Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках подготовительных работ к реализации проекта на первом этапе был проведен анализ современных отечественных и зарубежных публикаций в области эмбриологии, генетики и технологий искусственного оплодотворения крупного рогатого скота (КРС). Была проведена предварительная оценка готовых к использованию коммерческих сред для оплодотворения и выращивания ооцитов КРС и проанализирована их эффективность для работы с клеточным материалом, используемым для генного редактирования. Был проведен анализ эффективности использования сред Continuous Single Culture Complete (Irvine Scientific) и BO-IVM/ BO-IVF/BO-IVC (IVF Bioscience) и BO-IVM/ BO-IVF/BO-IVC. По полученным нами результатам использование среды Continuous Single Culture Complete в комбинации с методом SPOM дозревания позволяло получить около 70% зрелых ооцитов и до 15-20% бластоцист. Применение сред BO-IVM/ BO-IVF/BO-IVC в наших условиях культивирования оказалось не достаточно эффективным. Уровень созревания ооцитов не превышал 60%, и уровень бластуляции составил около 10%. Таким образом, по предварительной оценке оптимальным для работы ооцитами и эмбрионами КРС оказалась среда Continuous Single Culture Complete. По результатам апробации нескольких видов масел для культур эмбрионов - Oil for Embryo Culture (производство Irvine Scientific), Oil for Tissue Culture (Sage) – установили, что оба вида масла можно использовать для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота при выполнении работ по генному редактированию. Для культивирования эмбрионов провели сравнительный анализ двух типов инкубаторов: влажные СО2-инкубаторы с контролируемым уровенем углекислого газа, температуры и влажности и сухие мультигазовые инкубаторы с автоматическим контролем и поддержанием уровней углекислого газа и кислорода, а также температуры. Значимой разницы в количестве дозревших ооцитов и в уровне формирующихся бластоцист при культивировании в обоих типах инкубаторов выявлено не было. Наилучшие результаты были получены при замене среды в инкубаторах, не поддерживающих влажность, на третий и пятый дни развития эмбрионов. По результатам исследований была сформулирована и отработана наиболее эффективная по показателям методика инкубирования с температурным режимом 38,5 С, уровнем углекислого газа 6,5 об.%, кислорода – 5,0 об.%. В ходе работ по проекту была отработана технология отбора, транспортировки яичников и получения из них яйцеклеток непосредственно после убоя крупного рогатого скота, позволяющая получать донорский репродуктивный материал с высоким потенциалом пригодности к генному редактированию. Наиболее оптимальные результаты среди всех опробованных способов дал способ послеубойного забора яичников при температуре среды в 37С с транспортировкой в контролируемой температурной среде и последующей аспирацией фолликулов в лабораторных условиях. Из каждого нестимулированного яичника в среднем получали от 5 до 10 незрелых ооцит-кумулюсных комплексов, содержавших ооциты на стадии GV (GV- germinal vesicle – зародышевый пузырек). Для дальнейших работ требовалось искусственное дозревание ооцитов до стадии метафазы II (MII). Было исследовано две системы дозревания ооцит-кумулюсных комплексов: 24-часового культивирование комплексов при температуре 38.50С, концентрации CO2-6.0-6.5 об.%, рН среды 7,3 в питательной среде, содержащей гормоны, имитирующие пик лютеинизирующего гормона, и метод дозревания ооцитов путем имитации накопления в ооците циклического аденозин монофосфата (цАМФ) – метода SPOM (Simulated Physiological Oocyte Maturation). В первом случае было подобрано наиболее эффективное сочетание гормонов, которое использовали в дальнейшем как основное (50 мкг/мл ХГЧ и 0,5 мкг/мл ФСГ). В результате проведенных сравнительных исследований двух систем дозревания донорских ооцитов крупного рогатого скота, установили, что метод SPOM позволял получить ооциты с более высоким потенциалом пригодности к генным манипуляциям. Использование этого метода обеспечивало уровень формирования ооцитов на стадии MII в 70%, уровень формирования бластоцист – 15-20 %. На данном этапе проводили оценку пригодности полученных клеток к генному вмешательству, зрелость ооцита определяли по наличию первого полярного тела после удаления клеток кумулюса с помощью денудирования в среде, содержавшей гиалуроновую кислоту (0,1%). В рамках работ по проекту были выполнены исследования нескольких способов подготовки сперматозоидов крупного рогатого скота к оплодотворению. При оплодотворении in vitro использовали криоконсервированные сперматозоиды. Для обработки сперматозоидов применяли также метод центрифугирования в градиенте плотности Percoll (Irvine Scientific). После центрифугирования и отмывки сперматозоиды КРС вносили в среду с созревшими ооцит-кумулюсными комплексами. Уровень оплодотворенных ооцитов при этом составлял в среднем 50% от общего количества ооцит-кумулюсных комплексов. При оплодотворении предварительно криоконсервированных ооцитов метод введения единичного сперматозоида внутрь яйцеклетки (ИКСИ). Для инъекции использовали только ооциты на стадии MII, которые выбросили первое полярное тело. В ходе проведенных исследований установили, что ооцитам от крупного рогатого скота одной микроинъекции сперматозоида было недостаточно, успешное формирование зиготы наблюдали у малого числа находившихся в опыте клеток. Уровень оплодотворения не превышал 15%. Для решения этой проблемы нами были применены различные методы, в том числе замораживание-оттаивание сперматозоида с повреждением мембраны, дополнительную преинкубацию со средой с гепарином для увеличения деконденсацию ДНК сперматозоидов, а также дополнительную активацию ооцитов с помощью ионофора кальция, вызывавшего осцилляцию ионов кальция внутри ооцита. Однако значимого различия в уровне оплодотворения не было. Для повышения эффективности данного технологического этапа необходима дальнейшая работа в области оптимизации методов подготовки сперматозоидов и активации ооцита донорского материала крупного рогатого скота. Наилучшие результаты были достигнуты при использовании дитиотреитола, который разрушает дисульфидные связи и способствует нарушению упаковки хроматина в сперматозоидах. Обработка сперматозоидов дитиотриетолом в течение пяти минут перед проведением инъекции в ооцит приводила к увеличению уровня оплодотворения в два раза до 30-35%. В рамках работ по проекту была улучшена система визуализации пронуклеуса в донорском генетическом материале крупного рогатого скота. Оценка эффективности оплодотворения у эмбрионов традиционными методами являлась проблематичной, так как в яйцеклетках коров имеются темные липидосодержащие гранулы, затрудняющие визуализацию пронуклеусов. Для решения данной проблемы нами были использовали различные методы визуализации на поляризационном микроскопе с параллельным фиксированием и окрашиванием выборочных образцов. Также была создана и апробирована методика оценки донорского репродуктивного материала от крупного рогатого скота на пригодность к генному редактированию. Оценка потенциала пригодности к генному редактированию включала в себя анализ материала на всех этапах работ (отбор, дозревание ооцитов, подготовка сперматозоидов, оплодотворение, развитие эмбрионов). Оценку этапа оплодотворения проводили на инвертированном микроскопе Nikon с подогреваемой поверхностью для поддержания температуры среды 38,5 С. Для оценки с ооцита механически очищали клетки кумулюса посредством пипетирования тонким наконечником для денудации диаметром 140 мкм. Очищенные ооциты помещали в среду культивирования под минеральным маслом в инкубатор. Количество оплодотворенных зигот определяли через 48 часов по количеству дробящихся эмбрионов. Проведенные исследования показали, что криоконсервировать яйцеклетки для проведения геномного редактирования возможно как на стадии MII до оплодотворения, так и на стадии зиготы, сформировавшейся после оплодотворения. В ходе работ по проекту проводили витрификацию ооцитов крупного рогатого скота на стадии MII с помощью готовых наборов для витрификации и соломин для витрификации. Была отработана методика оттаивания ооцитов и зигот, и подобраны оптимальные параметры сред и режимов инкубирования для восстановления веретена деления. В результате проведенных работ была достигнута высокая выживаемость ооцитов, составлявшая в среднем 90%, клеточный материал сохранял высокий потенциал пригодности к генному редактированию. В рамках подготовки к исследованиям по второму этапу проекта была проведена серия предварительных работ. Была отработана техника проведения биопсии эмбриона крупного рогатого скота на стадии бластоцисты, необходимая для проведения генетического анализа полученных после редактирования эмбрионов. Также была проанализирована эффективность техники биопсии с помощью системы лазерной диссекции. В результате проведенных работ удалось достичь 100% выживаемости эмбрионов после процедуры биопсии. Были проведены работы, включающие в себя биоинформационный анализ генома КРС и разработку способов нокаутирования генов с помощью CRISPR/Cas9 для создания животных, нокаутных по генам, отвечающим как за модельные признаки, в том числе – комолость, так и за значимые хозяйственные признаки, такие как устойчивость к вирусу лейкоза КРС и пониженный уровень бета-лактоглобулина в молоке. Так же апробирована техника введения системы для редактирования генома эмбрионов КРС на разных этапах развития.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе работ по проекту была усовершенствована технология отбора донорского материала для целей генного редактирования. Были улучшены способы взятия яичников непосредственно после убоя крупного рогатого скота, а также подобраны новые оптимальные параметры транспортировки, обеспечивающие более долгую сохранность материала. Улучшенная технология позволила получить донорский репродуктивный материал с высоким потенциалом к последующему делению и формированию бластоцист. Максимальную сохранность потенциала пригодности к генному редактированию обеспечивали способ забора яичников непосредственно после убоя крупного рогатого скота и транспортировка яичников в лабораторию при контролируемой температуре среды в 38,5 С в течение 3–4 часов. Поддержание данного температурного режима транспортировки в сочетании с подобранными ранее схемами дозревания ооцитов КРС и культивирования эмбрионов позволили увеличить уровень бластуляции дробящихся эмбрионов в два раза (до 30%). В рамках работ по созданию и валидации метода генного редактирования, по созданию, проверке, анализу специфичности работы системы для редактирования генома крупного рогатого скота была проведена серия экспериментов по введению системы генного редактирования на основе технологии CRISPR/Cas9 для нокаута генов бета-лактоглобулина, рецептора CD209, а также внесения аллеля безрогости в область bta1 генома крупного рогатого скота на разных этапах развития эмбриона. Были выполнены точечные сайт-специфические разрывы в геномной ДНК на стадии зиготы методом микроинъекции в цитоплазму с использованием системы CRISPR/Cas9 c sgRNA, направлявшей нуклеазную активность Cas9 в заданное место генома. Были использованы плазмиды на основе вектора pX330, направляющие сгРНК для внесения разрывов в кодирующую область гена CD209, промоторную область гена бета-лактоглобулина, а также конструкция для внесения разрыва в область bta1 - одновременно с одноцепочечной матрицей для репарации с аллелем комолости. Всего было инъецировано около 200 ооцитов, гибель составила 3%, процесс дробления начали не более половины ооцитов. Стадии бластоцисты достигло 6 эмбрионов. Проведенное секвенирование показало, что во всех исследованных эмбрионах, включая замершие в развитии и деградировавшие (всего 21) изменения в геноме отсутствовали. Отрицательный результат, предположительно, был обусловлен высокой летальностью микроинъекции плазмидной ДНК в цитоплазму. Полученные результаты могут указывать на существование целевой или оффтаргент токсичности подобранных сгРНК для генов CD209, bta1, bLG. При этом, различная выживаемость клеток после редактирования может также свидетельствовать в пользу гибели клеток не только от механического воздействия, а именно вследствие эффектов от работы Cas9. Была апробирована технология внесения системы CRISPR/Cas9 c sgRNA в виде плазмидной ДНК совместно со сперматозоидом при микроинъекции в ооцит на стадии MII. Ооцит-кумулюсные комплексы перед проведением интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) предварительно разрушали пипетированием в 0,1% растворе гиалуронидазы, что позволило денудировать ооцит от клеток кумулюса и гранулезы. Для инъекции использовали только ооциты на стадии MII, которые выбросили первое полярное тело. Было обнаружено, что у крупного рогатого скота одной микроинъекции сперматозоида недостаточно для активации ооцита. Введение одного сперматозоида сопровождалось низкой частотой формирования зигот, а уровень оплодотворения не превышал 15%. Были опробованы различные методы, в том числе замораживание-оттаивание сперматозоида с повреждением мембраны, дополнительная преинкубация со средой с гепарином для увеличения деконденсации ДНК сперматозоидов, а также дополнительная активация ооцитов с помощью ионофора кальция.. Примененные методы показали сопоставимую эффективность по уровню оплодотворения, при этом уровни дробления эмбрионов и бластуляции сохраняли в целом умеренные значения. Была апробирована технология введения системы редактирования генома в ооцит крупного рогатого скота с помощью аденоассоциированного вируса, позволяющая избежать травматичных для клетки микроинъекций. Систему CRISPR/Cas9 c sgRNA добавляли в среду культивирования вируса, который в качестве вектора доставлял нужный генетический материал в ооцит. Для отработки этого способа была проведена серия экспериментов по выбору оптимального серотипа аденоассоциированного вируса для заражения ооцитов КРС на стадии зиготы: AAV1, AAV2, AAV6, AAV9, AAVDJ. Аденоассоциированный вирус, содержащий ген зеленого флуоресцирующего белка GFP (Green Fluorescent Protein) вносили в среду культивирования, помещали зиготы крупного рогатого скота в среду с аденовирусом и инкубировали до стадии 8-клеточного эмбриона. Последующее культивирование до бластоцисты выполняли в среде, не содержащей вирус. Успешность трансдукции определяли по зеленой флуоресценции этого белка при возбуждении его синим светом, что сопровождалось свечением клеток эмбриона. Было установлено, что оптимальным вектором оказался серотип аденоассоциированного вируса AAV2, который был затем использован для модельного заражения ооцитов крупного рогатого скота для внесения двуцепочечных разрывов в кодирующую область генов бета-лактоглобулина и рецептора CD209. Была разработана и применена двухкомпонентная смесь ААВ второго серотипа: первый компонент представлял собой вирус, несущий spCas9, второй - вирус несущий сгРНК (лабораторный вектор). Было выполнено модельное редактирование гена бета-лактоглобулина у 45 эмбрионов, из них получено 38 эмбрионов на стадии восьми клеток, 14 эмбрионов достигли стадии бластоцисты (выход составил 31%), остальные остановились в развитии. У 30 эмбрионов было выполнено модельное редактирование гена рецептора CD209, отвечающего за восприимчивость к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. В результате было получено 14 эмбрионов на стадии 8 клеток, 3 из которых достигли стадии бластоцисты (выход составил 10%). Были получены результаты эксперимента по введению матрицы для репарации для внесения аллеля комолости с помощью микроинъекции с последующим заражением клеток ААВ2 с Cas9 и сгРНК к локусу bta1. В целях повышения эффективности редактирования генома ооцитов крупного рогатого скота был проведен комплекс работ по анализу возможности использования Cas9 из S. aureus, подбору альтернативных сгРНК (в связи с изменением PAM сайта) и выполнению доставки Cas9 и сгРНК в составе одного аденоассоциированного вируса второго серотипа. В результате работ, проведенных на данном и предыдущем этапах был разработан набор (Кit) для внесения аллеля комолости в геном хозяйственно-значимых пород крупного рогатого скота. Была усовершенствована технология культивирования эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты. обеспечивающая выживаемость модифицированных эмбрионов и сохранение высокого потенциала приживляемости их при трансплантации. Были изучены и подобраны оптимальные способы культивирования, криоконсервации, отаивания, хранения и транспортировки полученных эмбрионов на животноводческий объект. Была выполнена пробная трансплантация эмбрионов. После отбора коров-рецепиентов проведена подготовка к трансплантации, включавшая в себя введение CIDR, сурфагона и эстрофана для модуляции эндокринно-репродуктивного состояния, индукции созревания фолликулов, овуляции и вызова половой охоты. Трансплантацию эмбрионов выполнили под эпидуральной анестезией, эмбрионы были перенесены в область верхушки рога матки со стороны желтого тела. По итогам проведенного эксперимента один эмбрион был трансплантирован успешно - беременность подтверждена у одной из коров-реципиентов.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Была оптимизирована технология отбора, транспортировки донорского материала и получения из него яйцеклеток непосредственно, позволяющая получать донорский репродуктивный материал с более высоким потенциалом пригодности к генному редактированию. Использование усовершенствованных схем дозревания ооцитов и культивирования эмбрионов позволило сохранить высокий уровень бластуляции дробящихся эмбрионов (около 30%) при длительной, до 4 часов, транспортировке донорского материала. Для накопления ооцитов для выполнения редактирования генома использовали метод криоконсервирования, при этом выживаемость в среднем находилась на уровне 85%. Результаты проведенных исследований показали, что использование усовершенствованных схем дозревания ооцитов, оплодотворения, культивирования эмбрионов и их криоконсервации позволяло сохранить высокий потенциал пригодности клеток к генному редактированию. По итогам начатого на предыдущем этапе эксперимента по трансплантации коровам-реципиентам эмбрионов, прошедших цикл процессинга, один эмбрион был трансплантирован успешно - зафиксировано рождение здорового теленка. Исследовали морфодинамику дробящихся эмбрионов, полученных при дозревании и оплодотворении не стимулированных ооцитов КРС. Установили, что уровень нормального формирования бластоцист составил 22 %, остальные эмбрионы останавливались в развитии на разных этапах. Неравное митотическое деление встречалось у 12% эмбрионов, деление бластомера более чем на две части у 6% эмбрионов, фрагментация у 4% эмбрионов. Аномальное развитие - случаи реабсорбции бластомеров или крупных фрагментов цитоплазмы выявили у 8% эмбрионов, случаи исключения бластомеров из компактизации и формирования бластоцисты – у 6%. Были продолжены работы по исследованию пути введения системы редактирования генома в ооцит крупного рогатого скота с помощью аденоассоциированного вируса. В результате работ, проведенных на данном и предыдущем этапах был разработан набор (Кit) для внесения аллеля комолости в геном хозяйственно-значимых пород крупного рогатого скота. Получены результаты экспериментов по введению системы генного редактирования на основе технологии CRISPR/Cas9 для нокаута генов бета-лактоглобулина, рецептора CD209, а также внесения аллеля безрогости в область bta1 КРС на разных этапах развития эмбриона. Были подобраны гидовые РНК с наименьшим количеством нецелевых сайтов, отсутствием самокомплементарных участков и высоким показателем MIT. Для нокаута гена CD209 гидовые РНК были подобраны на второй экзон этого гена. Для нокаута гена BLG из пяти предложенных алгоритмом CRISPOR вариантов гидовых РНК для промотора гена BLG выбрана наиболее удовлетворяющая условиям эксперимента. В ходе проведенных серий микроинъекций конструкций для редактирования генома ранних эмбрионов крупного рогатого скота было инъецировано около 200 ооцитов, из которых погибло 10%, дробление начали 50% ооцитов, стадии бластоцисты достигло 11 эмбрионов (5,5%). Выжившие эмбрионы (67 шт.) подвергали анализу для оценки эффективности проведенного редактирования. Из всех достигших стадии бластоцисты эмбрионов была выделена геномная ДНК. Секвенирование по Сэнгеру генов интереса в предимплантационных эмбрионах КРС и биоптатах из них показало, что в 5 из 17 эмбрионов, полученных после микроинъекций гидовой РНК против гена BLG и мРНК spCas9 и в 2 из 9 эмбрионов после микроинъекций гидовой РНК против гена CD209 и мРНК spCas9 присутствовали нужные модификации генома, что свидетельствовало о высокой эффективности данного способа доставки системы редактирования. Было установлено, что использование систем редактирования на основе РНК Cas9 является наиболее предпочтительным, так как метод микроинъекций значительно затруднен из-за невозможности визуализации пронуклеусов, а метод вирусных векторов имел сравнительно низкую эффективность и нежелательные побочные эффекты. Результаты анализа заданных модификаций генома у эмбрионов, полученные после микроинъекций гидовой РНК против гена BLG (29,4%) и гена CD209 (22,2%) показали, что доставка системы редактирования в виде РНК spCas9 и гидовых РНК достаточно эффективна и может быть использована для получения нокаутов по генам интереса.