КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 20-12-00297

НазваниеРазработка высокочувствительных нано-биосенсоров для качественного и количественного экспресс-анализа микроорганизмов, а также маркеров социально-значимых заболеваний

РуководительОсминкина Любовь Андреевна, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ 2020 - 2022 

КонкурсКонкурс 2020 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 02 - Физика и науки о космосе, 02-204 - Нано- и микроструктуры

Ключевые словаОптические сенсоры; гигантское комбинационное рассеяние; биосенсор; наноструктуры кремния; наночастицы серебра и золота; микрофлюидные чипы; биомаркеры

Код ГРНТИ76.13.15


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В настоящее время быстрого развития науки и техники остро встает вопрос на направленность применений передовых достижений для целей здравоохранения, а именно для перехода к персонализированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения. В связи с этим актуальной является задача разработки высокочувствительных нано-биосенсоров для качественного и количественного экспресс-анализа микроорганизмов, а также маркеров социально-значимых заболеваний: от низкомолекулярных до белков, вирусов и бактерий в биологических жидкостях. Серьёзный прорыв в области биосенсорики сейчас ожидается от применения для этих целей оптического неинвазивного метода гигантского комбинационного рассеяния (ГКР), поскольку он характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и быстротой получения отклика. Метод ГКР заключается в усилении интенсивности (в миллиарды раз) оптического сигнала комбинационного рассеяния света (КРС) от молекул анализируемого вещества при использовании для регистрации сигнала особых ГКР-активных подложек, содержащих частицы благородных металлов (как правило, золото, серебро, медь). Чувствительность метода напрямую зависит от морфологических особенностей используемых подложек: огромное значение имеет не только форма и размер частиц металлов, но и их расположение в твердотельной матрице - основе сенсорного слоя. Невозможно создать одну универсальную подложку, одинаково “хорошо” усиливающую сигнал различных аналитов (так кратко принято называть анализируемое вещество – от молекул до биообъектов). Поэтому для каждого определенного аналита необходимо создать свою подложку – биосенсор, обладающую необходимой для его идентификации ГКР-активностью. Основными требованиями к ГКР-активным наноструктурам являются их химическая инертность (подложки должны давать аналитический отклик только на определяемые вещества и не вносить свой вклад в анализируемый спектр), высокая чувствительность, воспроизводимость как по отношению к аналитам, так и от сенсора к сенсору, простота получения, стабильность при хранении. Селективность таких подложек во многом обусловлена селективностью используемого метода: разные молекулы анализируемых веществ имеют разный сигнал в спектре ГКР (так называемый “отпечаток пальца” – пик на определенной частоте в спектре). Кроме того, для селективной сорбции аналита, содержащегося в биологической жидкости, поверхность сенсоров может быть покрыта антителами, обеспечивающими комплементарное связывание. Такой подход часто используется при создании микрофлюидных ячеек, где анализ происходит in-situ. Настоящий проект направлен разработку методов получения и изучение физико-химических свойств различных ГКР-активных композитных сенсорных наноматериалов на основе наноструктур кремния с внедренными частицами плазмонных металлов (серебро или/и золото), которые могут применяться для комплексного безметочного определения метаболитов патогенных бактерий, для диагностики вирусов и бактерий в образцах биологических жидкостей, для изучения внутриклеточных процессов, а также определения онкомаркеров. Для каждого исследуемого аналита будет синтезирована и подобрана уникальная ГКР-активная подложка - биосенсор, обеспечивающая его эффективную специфическую сорбцию и максимальное усиление сигнала. На каждом этапе работ будет проведен подробный теоретический анализ механизмов усиления оптических сигналов аналитов, полученных с использованием различных композитных наноструктур. Наличие задействованной на всех этапах работ по проекту мультидисциплинарной научной группы, состоящей из физиков, химиков и биологов - мотивированных студентов и аспирантов, а также опытных сотрудников, обеспечит оптимальное достижение поставленных в проекте инновационных научных задач.

Ожидаемые результаты
Работа по проекту разделена на несколько подзадач. Каждая подзадача представляет отдельную научную ценность и значимость. 1. Будут разработаны новые методы синтеза композитных пористых наноструктур кремния с внедренными частицами металлов золото, серебро, либо биметаллов золото/серебро для изготовления на их основе ГКР-активных нанобиосенсоров. Пористые наноструктуры будут получены электрохимическим или металл-стимулированным химическим травлением пластин монокристаллического кремния. Для получения упорядоченных наноструктур заданной морфологии травление будет осуществляться в том числе с использованием литографических масок. Покрытие полученных пористых кремниевых матриц серебом и/или золотом будет проводится путем химического восстановления металлов из соли серебра/хлорида золота, что обеспечит получение наноструктур различных морфологий – от пористых пленок покрытых наночастицами металлов, декорированных биметаллом кремниевых нанонитей, до дендритных наноструктур биметаллов различных морфологий. Впервые в настоящем проекте авторы будут использовать недавно открытый ими (но еще не опубликованный) способ получения кремниевых нанонитей с использованием в качестве катализаторов травления золотых наночастиц. 2. Будет осуществлен поиск оптимальных структурных и оптических параметров образцов сенсорных элементов для диагностики бактериальных инфекций на примере детектирования инвазивного белка интерналина В (InlB), выступающего в качестве маркера патогенной бактерии Listeria monocytogenes, по изменениям оптических ГКР-спектров с использованием полученных ГКР-активных подложек. Сорбция белка будет осуществляться как из растворов PBS, так и образцов сыворотки крови зараженных животных. Будут определены нижние пределы чувствительности биосенсоров. Полученные результаты будут сравниваться с пределами обнаружения аналита в тех же условиях, но с использованием метода ИФА. 3. Будет осуществлен поиск оптимальных структурных и оптических параметров образцов сенсорных элементов для диагностики внутриклеточных процессов, в частности детектирования цитохрома С и других маркеров апоптоза в живых клетках. Для этих целей планируется с использованием литографических методов разработать методику получения декорированных золотыми наночастицами упорядоченных кремниевых нанонитей. Полученные подложки с нанонями будут изучены на предмет цитотоксичности по отношению к клеткам различной этимологии (3T3NIH, Hep2, MCF-7). Морфология нанонитей будет подобрана таким образом, чтобы при инкубировании клеток, нанонити полностью пронизывали тело клеток, не нанося при этом токсических эффектов. Быстрота получения сенсорного отклика обеспечит возможность получения оптических сигналов от живых клеток. 4. Будет осуществлен поиск оптимальных структурных и оптических параметров образцов сенсорных элементов для диагностики вирусов на примере вируса гриппа H1N1. Сорбция вируса будет осуществляться из растворов PBS, так и из биологических жидкостей на примере искусственной слюне и искусственной мокроты. Для селективной сорбции вирусов пластинки будут покрыты антителами. Будет проводится сравнение чувствительности сенсоров без и с присутствием антител. Подложки, показывающую наибольшую чувствительность ГКР сигналов будут выбраны в качестве биосенсоров. Будут изучены также и фильтрационные свойства выбранных биосенсоров. В результате будет разработана подложка-биосенсор, обладающая свойствами эффективной сорбции и диагностики вирусов. 5. Будут разработаны с использованием литографических подходов подложки макропористого кремния, декорированного биметаллическими наночастицами золото/серебро для диагностики бактерий на примере непатогенных бактерий E.сoli и Listeria. Сравнение селективности сорбции бактерий и чувствительности сенсоров без и с присутствием антител также будет изучено. Указанные подложки будут использованы как основа микрофлюидных ГКР-активных чип-анализаторов. С помощью разрабатываемых чипов планируется разработать систему не только для диагностики бактерий in-situ, но и отработать методику по оценке чувствительности бактерий к воздействию на них различных антибиотиков. 6. Будут разработаны ГКР-активные подложки на основе композитных наноструктур кремний/золото/серебро для целей безметочной диагностики белок-белковых взаимодействий на примере антигена 125 (CA-125) - белка, используемого в качестве онкомаркера рака яичников и его метастазов. Будут отработаны методы химической модификации поверхности наносенсоров для ковалентного связывания с белками онкомаркеров. Сорбция СА 125 будет осуществляться как из растворов PBS, так и из сыворотки крови. 7. На каждом этапе работ будут промоделированы оптические свойства разработанных ГКР-активных нано-биосенсоров в среде Comsol, рассчитаны спектры поглощения, пространственное распределение локальных полей в нанокомпозитах. Спектры отражения и пропускания будут рассчитаны с помощью матрицы рассеяния путем нахождения собственных значений и собственных функций оператора квазимомента фотона. Интенсивности КРС будут рассчитаны через сумму мощностей осциллирующих диполей, расположенных случайным образом внутри нанокомпозитов, взаимодействующих с плазмонами, возбуждаемыми также в случайно расположенных металлических наночастицах. Будет учтено влияние горячих точек (англ. - hot spots) на спектры КРС. Полученные результаты заложат научные основы для клинических испытаний новых ГКР-активных нано-биосенсоров, использование которые позволит повысить эффективность диагностики социально-значимых заболеваний, что в свою очередь приведет к повышению эффективности лечения как вирусных и бактериальных инфекций, так и онкозаболеваний, улучшению качества жизни граждан, сокращению расходов на здравоохранение. Результаты будут соответствовать мировому уровню, будут опубликованы в международных признанных журналах с высокими индексами цитирования. Помимо практической значимости, выполнение проекта позволит расширить фундаментальные представления о молекулярно-биологических процессах в клетках.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Разработаны новые методы синтеза композитных пористых наноструктур кремния с внедренными частицами металлов золото, серебро, либо биметаллов золото/серебро для изготовления на их основе ГКР-активных нанобиосенсоров. Пористые наноструктуры были синтезированы электрохимическим или металл-стимулированным химическим травлением пластин монокристаллического кремния с различным удельным сопротивлением. При электрохимическом травлении монокристаллического кремния использовались токи различных плотностей. Использовать при травлении различные концентрации травящих растворов. Для изготовления ГКР-активных подложек в том числе использован способ получения кремниевых нанонитей с использованием в качестве катализаторов травления золотых наночастиц. Отработаны литографические методы получения пористых упорядоченных наноструктур заданной морфологии. В результате получены наноструктурированные пленки кремния с различными диаметрами пор, с различной толщиной, и различной пористости. Изучены структурные свойства полученных наноструктур с помощью сканирующей электронной микроскопии. Пористость изучена методом изотерм адсорбции азота и обработкой СЭМ изображений. Изучены свойства гидрофильности-гидрофобности получаемых поверхностей. Отработаны методики покрытия полученных пористых кремниевых матриц серебряными или золотыми наночастицами (НЧ Ag, НЧ Au), а также биметаллическими наночастицами (НЧ Ag@Au) путем химического восстановления металлов из соли серебра и хлорида золота. Изучены структурные и ГКР-активные свойства полученных композитных материалов. Впервые показано, что размер пор в слое пористого кремния (PSi) может быть важным параметром при использовании его в качестве матрицы для создания поверхностей с усиленным комбинационным рассеянием (КР). Проведена оценка ГКР-активности PSi с порами размером от мезо до макро, поверхность которых была покрыта наночастицами золота (НЧ Au). Экспериментально и теоретически доказано, что разные диаметры пор в слоях PSi обеспечивают различную морфологию золотого покрытия, от почти монослоя до расстояния 50 нм между наночастицами. Метиленовый синий (MB) и 4-меркаптопиридин (4-MPy) были использованы для оценки ГКР-активности полученных поверхностей Au/PSi. Показано, что наилучшее усиление сигнала КР света наблюдается, когда внутренний диаметр торообразных НЧ Au составляет около 35 нм. Проведен экспериментальный поиск оптимальных структурных и оптических параметров изготовленных образцов для диагностики бактериальных инфекций на примере детектирования инвазивного белка интерналина В (InlB), выступающего в качестве маркера патогенной бактерии Listeria monocytogenes. Для этого экспериментально были подобраны параметры эффективной сорбции белка из его водных растворов. Исследовалась возможность детектирования ГКР сигнала InlB на подложках различной морфологии. Наилучший сигнал наблюдался при сорбции белка на подложки Ag@Au/SiNWs при инкубации в PBS. Нижний предел чувствительности биосенсора составляет 10-8 M, что соответствует пределам обнаружения белка в тех же условиях методом ИФА. Чтобы понять роль плазмонных резонансов в спектрах ГКР разработанных композитных наноматериалов, проведено теоретическое моделирование интенсивности КР света как функции внутреннего диаметра пор PSi. Показано, что результаты моделирования согласуются с полученными экспериментальными данными. По результатам работ в 2020 году написано 2 статьи в рецензируемых высокорейтинговых журналах (одна статья опубликована в журнале Q1, одна статья находится на стадии рецензирования). Результаты работ представлены в 5 докладах на международных и российских научных конференциях (4 устных и 2 стендовых доклада). К работам активно привлечены студенты и аспиранты.

 

Публикации

1. Алексеева Е.А., Карташова А.Д., Гончар К.А., Осминкина Л.А. Gold‐coated silicon nanowire arrays for molecular sensing using surface‐ enhanced Raman spectroscopy 9th European Nanoanalysis Symposium "Nano-scale materials characterization - Advances in data acquisition and data analysis" Abstract booklet, - (год публикации - 2020).

2. Гончар К.А., Моисеев Д.В., Божьев И.В., Агафилушкина С.Н., Осминкина Л.А. Взаимодействие вируса гриппа H1N1 с пористым слоем кремниевых нанонитей НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ ЛОМОНОСОВСКИЕ ЧТЕНИЯ Секция физики Октябрь 2020 года Сборник тезисов докладов, - (год публикации - 2020).

3. Карташова А.Д., Алексеева Е.А. Композитные наноструктуры кремниевые нанонити / наночастицы золота для молекулярной сенсорики с использованием спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния света Научная программа Всероссийской школы молодых ученых «КоМУ-2020», - (год публикации - 2020).

4. Карташова А.Д., Алексеева Е.А., Божьев И.В., Гончар К.А., Осминкина Л.А. Композитные наноструктуры Au@SiNWs для молекулярной сенсорики с использованием спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния света ПРОГРАММА 63-й Всероссийской научной конференции МФТИ 23–29 ноября 2020, - (год публикации - 2020).

5. Моисеев Д.В., Гончар К.А., Божьев И.В., Осминкина Л.А. Structural and photoluminescent properties of porous silicon nanowires fabricated by metal-assisted chemical etching: influence of H2O2 concentration 9th European Nanoanalysis Symposium "Nano-scale materials characterization - Advances in data acquisition and data analysis" Abstract booklet, - (год публикации - 2020).

6. Светлана Н. Агафилушкина, Ольга Жуковская, Сергей А. Дьяков, Карина Вебер, Владимир Сиваков, Юрген Попп, Дана Сиала-Мэй, Любовь А. Осминкина Raman Signal Enhancement Tunable by Gold-Covered Porous Silicon Films with Different Morphology MDPI Multidisciplinary Digital Publishing Institute, - (год публикации - 2020).