КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 19-76-00026
НазваниеМолекулярные механизмы вирулентности и специфичности выбора организма-хозяина энтеробактерии Salmonella enteritidis var. Issatschenko
РуководительБелоусов Михаил Владимирович, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии", г Санкт-Петербург
Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2019 - 06.2021 |
Конкурс№40 - Конкурс 2019 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-104 - Агробиотехнологии
Ключевые словаSalmonella enteritidis, вирулентность, токсин, биологический препарат, защита растений, амилоид, белок, патогены млекопитающих, сальмонелла
Код ГРНТИ68.37.29
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Большинство патогенных микроорганизмов способны инфицировать несколько видов, но некоторые из них высоко приспособлены к одному хозяину. Зоонозные патогены, которые способны преодолеть видовой барьер, например, передаваться от животных людям, представляют собой одну из наиболее актуальных для человечества проблем. Широкое распространение мышевидных грызунов, являющихся, с одной стороны, злостными вредителями сельского хозяйства, а с другой - переносчиками тяжелейших заболеваний для человека и животных, вынуждает искать безопасные средства защиты от них. В начале ХХ века был разработан родентицидный биологический препарат на основе сальмонеллы Исаченко Salmonella enteritidis var. Issatschenko, безопасный для человека и большинства теплокровных животных и обладающий избирательным патогенным эффектом в пределах отряда грызунов. Так, штаммы этого микроорганизма, депонированные в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ, обладают выраженными патогенными свойствами против мышевидных грызунов и не способны колонизировать человека. В рамках настоящего Проекта планируется установить особенности факторов вирулентности бактерии S. enteritidis var. Issatschenko, обуславливающие её уникальные свойства. В последнее время появилось множество работ, посвящённых изучению факторов вирулентности S. enteritidis, в частности, изучению специфичности анализируемых штаммов в отношении вида организма-хозяина. Эти исследования особенно интересны ввиду того, что вариабельность участков генома S. enteritidis, отвечающих за факторы вирулентности, достаточно велика и порой мельчайшие изменения, включая однонуклеотидные замены, приводят к серьёзным последствиям, включая, например, потерю/усиление токсичности, способность поражать новые виды и т.д. Сравнение наиболее вариабельных участков генома S. enteritidis var. Issatschenko с другими хорошо изученными патогенными штаммами S. enteritidis, которое будет выполнено в рамках настоящего Проекта, может существенно прояснить картину видоспецифичности исследуемых штаммов бактерии Исаченко и выявить конкретные белки и их участки, отвечающие за специфичность его вирулентности и патогенности. В последнее время пристальное внимание уделено исследованиям вирулентных белков, вовлечённых в формирование биоплёнки и фимбрий клеток, курлинам (белкам мембранного матрикса), поринам мембраны, так как именно эти факторы в наибольшей степени обеспечивают адгезию и проникновение в клетки хозяина, вызывают воспаление и дальнейший патогенез. Показано, что многие из этих белков формируют амилоидные, то есть обладающие особой упорядоченной структурой, фибриллы. Таким образом, роль амилоидогенеза в вирулентности и патогенности бактерий представляется весьма значимой и может являться ключевым детерминантом специфичности энтеробактерий в отношении теплокровных хозяев. В настоящем Проекте предполагается изучить амилоидные свойства факторов вирулентности бактерий Исаченко и оценить их роль в специфичности свойств этого микроорганизма. Сопоставление полногеномных данных с результатами анализа структуры и свойств факторов вирулентности, запланированное в рамках Проекта, станет основой, во-первых, для детального изучения молекулярных механизмов специфичности S. enteritidis var. Issatschenko к виду организма-хозяина, во-вторых, для понимания возможности преодоления этим микроорганизмом видового барьера, в том числе по отношению к человеку, а также будет способствовать выявлению и описанию новых амилоидов и осознанию их роли в вирулентности бактерий.
Ожидаемые результаты
Ключевым результатом Проекта станет изучение особенностей факторов вирулентности S. enteritidis var. Issatschenko, обуславливающих видоспецифичность данного патогена. Впервые будет проведено определение последовательности генома этого штамма с использованием полногеномного секвенирования третьего поколения Oxford Nanopore. На следующем этапе будет осуществлено биоинформатическое сравнение геномов бактерий S. enteritidis var. Issatschenko с известными патогенными формами сальмонеллы, выявлены их отличия от других штаммов данного вида. Стоит отметить, что за последнее время накоплено большое количество информации о составе и структуре генома различных серотипов S. enteritidis. Полученные в рамках данного Проекта результаты позволят сделать выводы о молекулярных механизмах специфичности сальмонеллы Исаченко в отношении вида организма-хозяина. В частности, будут установлены конкретные аминокислотные замены в факторах вирулентности и белках, опосредующих патогенез, которые у бактерии Исаченко отличаются от патогенных сальмонелл и могут потенциально являться детерминантами специфичности этого микроорганизма.
Поскольку ряд факторов вирулентности обладают амилоидогенными свойствами, мы изучим роль амилоидогенеза в специфичности действия патогена. Для этого будет охарактеризован комплекс амилоидогенных белков бактерии Исаченко при помощи метода протеомного скрининга амилоидов (PSIA); у выявленных белков-факторов вирулентности будут проверены амилоидогенные характеристики in vitro и in vivo: проанализированы детергент- и протеазоусточивость, проведены исследования способности формировать фибриллы в системе бактериального экспорта C-DAG, изучено взаимодействие с амилоидными красителями и возможность образования фибрилл in vitro. Наряду с этими экспериментами, анализ действия полученных рекомбинантных белков факторов вирулентности на культурах клеток человека и мышей, запланированных в рамках настоящего Проекта, покажет связь их токсического действия с амилоидной структурой, а также функциональность амилоидного состояния этих белков в специфичности выбора клеток хозяина. Стоит отметить, что S. enteritidis является значимым патогеном человека и животных, в то же время считается, что серовар S. enteritidis var. Issatschenko поражает только грызунов, и безопасен для других млекопитающих, но молекулярные механизмы этих особенностей ещё не охарактеризованы; такая работа планируется в рамках Проекта впервые. В целом описание видоспецифичности факторов вирулентности S. enteritidis var. Issatschenko и их амилоидогенных свойств не только позволит впервые раскрыть фундаментальные механизмы выбора хозяина этим микроорганизмом и идентифицировать новые бактериальные амилоидные белки, что обладает высокой актуальностью и значимостью на мировом уровне, но может также открыть перспективы для дальнейших прикладных исследований, к примеру, использования данных о структуре этих белков для создания на их основе биологических препаратов нового поколения.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках первого года выполнения Проекта при помощи платформы Oxford Nanopore было осуществлено полногеномное секвенирование двух штаммов родентицидной бактерии Исаченко (Salmonella enteridis var. Issatchenko). Путем совмещения прочтений Oxford Nanopore и Illumina получены наиболее полные на сегодняшний момент сборки геномов Salmonella enteritidis var. Issatschenko, на основе которых проведена комплексная характеристика спектра вариабельных сайтов и факторов вирулентности, которые могут обуславливать видоспецифичность бактерии Исаченко. Для сборки геномов штаммов бактерии Исаченко нами был использован многоступенчатый гибридный подход, включавший сначала сборку контигов на основе длинных прочтений Oxford Nanopore, которые затем подвергались нескольким раундам коррекции ошибок, в том числе с использованием коротких прочтений, полученных при секвенировании на платформе Illumina. Такой многостадийный подход позволил получить сборки геномов хромосомного уровня, содержащих минимальное количество замен. В целом, по итогам сравнения данных гибридных сборок геномов S. enteritidis var. Issatschenko, полученных из данных секвенирования на двух платформах (Illumina и Oxford Nanopore), можно заключить, что специфичность патогенных свойств этого микроорганизма не связана с наличием мутаций в каком-то одном гене, а опосредована наличием комлекса структурных и, вероятно, регуляторных мутаций в различных системах контроля вирулентности (предварительные результаты опубликованы в тезисах в журнале Molecular Biology of the Cell, https://www.molbiolcell.org/doi/suppl/10.1091/mbc.E19-11-0617). Одним из важнейших звеньев в специфичности вирулентности S. enteritidis var. Issatschenko, по-видимому, является двукомпонентная сигнальная система PhoP/PhoQ, обуславливающая устойчивость патогена к низким pH и нехватке ионов магния.
Также в рамках Проекта проведён протеомный скрининг детергент-утойчивых белков белков S. enteritidis var. Issatschenko. Устойчивость к обработке ионными детергентами является одним из важных свойств амилоидов – упорядоченных белковых фибрилл с особыми свойствами. По результатам скрининга выявлен ряд белков, образующих детергент-устойчивых агрегаты в протеоме бактерии Исаченко, представленный различными ферментами и поринами наружной мембраны. Для дальнейшего анализа амилоидогенных свойств выбран порин OmpA, играющий важную роль в вирулентности сальмонеллы, и идентифицированный с одним из наиболее высоких масс-спектрометрических счетов. В целом, результаты анализа детергент-устойчивых фракций протеома S. enteritidis var. Issatschenko при помощи метода протеомного скрининга амилоидов свидетельствуют в пользу наличия амилоидогенных свойств у некоторых факторов вирулентности этого микроорганизма, преимущественно относящихся к поринам, то есть белкам наружной мембраны.
Наконец, в рамках первого года выполнения Проекта сконструированы плазмиды, подобраны условия продукции и наработаны препаративные количества выбранного для дальнейшего анализа белка OmpA Salmonella enteritidis var. Issatschenko, для последующей проверки на амилоидогенность и токсичность (результаты опубликованы в тезисах в журнале FASEB Journal, https://faseb.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1096/fasebj.2020.34.s1.00268), а также контрольных амилоидных и неамилоидных белков. Так, нами были успешно наработаны в препаративных количествах белки Sup35NM (амилоидный), Sup35M (растворимый), которые также будут использованы в работе в ходе второго года выполнения Проекта в качестве положительного и отрицательного контролей. Так как мы будем исследовать белки, отличающиеся по первичной структуре, то стоит ожидать наличие отличий и при образовании ими фибрилл. Образуемые амилоидные агрегаты имеют большую молекулярную массу, что порой затрудняет их детальный анализ с использованием метода SDS-PAGE (денатурирующий гель-электрофорез в полиакриламидном геле (англ. Sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)). Для подобных случаев может быть применён другой метод – SDD-AGE (полуденатурирующий электрофорез в агарозном геле (англ. Semi-Denaturating Detergent Agarose Gel Electrophoresis)). Поскольку для данного метода не существует белковых маркеров молекулярного веса с широкой линейкой, для решения этой задачи будет использован подход для сопоставления веса ДНК-маркеров с весом белковых агрегатов, при разработке которого был использован наработанный и очищенный нами белок Sup35NM (результаты опубликованы в статье в журнале Prion, https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19336896.2020.1751574).
Белок OmpA S. enteritidis var. Issatschenko, как и его ортологи из энтеробактерий, представляет собой белок с укладкой типа бета-бочка из группы поринов, белков мембран. Для белков данного семейства характерна вовлеченность в вирулентность и патогенез микроорганизмов, включая участие в образовании биоплёнок и адгезии клеток бактерий к тканям хозяина во время инфицирования. Всё это делает детальное изучение роли амилоидогенеза OmpA в вирулентности S. enteritidis var. Issatschenko чрезвычайно актуальным.
Публикации по результатам выполнения первого года выполнения Проекта (2019-2020 гг.):
1. Belousov M. V., Shikov A. E., Belousova M. E., Nizhnikov A. A., Antonets K. S. Genomic Determinants Underlying Rodenticidal Properties of the Salmonella Enteritidis Var. Issatschenko // Molecular Biology of the Cell, 2019, V.30, № 26 (Suppl. 2019 ASCB Annual Meeting abstracts), P. 2607. doi: 10.1091/mbc.E19-11-0617 (Impact Factor WoS 3.905, Q2 / Impact Factor Scopus 2.78, Q1)
2. Belousov M.V., Kosolapova A.O., Antonets K.S., Nizhnikov A.A. OmpA Porin of Salmonella enterica serovar Enteritidis Possesses Aamyloid-Forming Properties // FASEB Journal, 2020, V.34, Issue S1 (Supplement: Experimental Biology 2020 Meeting Abstracts), P.1-1. doi: 10.1096/fasebj.2020.34.s1.00268 (Impact Factor WoS 5.391, Q1 / Impact Factor Scopus 2.07, Q1)
3. Drozdova P.B., Barbitoff Y.A., Belousov M.V., Skitchenko R.K., Rogoza T.M., Leclercq J., Kajava A.V., Matveenko A.G., Zhouravleva G.A., Bondarev S.A. Estimation of amyloid aggregate sizes with semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis and its limitations // Prion, 2020, V.14 №1, P.118-128. doi: 10.1080/19336896.2020.1751574 (Impact Factor WoS 1.596, Q4 / Impact Factor Scopus 0.76, Q2)
Публикации
1. Дроздова П.Б., Барбитов Ю.А., Белоусов М.В., Скитченко Р.К., Рогоза Т.М., Леклерк Д., Каява А.В., Матвеенко А.Г., Журавлева Г.А., Бондарев С.А. Estimation of amyloid aggregate sizes with semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis and its limitations Prion, V.14, №1, P.118-128 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1080/19336896.2020.1751574
2. Белоусов М.В., Косолапова А.О., Антонец К.С., Нижников А.А. OmpA Porin of Salmonella enterica serovar Enteritidis Possesses Aamyloid-Forming Properties FASEB Journal, V.34, Issue S1, Supplement: Experimental Biology 2020 Meeting Abstracts, P.1-1 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1096/fasebj.2020.34.s1.00268
3. Белоусов М.В., Шиков А.Е., Белоусова М.Е., Нижников А.А., Антонец К.С. Genomic Determinants Underlying Rodenticidal Properties of the Salmonella Enteritidis Var. Issatschenko Molecular Biology of the Cell, V. 30, № 26 (Suppl. 2019 ASCB Annual Meeting abstracts), P. 2607 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1091/mbc.E19-11-0617
Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В рамках второго года выполнения Проекта нами были получены фибриллы белка OmpА бактерии Salmonella enteridis var. Issatschenko. Установлено, что полученные агрегаты устойчивы к воздействию холодных детергентов (2% SDS), а также частично устойчивы к протеолизу (трипсином и пепсином), растворяются муравьиной кислотой. Эти данные были получены как с использованием антител против 6xHis-tag, так и антител против OmpА Salmonella enteridis var. Issatschenko, которые были получены в ходе выполнения Проекта. Далее фибриллы были изучены с использованием просвечивающей электронной и поляризационной микроскопий. Эти методы являются своего рода «золотым стандартом» выявления амилоидных свойств агрегатов, так как позволяют визуализировать фибриллы в первом случае и их яблочно-зеленое свечение при взаимодействии с красителем Конго красный при анализе двойной рефракции в поляризованном свете – во втором. Также проведено масштабное исследование связывания фибрилл OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko с другим красителем – Тиофлавином Т, с использованием методики равновесного микродиализа и конфокальной микроскопии. Результаты показали, что исследуемые образцы белка OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko обладают амилоидогенными участками, и они могут образовывать амилоидные фибриллы in vitro. Возможные биологические роли амилоидных фибрилл мембранных белков бактерий обсуждены нами в обзоре в журнале International Journal of Molecular Sciences, https://doi.org/10.3390/ijms21197240). Чтобы проанализировать способность белка OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko к агрегации в живых клетках, мы использовали систему С-DAG (curli-dependent amyloid generator system) или экстраклеточную систему агрегации на основе Escherichia coli, результаты которой не отличались от положительного контроля (амилоидный белок Sup35NM). Так как нами были получены специфичные поликлональные антитела кролика против OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko, мы смогли показать колокализацию частиц золота, слитых с антителами, с мембраной клеток и фибриллами на их поверхности, что также не оставляет сомнений в фибриллярной природе OmpA бактерии Salmonella enteridis var. Issatschenko. Наконец, для финальной оценки токсичности в отношении клеток макрофагов мышей J774 при инкубации с фибриллами OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko мы провели анализ, который показал снижение выживаемости моноцитов более чем в 15 раз. Аналогичный эксперимент, проведенный на линии моноцитов человека THP-1, не выявил токсичности фибрилл OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko. Таким образом, мы подтвердили и in vivo амилоидные свойства фибрилл OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko, а также показали что они могут являться фактором вирулентности избирательно патогенной против грызунов бактерии Исаченко. При этом, описанная нами токсичность фибрилл OmpA Salmonella enteridis var. Issatschenko в отношении клеток мыши и отсутствие токсичности для клеток человека согласуется с описанным в работах других исследователей строго избирательным эффектом данной сальмонеллы в отношении грызунов.
Публикации по результатам второго года выполнения Проекта (2020-2021 гг.):
1. Kosolapova A.O., Antonets K.S., Belousov M.V., Nizhnikov A.A. Biological Functions of Prokaryotic Amyloids in Interspecies Interactions: Facts and Assumptions // International Journal of Molecular Sciences, 2020. V.21(19), 7240. DOI: 10.3390/ijms21197240 (Impact Factor WoS 4.556, Q1 / Impact Factor Scopus 1.32, Q1)
Публикации
1. Косолапова А.О., Антонец К.С., Белоусов М.В., Нижников А.А. Biological Functions of Prokaryotic Amyloids in Interspecies Interactions: Facts and Assumptions International Journal of Molecular Sciences, 21(19), 7240 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/ijms21197240
Возможность практического использования результатов
Результаты полногеномного секвенирования Salmonella enteridis var. Issatschenko на платформе Oxford Nanopore потенциально могут быть использованы для аннотации новых факторов вирулентности этой бактерии и определения нуклеотидных замен, определяющих специфичность ее действия в отношении грызунов.