодность их взаимодействия с рецептором ЛГ. Они образуют сеть гидрофобных контактов, преимущественно с остатками Ile415/513/585 и Val418/447/606/609, а также с остатками Pro516 и Lys605. Таким образом, отличительной чертой структур ТР03, TP04, ТР22 и ТР23 является усиление роли гидрофобного взаимодействия в процессе комплексообразования с рецептором. Важным является сохранение и профиль электростатических контактов, определяющих специфическую ориентацию тиенопиримидиновых производных в аллостерическом сайте рецептора ЛГ. По результатам первого года исследований в соответствии с планом были опубликованы (приняты к печати) 5 экспериментальных статей в журналах, рецензируемых в международных базах данных WoS и(или) Scopus, опубликована монография и глава в иностранном издании.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Основные научные результаты, полученные в 2020 г. Фундаментальная задача проекта состоит в создании и изучении нового поколения регуляторов репродуктивной и тиреоидной систем на основе низкомолекулярных соединений, которые могут в дальнейшем применяться для лечения и профилактики заболеваний репродуктивной и тиреоидной систем, а также во вспомогательных репродуктивных технологиях для повышения фертильности и в качестве индукторов овуляции. В рамках проекта ведется разработка тиенопиримидиновых производных и других гетероциклических соединений с активностью аллостерических агонистов и антагонистов рецепторов лютеинизирующего гормона (ЛГ) и тиреотропного гормона (ТТГ) и изучение молекулярных механизмов и мишеней их действия в норме, при старении и патологии. В течение второго года выполнения проекта были получены следующие важнейшие результаты. 1. Разработан модифицированный метод молекулярного докинга, который адаптирован для поиска и предсказания специфической биологической активности разрабатываемых авторами проекта новых тиенопиримидиновых производных (ТП) с активностью аллостерических агонистов рецепторов лютеинизирующего (ЛГР) и тиреотропного гормонов (ТТГР) (Bakhtyukov et al., 2020, Int J Mol Sci). Модели ЛГР и ТТГР крысы создавали с использованием методов гомологичного моделирования и молекулярной динамики (МД). Трехмерная структура трансмембранных доменов рецепторов была построена на основе 3D-модели родопсина быка, а их вторичная структура в соответствии с моделями ЛГР и ТТГР человека. Стабильность структуры рецепторов изучали методом МД с помощью программы Desmond, все операции МД обрабатывали в силовом поле OPLS3e. Изучаемые ТП были получены с использованием модуля LigPrep из Schrodinger Suite 2020-2. Для каждого соединения было создано 2000 стыковочных структур, 20 из них отбирали для анализа. Для теоретического анализа были выбраны такие параметры, как GlideScore, Emodel и Lipo/Coulomb/H-bond. Анализ взаимодействий Org 43553 (шаблонного ТП) и синтезированных нами соединений (TP01–TP04, TP21–TP23) с аллостерическим сайтом ЛГР показал сопоставимые значения GlideScore и Emodel (табл. 1, рис. 4). Наиболее значимым параметром являлась интенсивность гидрофобного контакта (Lipo), менее значимыми – кулоновские взаимодействия (Coulomb) и водородные связи (H-Bond) (табл. 1, рис. 4). Значения Lipo для исследуемых ТП имели отчетливо выраженные отрицательные значения, что указывает на предпочтение для них липофильных взаимодействий между лигандом и аллостерическим сайтом рецептора (табл. 1). В случае ТТГР, Org43553 и ТП, стыкованные с его аллостерическим сайтом, показали снижение аффинности, что выражалось в повышении значений GlideScore/Emodel и имели сниженное приращение отрицательного значения Lipo, что указывает на потерю сайт-специфичных гидрофобных контактов с трансмембранным сайтом связывания лиганда. Сделан вывод, что TP03, TP04 и другие синтезированные нами ТП потенциально селективны по отношению к аллостерическому сайту ЛГР и способны с низкой вероятностью взаимодействовать с аллостерическим сайтом ТТГР, что подтверждается нашими данными по изучению специфической активности разработанных ТП. 2. Впервые проведено сравнительное исследование стимулирующего синтез тестостерона (Т) эффекта хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) и соединения TP4/2 с активностью аллостерического агониста ЛГР, разработанного авторами проекта, in vitro и при однократном и пятидневном введении самцам крыс, изучены динамика и величина этого эффекта и его специфичность при введении ХГЧ и TP4/2 молодым, стареющим и диабетическим крысам (Bakhtyukov et al., 2020, Int J Mol Sci). Стероидогенные эффекты ЛГР-агонистов в клетках Лейдига осуществляются через аденилатциклазную систему и цАМФ-зависимые каскады. TP4/2 и ХГЧ дозозависимо стимулировали активность аденилатциклазы (АЦ) в тестикулярных мембранах крыс, и эти эффекты ослаблялись у стареющих (18-месячных) крыс и животных с сахарным диабетом 1 типа (СД1) (рис. 12). При СД1 снижались максимальные АЦ эффекты TP4/2 и ХГЧ и повышались EC50 для них. Соединение TP4/2 не влияло на базальную и стимулированную ТТГ активность АЦ в мембранах, выделенных из щитовидной железы крыс, что указывает на специфичность его действия на ЛГ-чувствительную АЦ систему в клетках Лейдига (табл. 12). Однократная обработка молодых крыс ХГЧ повышала уровень тестостерона (Т) в крови в большей степени, чем TP4/2. В группе Young+hCG максимальный эффект ХГЧ достигался через 3 ч, затем снижался. В группе Young+TP он развивался медленнее и не снижался даже через 5 ч (рис. 14). При старении и СД1 базальный уровень Т и стимулирующие его эффекты TP4/2 и ХГЧ снижались по сравнению с группами Young+TP и Young+hCG (рис. 14). Соотношение стероидогенных эффектов TP4/2 и ХГЧ менялось в различные периоды времени. У молодых и диабетических крыс через 1 ч после введения TP4/2 повышение уровня Т было в 4 и 5 раз ниже, чем при введении ХГЧ, тогда как у стареющих крыс эффекты TP4/2 и ХГЧ почти не различались (рис. 14). Через 3 ч во всех группах стимулирующий эффект TP4/2 составил 33–41% от такового ХГЧ. Через 5 ч в группах Young+TP, Aging+TP и Diab+TP эффекты TP4/2 составили 54–64% от таковых ХГЧ (рис. 14). При пятидневном введени TP4/2 молодым крысам, его стимулирующий эффект на уровни Т был неизменным. Эффект ХГЧ в 1–2-е сутки был максимальным, в 2.5 раза превышая таковой TP4/2. На 3–5-й дни он уменьшился и становился неотличим от эффекта TP4/2 (рис. 15A). Значения AUC0–5 для эффектов TP4/2 и ХГЧ были выше, чем в необработанных группах, и AUC0–5 для ХГЧ был на 58% выше, чем для TP4/2 (рис. 15D). Соотношение эффектов TP4/2 и ХГЧ увеличивалось с 0.36 в 1-й день до 0.80 в 5-й день, что свидетельствует об уменьшении различий в эффективности препаратов при пятитидневном введении (рис. 15Е). У стареющих и диабетических крыс стероидогенные эффекты TP4/2 и ХГЧ при пятидневном введении были снижены (рис. 15D). На 3–5-й дни они были сходными (рис. 15B,C). При пятидневном введении стареющим и диабетическим крысам соотношение эффектов TP4/2 и ХГЧ на уровни T увеличивалось (рис. 15E). TP4/2 (20 мг/кг) не влиял на базальные и тиролиберин-стимулированные уровни тиреоидных гормонов (табл. 14), что исключает его воздействие на функции щитовидной железы и указывает на специфичность к ЛГР. Вывод. TP4/2 дозозависимо стимулировал ЛГ-чувствительную АЦ в тестикулярных мембранах крыс и повышал продукцию Т при в/б введении самцам крыс, причем его эффекты были ЛГР-специфичными. На ранних стадиях введения (через 1–3 ч после инъекции и в 1-й день обработки) стероидогенный эффект TP4/2 уступал таковому ХГЧ, но через 5 ч после инъекции и на 3–5-й дни обработки эффекты TP4/2 и ХГЧ становились сопоставимыми. При старении и СД1 стероидогенный эффект ХГЧ в значительной степени ослабевал, в то время как соответствующий эффект TP4/2 менялся мало, что указывает на перспективы применения TP4/2 и его аналогов для коррекции нарушенного тестикулярного стероидогенеза. 3. Исследованы, в сравнении с ХГЧ, эффекты длительной обработки самцов крыс с помощью TP4/2 на стероидогенез и экспрессию генов стероидогенеза в семенниках молодых, стареющих и диабетических крыс (Bakhtyukov et al., 2020, Int J Mol Sci). Пятидневное введение TP4/2 и ХГЧ повышало тестикулярное содержание 17-OH-прогестерона, андростендиона и Т у молодых крыс, причем если содержание 17-OH-прогестерона в группе Young + ХГЧ было выше, чем в Young + TP, то содержание Т и других его прекурсоров не различалось (табл. 15). При старении и СД1 эффекты ХГЧ и TP4/2 на содержание 17-OH-прогестерона и Т были снижены, а у диабетических крыс были снижены эффекты ХГЧ и TP4/2 на содержание андростендиона. Содержание тестикулярного Т в группах Diab+hCG и Diab+TP было сходным, а различие в содержании тестикулярного T между Aging + hCG и Aging + TP было небольшим и коррелировало с уровнями T в крови (табл. 15). Экспрессия генов холестерин-транспортирующего белка StAR и стероидогенных ферментов – цитохромов P450scc (Cyp11a) и P450 17A1 (Cyp17a) и 3β-OH-стероиддегидрогеназ Hsd3b и Hsd17b при старении и СД1 не менялась (рис. 16). У молодых крыс пятидневная обработка TP4/2 увеличивала экспрессию Star и Cyp17a, ХГЧ увеличивал экспрессию Star, Cyp11a и Cyp17a. У стареющих и диабетических крыс эффекты TP4/2 и ХГЧ на экспрессию Star и Cyp17a были снижены (рис. 16). Эффект ХГЧ на экспрессию Cyp11a снижался при СД1. Экспрессия гена Hsd3b была повышена в группах Aging+hCG, Diab+TP и Diab+hCG, экспрессия гена Hsd17b повышалась в группе Diab+TP. У молодых крыс TP4/2 и ХГЧ не влияли на экспрессию дегидрогеназ (рис. 16). Вывод. Показана положительная корреляция между TP4/2-индуцированным повышением уровня Т в крови и продукции Т и его прекурсоров в семенниках молодых, стареющих и диабетических крыс. В отличие от ХГЧ, TP4/2 более мягко стимулировал экспрессию генов стероидогенных белков, особенно при старении и СД1, что указывает на важный вклад повышения активности этих белков, а не усиления их экспрессии, в стероидогенный эффект TP4/2. Таким образом, в основе стероидогенного эффекта TP4/2 лежит повышение активности белков, ответственных за синтеза Т. 4. Впервые изучено влияние TP4/2 и TP22 на сперматогенез и функциональное состояние семенных канальцев, в том числе у стареющих и диабетических крыс (Bakhtyukov et al., 2020, Int J Mol Sci; Деркач и др., 2020, БЭБМ) При пятидневном введении молодым крысам TP4/2 увеличивал количество пахитеновых сперматоцитов, тогда как ХГЧ повышал количество сперматогониев и сперматоцитов (табл. 16, рис. 17). У стареющих и диабетических крыс были уменьшены толщина семенного эпителия и количество сперматогониев и сперматоцитов (табл. 16, рис. 18, 19). TP4/2 и ХГЧ восстанавливали число половых клеток до их контрольных значений, причем в группе Diab+TP количество сперматогониев и сперматоцитов было выше, чем у молодых крыс (табл. 16). При старении и СД1, TP4/2 и ХГЧ восстанавливали толщину семенного эпителия и нормализовали морфологию семенных канальцев (табл. 16). При пятидневной обработке молодых крыс с помощью TP22, другим синтезированном нами ТП, также было выявлено повышение числа пахитеновых сперматоцитов (табл. 24, рис. 26). Обработка стареющих и диабетических крыс TP22 частично восстанавливала толщину герминативного эпителия и повышала число сперматогониев и пахитеновых сперматоцитов (табл. 24, рис. 26). По восстанавливающему эффекту у стареющих крыс TP22 уступал ХГЧ, но при СД1, он более эффективно восстанавливал число делящихся сперматогенных клеток в сравнении с ХГЧ. Вывод. У молодых крыс ТП повышают сперматогенную активность, не оказывая существенного влияния на морфологию семенных канальцев. При старении и СД1 ТП восстанавливают толщину герминативного эпителия, повышают число сперматогониев и пахитеновых сперматоцитов, и их эффект наиболее выражен при СД1. Полученные данные являются первым свидетельством сперматогенного эффекта аллостерических ЛГР-агонистов в норме, при старении и СД1. 5. Впервые изучен эффект ТП (в сравнении с ХГЧ и Org43553) на экспрессию и распределение ЛГР в семенниках крыс, в том числе у стареющих животных, и показано, что в отличие от ХГЧ, ТП не вызывают снижения количества ЛГР и, тем самым, предотвращают развитие ЛГ-резистентности семенников (Бахтюков и др., 2020, ЖЭБФ). Стероидогенный эффект однократно вводимого ХГЧ (50 МЕ/крысу) превосходил таковые TP03, TP04, Org43553 (15 мг/кг, в/б) и TP21 (25 мг/кг, в/б) (табл. 6). При трехдневном введении эффекты ТП и ХГЧ не различались, за исключением сниженного эффекта TP21 (табл. 6). Через 3 ч после однократного введения ТП экспрессия гена ЛГР (Lhr) не менялась, в то время как в случае ХГЧ она снижалась в 2 раза. На третьи сутки отмечали подавление экспрессии гена Lhr при обработке ХГЧ и ее повышение при обработке TP03. При введении TP04, TP21 и Org43553 экспрессия ЛГР менялась слабо. Прослеживается взаимосвязь между стероидогенным эффектом и экспрессией гена Lhr (табл. 6). Далее изучали влияние TP03 на экспрессию ЛГР в культуре клеток Лейдига и в семенниках молодых и стареющих крыс при их обработке TP03. При воздействии на клетки Лейдига стероидогенный эффект ХГЧ развивался быстрее, чем TP03, и через 30 мин прирост уровня Т был в 3 раза выше, но в дальнейшем эффект ХГЧ нарастал медленнее (рис. 5А). При обработке ТР03 и ХГЧ отмечали снижение экспрессии гена Lhr, которое было более выражено для ХГЧ. Через 1 и 3 ч экспрессия Lhr в клетках Лейдига при обработке ТР03 была выше, чем для ХГЧ (рис. 5Б). При 10-тидневной обработке крыс стероидогенный эффект TP03 менялся слабо (рис. 6А), но экспрессия гена Lhr увеличивалась на 3-й день и в дальнейшем была повышена (рис. 6Б). Стероидогенный эффект ХГЧ на 3-й день снижался и на 7-й и 10-й дни частично восстанавливался (рис. 6А). Экспрессия гена Lhr, достигнув минимума на 3-й день, постепенно восстанавливалась и на 10-й день не отличалась от контроля (рис. 6Б). Несмотря на снижение уровня Т у 18-тимесячных крыс, стероидогенные эффекты ТР03 и ХГЧ у них сохранялись (рис. 7). В семенниках стареющих крыс не отмечалось, как и у молодых, повышения экспрессии гена Lhr при обработке ТР03, в то время как при обработке ХГЧ его экспрессия существенно снижалась (рис. 7). Иммуногистохимический анализ показал, что ТР03 увеличивал количество ЛГР-иммунопозитивного материала в семенных канальцах молодых крыс, в то время как ХГЧ на него не влиял (рис. 8A-C, рис. 9). У стареющих крыс число ЛГР не менялось, а обработка ТР03 и ХГЧ снижала количество ЛГР-иммунопозитивного материала, в наибольшей степени в случае ХГЧ (рис. 8D-F, рис. 9). Вывод. При изучении влияния ТП на продукцию Т и экспрессию гена Lhr была показана положительная корреляция между величиной стероидогенного эффекта и уровнем экспрессии ЛГР в семенниках, в то время как в случае ХГЧ отмечали снижение экспрессии гена Lhr уже через 3 ч после введения ХГЧ. При длительной (10 дней) обработке крыс TP03 отмечали сохранение стероидогенного эффекта и некоторое повышение экспрессии гена Lhr. В семенниках стареющих крыс повышения экспрессии ЛГР под действием TP03 не было выявлено, а количество ЛГР-иммунопозитивного материала в семенниках немного снижалось, в то время как при обработке стареющих животных с помощью ХГЧ отмечали значительное снижение как экспрессии гена Lhr, так и количества ЛГР-иммунопозитивного материала. При действии на клетки Лейдига, TP03 снижал экспрессию гена Lhr, но его ингибирующий эффект был выражен в меньшей степени, чем таковой ХГЧ, несмотря на то, что ТР03 и ХГЧ были сходны по способности стимулировать продукцию Т. 6. Разработан новый нейтральный антагонист рецептора ТТГ на основе тиено[2,3-d]тиенопиримидина, который снижал стимулированные тиролиберином уровни тиреоидных гормонов при в/б введении самцам крыс, не влияя на базальные их уровни, а также снижал стимулирующий эффект ТТГ (in vitro, тироциты FRTL-5) и тиролиберина (in vivo, в/б введение) на экспрессию генов, кодирующих белки, вовлеченные в продукцию тиреоидных гормонов С помощью молекулярного докинга и на основе данных о специфической активности ранее разработанного нами соединения TP48 был синтезирован и изучен новый аллостерический антагонист рецептора ТТГ – TPY1, 5-амино-N-(трет-бутил)-4-(4-(3-метоксипроп-1-ин-1-ил)фенил)-2-(метиотио)тиено-[2,3-d] пиримидин-6-карбоксамид (рис. 20, 22). TPY1 дозозависимо снижал ТТГ-стимулированную активность АЦ в мембранах щитовидной железы крыс, не влияя на базальную и форсколин-стимулированную активность АЦ (табл. 17). В культуре тироцитов FRTL-5 TPY1 предотвращал ТТГ-индуцированную стимуляцию экспрессии генов TPO и Tg, кодирующих тиреоидогеные белки – тиреопероксидазу и тиреоглобулин (табл. 19). При в/б введении самцам крыс TPY1 (40 мг/кг) не влиял на базальный уровень тиреоидных гормонов, но ингибировал повышение уровня тироксина и трийодтиронина, вызванное тиролиберином (и/н, 300 мкг/крысу), а также ослаблял тиролиберин-стимулированную экспрессию генов тиреоидогенных белков (TPO, Tg, Nis) в щитовидной железе (табл. 20, 21). Как в ТТГ-стимулированных тироцитах, так и в щитовидной железе тиролиберин-обработанных крыс, TPY1 вызывал еще большее снижение экспрессии гена рецептора ТТГ. Механизмы этого феномена до конца не ясны, но потенцирование снижения экспрессии рецептора ТТГ может вносить значимый вклад в ингибирующий эффект TPY1 на продукцию тиреоидных гормонов. Вывод. Разработанный нами новый тиенопиримидин TPY1 по функциональной активности in vitro и in vivo отнесен к нейтральным антагонистам, поскольку он ингибирует стимулированные ТТГ уровни тиреоидных гормонов и экспрессию белков тиреоидогенеза, но не влияет на базальную активность системы синтеза тиреоидных гормонов. Этим TPY1 отличается от созданного нами ранее соединения TP48, которое функционирует как инверсионный агонист рецептора ТТГ, уступая по своей антагонистической активности соединению TPY1. По результатам второго года исследований были опубликованы (приняты к печати) три экспериментальных статьи в журналах, рецензируемых в международных базах данных WoS/Scopus, в том числе одна статья в журнале Int J Mol Sci, относящемся к Q1-квартилю.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Фундаментальная задача проекта состоит в создании и изучении нового поколения регуляторов репродуктивной и тиреоидной систем на основе низкомолекулярных соединений, которые могут в дальнейшем применяться для лечения заболеваний репродуктивной и тиреоидной систем, в том числе ассоциированных с сахарным диабетом (СД), а также во вспомогательных репродуктивных технологиях. В рамках проекта ведется разработка тиено-[2,3-d]-пиримидиновых производных (ТП) и других гетероциклических соединений, наделенных активностью аллостерических полных и инверсионных агонистов и антагонистов рецепторов лютеинизирующего (ЛГР) и тиреотропного гормонов (ТТГР), изучение молекулярных механизмов и мишеней их действия в норме и при патологии. В течение третьего года выполнения проекта были получены следующие важнейшие результаты. 1. Разработаны и изучены аллостерические регуляторы ТТГР с активностью полных и инверсионных агонистов и нейтрального антагониста. Полный агонист – 5-амино-4-(4-(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)фенил)-N-(трет-бутил)-2-(метилтио)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамид (TP-Y3m), при в/б введении крысам дозозависимо повышал у них уровни тироксина в крови, а в щитовидной железе (ЩЖ) усиливал экспрессию генов тиреопероксидазы (TPO) и D2-дейодиназы (Dio2), ответственных за синтез тиреоидных гормонов. В культуре FRTL-5-тироцитов TP-Y3m стимулировал экспрессию гена Na+/I--котранспортера (Nis), участвующего в синтезе тироксина. При совместном введении с ТТГ (in vitro, FRTL-5-клетки) или тиролиберином (in vivo, ЩЖ крыс) TP-Y3m восстанавливал сниженную ими экспрессию гена ТТГР, что лежит в основе TP-Y3m-индуцированного потенцирования эффектов ТТГ (in vitro) и тиролиберина (in vivo) на продукцию тиреоидных гормонов. Тем самым, TPY3m является прототипом препарата для коррекции функций ЩЖ при субклиническом гипотиреозе, в том числе, обусловленном резистентностью ЩЖ к ТТГ. Соединения TPY1 и TP48, несмотря на структурное сходство с TP-Y3m, имели антагонистическую активность. Они ослабляли ТТГ-стимулированную продукцию тиреоидных гормонов в культуре тироцитов FRTL-5 и ингибировали стимулированные тиролиберином уровни тиреоидных гормонов и экспрессию генов тиреоидогенеза в ЩЖ при в/б введении крысам. В то же время TPY1 существенно не влиял на базовые уровни тиреоидных гормонов, в то время как TP48 значимо их снижал. TP48 также ингибировал экспрессию гена Nis в ЩЖ крыс. Таким образом, по своим регуляторным свойствам TPY1 был отнесен к нейтральным антагонистам, а TP48 – к инверсионным агонистам ТТГР. В перспективе, TPY1 может стать прототипом препарата, который будет нормализовать уровни тиреоидных гормонов при аутоиммунном гипертиреозе и офтальмопатии Грейвса, не вызывая гипотиреоза, в то время как TP48 может быть полезен для лечения онкологических заболеваний, обусловленных гиперактивацией ТТГР. 2. Разработано соединение 5-амино-4-(3-((бис(диметиламино)метилен)амино)фенил-N-(трет-бутил)-2-(метилтио)тиено-[2,3-d]-пиримидин-6-карбоксамид (TPX51), регуляторные свойства которого необычным образом меняются во времени. На ранней стадии обработки им самцов крыс (60 мин после в/б введения, 15 мг/кг), TPX51 действовал как полный агонист ЛГР, повышая уровень тестостерона в крови и экспрессию генов, ответственных за стероидогенез. Однако в дальнейшем (120 мин и более) он снижал как базальные уровни тестостерона, так и его уровни, стимулированные хорионическим гонадотропином человека (ХГЧ) и разработанным нами ранее аллостерическим ЛГР-агонистом TP03. В семенниках TPX51 снижал ХГЧ- и TP03-индуцированную стимуляцию экспрессии гена холестерин-транспортирующего белка StAR. Тем самым, вначале TPX51 проявлял свойства полного ЛГР-агониста, но через 2 ч начинал демонстрировать активность инверсионного агониста. Одной из причин этого сдвига в активности может быть биодеградация TPX51 in vivo, поскольку в условиях in vitro при действии на клетки Лейдига он оказывал на синтез тестостерона только стимулирующее влияние. Поскольку изучение стабильности TPX51 в плазме крови не выявило его заметной деградации, то необходимы дальнейшие исследования фармакодинамики и устойчивости TPX51 для объяснения выявленного эффекта. В мировой литературе известно всего несколько случаев, когда в результате биодеградации соединение кардинально меняло свою активность, и все эти работы относились к синтетическим агонистам рецепторов производных аминокислот. 3. Впервые для различных ТП с активностью аллостерических ЛГР-агонистов показана аддитивность их тестостерон-стимулирующих эффектов с таковыми ХГЧ, причем аддитивность показана как в норме, так и при СД 1 и 2 типов (СД1, СД2). Ее молекулярной основой является различная локализация сайтов связывания ХГЧ (внеклеточный ортостерический сайт) и ТП (трансмембранный аллостерический сайт). Обработка самцов крыс TP03 и другим аллостерическим ЛГР-агонистом Org43553 повышала стимулирующий эффект низких доз ХГЧ на уровни тестостерона и экспрессию гена белка StAR, а в случае TP03 и других стероидогенных генов. Так у крыс, обработанных в течение 3 дней TP03 (15 мг/кг), стимулирующий эффект ХГЧ (10 МЕ/крысу) на уровень тестостерона усиливался на 65% через 1.5 ч и на 42% через 3.5 ч. В семенниках крыс группы TP03+ХГЧ экспрессия генов Sf1, Star и Cyp11a1 была значительно выше, чем в группе с обработкой одним ХГЧ, а также повышалась экспрессия фактора CREB, регулирующего экспрессию генов стероидогенеза. При более высокой дозе ХГЧ (20 МЕ/крысу) аддитивность сохранялась, но была выражена слабее. Таким образом, предобработка самцов крыс с помощью аллостерических ЛГР-агонистов является перспективным подходом для усиления стероидогенного эффекта низких доз ХГЧ, что дает возможность уменьшить фармакологические дозы гонадотропинов без снижения их эффективности и избежать ряда их побочных эффектов, например, синдрома гиперстимуляции яичников при контролируемой индукции овуляции. Аддитивность стероидогенных эффектов ХГЧ (10 МЕ/крысу) и аллостерических ЛГР-агонистов (TP03, Org43553) продемонстрирована нами также у самцов крыс с неонатальной моделью СД2 и стрептозотоциновой моделью СД1. В сравнении с контрольными крысами, при СД аддитивность стероидогенных эффектов ТП и ХГЧ была выражена в большей степени, причем не только в отношении повышения уровня тестостерона, но и экспрессии гена StAR в семенниках. Это указывает на перспективность комплексной терапии ТП и ХГЧ для коррекции андрогенного дефицита и восстановления мужской фертильности при СД1 и СД2. 4. Антидиабетический препарат метформин (МФ) способен не только нормализовать метаболические показатели и инсулиновую чувствительность, но и улучшать андрогенный статус и сперматогенез при СД2. Нами была выдвинута гипотеза о возможности взаимного усиления эффектов МФ и ЛГР-агонистов при восстановлении репродуктивных функций при СД2. Для ее проверки изучали влияние пятинедельной МФ терапии крыс с СД2 на стероидогенные и сперматогенные эффекты TP03 и ХГЧ. Впервые установлено, что МФ терапия в значительной степени усиливает стимулирующие эффекты однократно вводимых ЛГР-агонистов на уровни тестостерона в крови и семенниках и на экспрессию стероидогенных генов. Так значения AUC(1h-5h) (площадь под кривой «концентрация тестостерона(нМ)-время(ч)») для стероидогенных эффектов TP03 и ХГЧ в группе с обработкой МФ повышались в среднем на 60%. Это свидетельствует о потенцирующем влиянии МФ на TP03-и ХГЧ-стимулированный стероидогенез при СД2. Причинами этого являются МФ-опосредуемое сохранение экспрессии ЛГР в семенниках и подавление катализируемой ароматазой конверсии андростендиона в эстрадиол. При 5-дневном введении ЛГР-агонистов крысам с СД2, леченным МФ, потенцирующий эффект МФ не выявлялся, что было обусловлено резким снижением экспрессии ЛГР и повышением продукции эстрадиола. Таким образом, при СД2 МФ терапия улучшает стероидогенный ответ семенников на ЛГР-агонисты, в том числе аллостерические (TP03), но только при их однократном, а не хроническом введении. 5. На примере TP03 установлено, что в/б способ доставки ТП более предпочтителен, чем подкожное или пероральное введение. В то же время при пероральном введении стероидогенный эффект TP03 отчетливо выражен, хотя и уступает таковому при в/б введении и требует более высоких доз препарата (40-50 мг/кг против 10-20 мг/кг при в/б). Это указывает на перспективность дальнейшего изучения перорального способа доставки ТП, как более подходящего в сравнении с инъекционными способами в условиях клиники. В отличие от ХГЧ, обработка TP03 приводила к устойчивому во времени (при 5-дневном введении) стероидогенному эффекту, лишь в небольшой степени влияя на экспрессию генов стероидогенеза и не снижая экспрессии ЛГР в семенниках. Это свидетельствует о сохранении в условиях обработки TP03 чувствительности семенников к эндогенным гонадотропинам с ЛГ-активностью, что характерно как для в/б, так и для перорального введения TP03. С помощью ВЭЖХ показано, что концентрация TP03 в крови при в/б введении достигает максимума через 120 мин, а через 6 ч снижается в среднем на 50% по сравнению с максимальными значениями. Через 6 ч TP03 выявлен в семенниках, основной мишени его действия, а также в сопоставимых количествах в печени и ЩЖ. Для сравнения, более гидрофобное соединение TP48, инверсионный ТТГР-агонист, менее устойчиво (через 6 ч его концентрация составляет менее 10% от максимальных значений), хорошо аккумулируется в ЩЖ, и, в отличие от TP03, почти не поступает в мозг. Таким образом, получены данные о сравнительной эффективности различных путей доставки ТП и их устойчивости и распределении в тканях, что важно для разработки стратегии практического применения аллостерических регуляторов ЛГР и ТТГР. По результатам третьего года исследований имеются (опубликованы или приняты к печати) 8 публикаций в журналах, индексированных в международных базах данных WoS и Scopus, в том числе одна статья в журнале Pharmaceuticals, относящемся к Q1-квартилю.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Фундаментальная задача проекта состоит в создании и изучении нового поколения регуляторов репродуктивной и тиреоидной систем на основе низкомолекулярных соединений, которые могут применяться для лечения заболеваний репродуктивной и тиреоидной систем, в том числе ассоциированных с сахарным диабетом (СД), а также во вспомогательных репродуктивных технологиях. В рамках проекта ведется разработка тиено-[2,3-d]-пиримидиновых производных (ТП), наделенных активностью аллостерических регуляторов рецепторов лютеинизирующего (ЛГР) и тиреотропного гормонов (ТТГР), изучение механизмов и мишеней их действия в норме и при патологии. В течение 4 года были получены следующие важнейшие результаты. При метаболическом синдроме (МС) нарушаются функции репродуктивной системы, что влечет снижение фертильности и андрогенный дефицит. Для их коррекции используют терапию, направленную на снижение массы тела и улучшение метаболического и гормонального статуса, так и фармакологическую коррекцию функций репродуктивной системы. В первом случае наиболее часто применяют метформин (МФ). Во втором случае гонадотропины и андрогены, которые, однако имеют ряд побочных эффектов, обусловленных нарушением функционирования гонадной оси после их отмены, что требует поиска альтернативных путей стимуляции стероидогенеза, в том числе аллостерическими ЛГР-агонистами, или разработки подходов для снижения дозы гонадотропинов. В 2021 году нами показано, что лечение МФ крыс с сахарным диабетом 2 типа (СД2) не только улучшает у них функции репродуктивной системы, но и повышает чувствительность к разработанному нами ЛГР-агонисту TP03 и хорионическому гонадотропину человека (ХГЧ). В 2022 году мы сконцентрировали внимание на изучении крыс с диета-индуцированным МС. Впервые показано, что 5-дневная обработка крыс с МС с помощью TP03 приводит к повышению уровня тестостерона (Т) и экспрессии гена холестерин-транспортирующего белка StAR в семенниках и к нормализации сперматогенеза. В отличие от ХГЧ, TP03 не снижал экспрессию и количество белка ЛГР в семенниках и не ослаблял экспрессию гипофизарных генов, кодирующих гонадотропины, что указывает на отсутствие негативного влияния TP03 на гонадную ось. При этом, в отличие от крыс с СД2, лечение МС-крыс МФ не усиливало эффекты TP03. Тем самым, с одной стороны, доказана эффективность TP03 для восстановления андрогенного дефицита и фертильности при МС. С другой, показана нецелесообразность комбинированного применения МФ и TP03 при диета-индуцированном МС. Основываясь на полученных ранее данных об усилении эффекта ХГЧ на тестикулярный стероидогенез при его совместном введении с ТП, было изучено влияние раздельного и совместного введения ХГЧ и TP03 на уровни Т у здоровых самцов крыс и крыс с СД1. Такой подход позволяет снизить дозы гонадотропинов, «выжигающие» ЛГР и ингибирующие гонадную ось после отмены препарата. Впервые показано, что при совместном введении низких доз TP03 (15 мг/кг) и ХГЧ (10 МЕ/крысу) самцам крыс их стероидогенные эффекты превосходят таковые при раздельном применении препаратов, что указывает на их аддитивность. Аддитивность была отчетливо выражена у СД1 крыс, несмотря на характерные для них функциональные и морфологические изменения в семенниках. Это, как мы полагаем, объясняется присущими ТП свойствами шаперонов, восстанавливающих процессинг ЛГР, нарушенный при СД1. Показанная нами способность ТП стимулировать тестикулярный стероидогенез стала базисом для их изучения, как стимуляторов овариального стероидогенеза и индукторов овуляции. Для исследования выбрали TP03, который сравнивали с ХГЧ, который широко применяется для контролируемой индукции овуляции, но имеет ряд серьезных побочных эффектов, вызывая, например, синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ). Введение TP03 контрольным и обработанным Оргалутраном, антагонистом гонадолиберина, половозрелым самкам крыс приводило к повышению продукции прогестерона и усилению экспрессии генов, кодирующих ключевые компоненты овариального стероидогенеза – белок StAR, цитохром P450c17 и ароматазу. Стероидогенные эффекты TP03 были сопоставимы с таковыми ХГЧ, но TP03 не вызывал ослабления активности гонадной оси. Так он не влиял на уровень ЛГ в крови и на экспрессию ЛГР в яичниках, предотвращая развитие резистентности яичников к эндогенному ЛГ. Далее исследовали эффекты TP03 на овуляцию у неполовозрелых самок крыс (возраст 22 дня), которых предварительно стимулировали препаратом ФСГ. Морфологический анализ показал, что TP03 повышает количество предовуляторных фолликулов в течение 16 ч, а через 24 ч индуцирует овуляцию, о чем свидетельствует появление значимого числа овулировавших фолликулов. Через 8 ч TP03 повышал уровень прогестерона, и это повышение сохранялось в течение 16 ч. По стероидогенной активности и способности индуцировать овуляцию TP03 был сопоставим с ХГЧ, но действовал более мягко. В отличие от ХГЧ, он не повышал экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в яичниках, что указывает на низкие риски развития СГЯ. Эти данные свидетельствует о перспективах разработки на основе TP03 препаратов для контролируемой индукции овуляции. Для разработки негативных регуляторов ТТГР, предназначенных для лечения аутоиммунного гипертиреоза и ТТГ-зависимых опухолей, были синтезированы два новых ТП – TPY4 и TPY5, структурные аналоги ранее разработанных TP48 и TPY1. Замена йода на бром в TPY4 существенно меняла его фармакологический профиль. TPY4, в отличие от йод-содержащего TP48, повышал базальный уровень тиреоидных гормонов у крыс, действуя как агонист ТТГР. Однако, в условиях стимуляции тиролиберином он снижал уровни тиреоидных гормонов и экспрессию генов белков, вовлеченных в тиреоидогенез, функционируя как негативный аллостерический модулятор ТТГР. В молекулу другого соединения TPY5, аналога TPY1, была введена диольная группа, что не изменило фармакологический профиль соединения, несмотря на небольшое повышение гидрофильности и растворимости TPY5. TPY5, как и TPY1, продемонстрировало активность нейтрального аллостерического антагониста ТТГР, не влияя на базальные уровни тиреоидных гормонов у крыс, но значимо ингибируя у них стимулированный тиролиберином синтез тиреоидных гормонов. При этом длительное (в течение 3 дней) введение TPY1 и TPY5 приводит к постепенному снижению уровня тиреоидных гормонов вследствие ингибирования стимуляции их синтеза эндогенным ТТГ. Следует, однако, отметить, что, несмотря на сходный фармакологический профиль, TPY1 и TPY5 по-разному влияли на экспрессию гена ТТГР в щитовидной железе (ЩЖ) крыс: TPY5 повышал ее у крыс как со стимуляцией тиролиберином, так и без таковой, в то время как TPY1 вызывал снижение экспрессии этого гена. Возможно, это связано со снижением липофильности TPY5 и изменением его распределения в ткани ЩЖ. Было также показано, что исследованные ТТГР-регуляторы слабо или вовсе не влияют на экспрессию гипоталамических генов, вовлеченных в продукцию тиролиберина и опосредующих обратные отрицательные связи в тиреоидной оси. Это указывает на то, что TPY1, TPY4 и TPY5 действуют в основном на периферические звенья тиреоидной оси – фолликулярные клетки ЩЖ, и почти не затрагивают гипоталамические ее звенья. В пользу этого свидетельствуют данные о распределении TP48 и TPY1 в тканях крыс. Эти ТП накапливаются в ЩЖ, основной их мишени, и в печени, как органе, осуществляющем их биодеградацию, но лишь в следовых количествах присутствуют в мозге, что указывает на их низкую способность проникать через гематоэнцефалический барьер. В 2022 г. опубликованы 9 статей, в том числе 2 статьи в журнале Int. J. Mol. Sci., относящемся к Q1-квартилю, JCR 6.628.