Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Макрофаги играют существенную роль в поддержании гомеостаза, участвуя в регуляции иммунного ответа, элиминации патогенов и поврежденных клеток хозяина, а также в репарации тканей после повреждения и инфекций. Нарушение функций макрофагов является одним из патофизиологических механизмов многих заболеваний включая онкологические, инфекционные, нейродегенеративные, кардиоваскулярные. В связи с этим макрофаг-ориентированная терапия имеет перспективы для лечения многих заболеваний. Однако разработка стратегий терапевтического воздействия на макрофагальную популяцию клеток требует глубинного понимания биологии макрофагов и регуляции их активности. Макрофаги выполняют свои функции локально, в тканях, в которых они находятся. В настоящее время принято считать, что макрофаги, локализованные в большей части тканей, развиваются из эмбриональных предшественников, и поддержание их пула не зависит от миграции в ткани моноцитов костномозгового происхождения. Несмотря на это, до последнего времени основной моделью, используемой для изучения макрофагов человека, являлись макрофаги, полученные из моноцитов крови. В последние годы были предложены методы получения макрофагов из эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ПСК), которые открывают новые перспективы для изучения тканевых макрофагов и моделирования болезней, развитие которых связано с нарушением функционирования макрофагальной системы. Макрофаги, полученные из ПСК (иМФ), являются также потенциальным источником клеток для лечения ряда заболеваний. Использование иМФ, однако, требует понимания их особенностей, степени гетерогенности популяции, соответствия популяциям, персистирующим in vivo. В ходе первого года выполнения проекта мы начали исследовать эти вопросы. Была проведена следующая работа. 1. Были дифференцированы иМФ с использованием различных протоколов. Один протокол основан на образовании эмбриоидных телец, их дифференцировке в моноцитарные клетки с использованием цитокинов IL-3 и M-CSF и последующей терминальной дифференцировке образованных клеток в иМФ. Второй протокол основан на многостадийной дифференцировке иПСК в макрофаги, вызываемой последовательным добавлением к культурам иПСК различных морфогенов, факторов роста и цитокинов. Предложены модификации описанных в литературе протоколов. Проведено сравнение эффективности всех использованных протоколов, на основании которого выбран протокол для дальнейших исследований. 2. Проведен детальный фенотипический анализ иМФ, полученных с использованием разных протоколов. Показано, что иМФ экспрессируют маркеры миелоидных клеток, ко-экспрессируют маркеры макрофагов М1 и М2, характеризуются низким уровнем экспрессии молекул 2 класса главного комплекса гистосовместимости и ко-экспрессией CD14 и CD16. 3. Показано, что иМФ обладают фагоцитарной активностью и способностью ингибировать рост Mycobacterium tuberculosis in vitro. 4. Анализ секреторного профиля иМФ показал их способность к одновременной продукции про- и противовоспалительных цитокинов. 5. Выделена РНК и проведен транскриптомный анализ иМФ, полученных с использованием различных протоколов дифференцировки. В соответствии с планом проекта, результаты транскриптомных исследований будут обработаны на 2 этапе проекта. В совокупности, исследования, проведённые на первом этапе, позволили разработать и выбрать протокол дифференцировки иМФ для дальнейших исследований, показали, что иМФ представляют собой дифференцированные, низко активированные клетки, характеризующиеся «смешанным» М1/М2 фенотипом, комбинированной про- и противовоспалительной активностью и антибактериальными свойствами. Результаты указывают на вероятное сходство иМФ с тканевыми макрофагами, что позволяет рассматривать иМФ как модель для изучения функционирования тканевых макрофагов человека и разработки методов направленного воздействия на них в условиях патологии. Непосредственное сравнение иМФ с популяциями клеток персистирующими in vivo, будет проведено в дальнейшем.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Макрофаги – клетки врожденного иммунитета, играющие важную роль во многих фундаментальных биологических процессах, включая развитие воспаления и иммунного ответа, регуляцию воспалительных реакций, восстановление тканей и поддержание гомеостаза. Нарушение функций макрофагов является важным звеном патогенеза многих заболеваний, включая инфекционные, аутоиммунные, метаболические, наследственные и другие. Это привлекает внимание к макрофагам как к возможной терапевтической мишени и инструменту клеточной терапии. Однако разработка методов терапии, ориентированных на коррекцию функции макрофагов, требует наличия адекватных клеточных моделей. Подходы к получению и моделированию макрофагов человека, существовавшие ранее, имели целый ряд ограничений. Относительно недавно были предложены новые модели получения макрофагов, основанные на дифференцировке макрофагов in vitro из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК). Важными преимуществами данных методов является возможность получения в достаточно больших количествах генетически идентичных макрофагов и проведения их геномного редактирования. Эти преимущества стимулировали развитие различных приложений для макрофагов, дифференцированных из иПСК (иМФ), включая модели in vitro для скрининга лекарств, разработку методов таргетной коррекции генов в макрофагах, разработку подходов к клеточной терапии ряда заболеваний и др. Число исследований в этой области быстро растет. Следует, однако, отметить, что протоколы, используемые в настоящее время для генерации иМФ, существенно различаются и не систематизированы. В 2020 г. наши исследования были направлены на сравнительный анализ иМФ, дифференцированных с использованием разных протоколов и на сравнение иМФ с моноцитами/макрофагами персистирующими in vivo. Во-первых, мы провели детальный анализ опубликованных протоколов получения иМФ, систематизировали их и подразделили на несколько типов. Во-вторых, нами были проведены исследования по дифференцировке иМФ с использованием разных протоколов и сравнительному фенотипическому и транскриптомному анализу полученных иМФ. В-третьих, было проведено сравнение иМФ и моноцитов/макрофагов, персистирующих in vivo. Наконец, были проведены исследования траекторий дифференцировки иМФ. Исследования показали: (а) близость иМФ к макрофагам моноцитарного происхождения и одновременно - характерные отличия между ними на фенотипическом, секреторном и транскриптомном уровнях; (б) сходство фенотипа иМФ и резидентных тканевых макрофагов; (в) транскриптомные отличия иМФ, полученных с использованием разных протоколов дифференцировки. В целом, проведенные исследования подробно охарактеризовали фенотипические и функциональные особенности макрофагов, дифференцированных из иПСК, впервые обратили внимание и показали различия в иМФ, генерируемых с использованием разных протоколов дифференцировки, и создали научную основу для дальнейшего развития методов генерации и применения иМФ, включая исследования, запланированные нами на 2021 г.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Макрофаги – клетки врожденного иммунитета, играющие важную роль во многих фундаментальных биологических процессах, включая развитие воспаления и иммунного ответа, регуляцию воспалительных реакций, восстановление тканей и поддержание гомеостаза. Нарушение функций макрофагов является важным звеном патогенеза многих заболеваний. Это привлекает внимание к макрофагам как к возможной терапевтической мишени и инструменту клеточной терапии. Однако разработка методов терапии, ориентированных на коррекцию функции макрофагов, требует наличия адекватных клеточных моделей. Подходы к получению макрофагов человека, существовавшие ранее, имели целый ряд ограничений. Относительно недавно были предложены новые модели получения макрофагов, основанные на дифференцировке индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) в макрофаги (иМФ). Настоящий проект направлен на развитие технологии получения иМФ и подходов к получению генетически модифицированных иМФ. В первые два года выполнения проекта были отработаны протоколы получения иМФ, проведена детальная характеристика транскриптома, фенотипических и функциональных свойств иМФ. В 2021 г. исследования были сфокусированы на получении генетически модифицированных иМФ, а также на характеристике траекторий дифференцировки иМФ. Получение генетически модифицированных макрофагов человека является методически непростой задачей в связи с низкой пролиферативной активностью макрофагов, а также их способностью распознавать чужеродные нуклеиновые кислоты. Напротив, трансфекция иПСК реализуема и достаточно хорошо отработана. В связи с этим получение трансгенных иПСК с последующей их дифференцировкой в иМФ представляется перспективным подходом к генерации генетически модифицированных макрофагов. Этот подход, однако, требует апробации. Для апробации подхода была выбрана модель получения иМФ с доксициклин-управляемой экспрессией одного из генов, участвующих в антимикробном ответе фагоцитов, с использованием технологии CRISPR/Cas9. В 2021 г. были получены, отселектированы и наращены 4 клона трансгенных иПСК; способность трансгенных иПСК давать начало трансгенным иМФ была проверена для двух из 4-х клонов. Было продемонстрировано, что трансгенные иМФ экспрессируют фенотип типичный для макрофагов человека. В ответ на стимуляцию доксициклином в трансгенных иМФ значительно увеличивалась экспрессия трансгена. Таким образом, была подтверждена возможность получения трансгенных макрофагов с использованием технологии, основанной на дифференцировке иМФ из генетически модифицированных иПСК. В 2021 г. были также продолжены исследования по сравнительному анализу траекторий, по которым происходит дифференцировка иМФ при использовании двух разных протоколов дифференцировки. В 2022 г., исследования будут сфокусированы на функциональной характеристике трансгенных иМФ и обобщении результатов выполнения проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Макрофаги – клетки врожденного иммунитета, играющие важную роль во многих фундаментальных биологических процессах, включая развитие воспаления и иммунного ответа, регуляцию воспалительных реакций, восстановление тканей и поддержание гомеостаза. Нарушение функций макрофагов является важным звеном патогенеза многих заболеваний. Это привлекает внимание к макрофагам как к возможной терапевтической мишени и инструменту клеточной терапии. Однако разработка методов терапии, ориентированных на коррекцию функции макрофагов, требует наличия адекватных клеточных моделей. Подходы к получению макрофагов человека, существовавшие ранее, имели целый ряд ограничений. Относительно недавно были предложены новые модели получения макрофагов, основанные на дифференцировке индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) в макрофаги (иМФ). Настоящий проект направлен на развитие технологии получения иМФ и подходов к получению генетически модифицированных иМФ. В 2021 г. нами были получены генетически модифицированные иПСК с тетрациклин-контролируемой экспрессией одного из генов, участвующих в противобактериальном ответе фагоцитов, и показана возможность их дифференцировки в иМФ. В 2022 г. был проведен анализ трансгенных иМФ, включавших исследование их фагоцитарной, секреторной и антибактериальной активностей. Показана высокая антибактериальная активность иМФ. Исследованы изменения характеристик иМФ в разных условиях микроокружения. Также были продолжены исследования по анализу траекторий дифференцировки иМФ при использовании различных протоколов дифференцировки. Показано влияние протокола на провоспалительную активность иМФ и экспрессию генов, ассоциированных с презентацией антигена (МНС класса II и др.) и липидным метаболизмом.