Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках первого года выполнения Проекта при помощи платформы Oxford Nanopore было осуществлено полногеномное секвенирование двух штаммов родентицидной бактерии Исаченко (Salmonella enteridis var. Issatchenko). Путем совмещения прочтений Oxford Nanopore и Illumina получены наиболее полные на сегодняшний момент сборки геномов Salmonella enteritidis var. Issatschenko, на основе которых проведена комплексная характеристика спектра вариабельных сайтов и факторов вирулентности, которые могут обуславливать видоспецифичность бактерии Исаченко. Для сборки геномов штаммов бактерии Исаченко нами был использован многоступенчатый гибридный подход, включавший сначала сборку контигов на основе длинных прочтений Oxford Nanopore, которые затем подвергались нескольким раундам коррекции ошибок, в том числе с использованием коротких прочтений, полученных при секвенировании на платформе Illumina. Такой многостадийный подход позволил получить сборки геномов хромосомного уровня, содержащих минимальное количество замен. В целом, по итогам сравнения данных гибридных сборок геномов S. enteritidis var. Issatschenko, полученных из данных секвенирования на двух платформах (Illumina и Oxford Nanopore), можно заключить, что специфичность патогенных свойств этого микроорганизма не связана с наличием мутаций в каком-то одном гене, а опосредована наличием комлекса структурных и, вероятно, регуляторных мутаций в различных системах контроля вирулентности (предварительные результаты опубликованы в тезисах в журнале Molecular Biology of the Cell, https://www.molbiolcell.org/doi/suppl/10.1091/mbc.E19-11-0617). Одним из важнейших звеньев в специфичности вирулентности S. enteritidis var. Issatschenko, по-видимому, является двукомпонентная сигнальная система PhoP/PhoQ, обуславливающая устойчивость патогена к низким pH и нехватке ионов магния. Также в рамках Проекта проведён протеомный скрининг детергент-утойчивых белков белков S. enteritidis var. Issatschenko. Устойчивость к обработке ионными детергентами является одним из важных свойств амилоидов – упорядоченных белковых фибрилл с особыми свойствами. По результатам скрининга выявлен ряд белков, образующих детергент-устойчивых агрегаты в протеоме бактерии Исаченко, представленный различными ферментами и поринами наружной мембраны. Для дальнейшего анализа амилоидогенных свойств выбран порин OmpA, играющий важную роль в вирулентности сальмонеллы, и идентифицированный с одним из наиболее высоких масс-спектрометрических счетов. В целом, результаты анализа детергент-устойчивых фракций протеома S. enteritidis var. Issatschenko при помощи метода протеомного скрининга амилоидов свидетельствуют в пользу наличия амилоидогенных свойств у некоторых факторов вирулентности этого микроорганизма, преимущественно относящихся к поринам, то есть белкам наружной мембраны. Наконец, в рамках первого года выполнения Проекта сконструированы плазмиды, подобраны условия продукции и наработаны препаративные количества выбранного для дальнейшего анализа белка OmpA Salmonella enteritidis var. Issatschenko, для последующей проверки на амилоидогенность и токсичность (результаты опубликованы в тезисах в журнале FASEB Journal, https://faseb.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1096/fasebj.2020.34.s1.00268), а также контрольных амилоидных и неамилоидных белков. Так, нами были успешно наработаны в препаративных количествах белки Sup35NM (амилоидный), Sup35M (растворимый), которые также будут использованы в работе в ходе второго года выполнения Проекта в качестве положительного и отрицательного контролей. Так как мы будем исследовать белки, отличающиеся по первичной структуре, то стоит ожидать наличие отличий и при образовании ими фибрилл. Образуемые амилоидные агрегаты имеют большую молекулярную массу, что порой затрудняет их детальный анализ с использованием метода SDS-PAGE (денатурирующий гель-электрофорез в полиакриламидном геле (англ. Sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)). Для подобных случаев может быть применён другой метод – SDD-AGE (полуденатурирующий электрофорез в агарозном геле (англ. Semi-Denaturating Detergent Agarose Gel Electrophoresis)). Поскольку для данного метода не существует белковых маркеров молекулярного веса с широкой линейкой, для решения этой задачи будет использован подход для сопоставления веса ДНК-маркеров с весом белковых агрегатов, при разработке которого был использован наработанный и очищенный нами белок Sup35NM (результаты опубликованы в статье в журнале Prion, https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19336896.2020.1751574). Белок OmpA S. enteritidis var. Issatschenko, как и его ортологи из энтеробактерий, представляет собой белок с укладкой типа бета-бочка из группы поринов, белков мембран. Для белков данного семейства характерна вовлеченность в вирулентность и патогенез микроорганизмов, включая участие в образовании биоплёнок и адгезии клеток бактерий к тканям хозяина во время инфицирования. Всё это делает детальное изучение роли амилоидогенеза OmpA в вирулентности S. enteritidis var. Issatschenko чрезвычайно актуальным. Публикации по результатам выполнения первого года выполнения Проекта (2019-2020 гг.): 1. Belousov M. V., Shikov A. E., Belousova M. E., Nizhnikov A. A., Antonets K. S. Genomic Determinants Underlying Rodenticidal Properties of the Salmonella Enteritidis Var. Issatschenko // Molecular Biology of the Cell, 2019, V.30, № 26 (Suppl. 2019 ASCB Annual Meeting abstracts), P. 2607. doi: 10.1091/mbc.E19-11-0617 (Impact Factor WoS 3.905, Q2 / Impact Factor Scopus 2.78, Q1) 2. Belousov M.V., Kosolapova A.O., Antonets K.S., Nizhnikov A.A. OmpA Porin of Salmonella enterica serovar Enteritidis Possesses Aamyloid-Forming Properties // FASEB Journal, 2020, V.34, Issue S1 (Supplement: Experimental Biology 2020 Meeting Abstracts), P.1-1. doi: 10.1096/fasebj.2020.34.s1.00268 (Impact Factor WoS 5.391, Q1 / Impact Factor Scopus 2.07, Q1) 3. Drozdova P.B., Barbitoff Y.A., Belousov M.V., Skitchenko R.K., Rogoza T.M., Leclercq J., Kajava A.V., Matveenko A.G., Zhouravleva G.A., Bondarev S.A. Estimation of amyloid aggregate sizes with semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis and its limitations // Prion, 2020, V.14 №1, P.118-128. doi: 10.1080/19336896.2020.1751574 (Impact Factor WoS 1.596, Q4 / Impact Factor Scopus 0.76, Q2)

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В рамках второго года выполнения Проекта нами были получены фибриллы белка OmpА бактерии Salmonella enteridis var. Issatschenko. Установлено, что полученные агрегаты устойчивы к воздействию холодных детергентов (2% SDS), а также частично устойчивы к протеолизу (трипсином и пепсином), растворяются муравьиной кислотой. Эти данные были получены как с использованием антител против 6xHis-tag, так и антител против OmpА Salmonella enteridis var. Issatschenko, которые были получены в ходе выполнения Проекта. Далее фибриллы были изучены с использованием просвечивающей электронной и поляризационной микроскопий. Эти методы являются своего рода «золотым стандартом» выявления амилоидных свойств агрегатов, так как позволяют визуализировать фибриллы в первом случае и их яблочно-зеленое свечение при взаимодействии с красителем Конго красный при анализе двойной рефракции в поляризованном свете – во втором. Также проведено масштабное исследование связывания фибрилл OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko с другим красителем – Тиофлавином Т, с использованием методики равновесного микродиализа и конфокальной микроскопии. Результаты показали, что исследуемые образцы белка OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko обладают амилоидогенными участками, и они могут образовывать амилоидные фибриллы in vitro. Возможные биологические роли амилоидных фибрилл мембранных белков бактерий обсуждены нами в обзоре в журнале International Journal of Molecular Sciences, https://doi.org/10.3390/ijms21197240). Чтобы проанализировать способность белка OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko к агрегации в живых клетках, мы использовали систему С-DAG (curli-dependent amyloid generator system) или экстраклеточную систему агрегации на основе Escherichia coli, результаты которой не отличались от положительного контроля (амилоидный белок Sup35NM). Так как нами были получены специфичные поликлональные антитела кролика против OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko, мы смогли показать колокализацию частиц золота, слитых с антителами, с мембраной клеток и фибриллами на их поверхности, что также не оставляет сомнений в фибриллярной природе OmpA бактерии Salmonella enteridis var. Issatschenko. Наконец, для финальной оценки токсичности в отношении клеток макрофагов мышей J774 при инкубации с фибриллами OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko мы провели анализ, который показал снижение выживаемости моноцитов более чем в 15 раз. Аналогичный эксперимент, проведенный на линии моноцитов человека THP-1, не выявил токсичности фибрилл OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko. Таким образом, мы подтвердили и in vivo амилоидные свойства фибрилл OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko, а также показали что они могут являться фактором вирулентности избирательно патогенной против грызунов бактерии Исаченко. При этом, описанная нами токсичность фибрилл OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko в отношении клеток мыши и отсутствие токсичности для клеток человека согласуется с описанным в работах других исследователей строго избирательным эффектом данной сальмонеллы в отношении грызунов. Публикации по результатам второго года выполнения Проекта (2020-2021 гг.): 1. Kosolapova A.O., Antonets K.S., Belousov M.V., Nizhnikov A.A. Biological Functions of Prokaryotic Amyloids in Interspecies Interactions: Facts and Assumptions // International Journal of Molecular Sciences, 2020. V.21(19), 7240. DOI: 10.3390/ijms21197240 (Impact Factor WoS 4.556, Q1 / Impact Factor Scopus 1.32, Q1)