КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 20-13-00195

НазваниеРазработка высокочувствительных аналитических систем на основе люминесцентных и гибридных наночастиц для экспрессного определения кардиомаркеров в крови

РуководительГорячева Ирина Юрьевна, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского", Саратовская обл

Годы выполнения при поддержке РНФ 2020 - 2022 

КонкурсКонкурс 2020 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-205 - Аналитическая химия

Ключевые словаклинические анализы, тест-методы, иммунохроматографический анализ, биомодификация, люминесценция, иммуноанализ, квантовые точки, конъюгация, кардиомаркеры

Код ГРНТИ31.19.00


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Ежегодно в мире от сердечно-сосудистых заболеваний умирает 17 миллионов человек. По данным ВОЗ 80 % преждевременных инфарктов и инсультов может быть предотвращено за счет здорового образа жизни, воздержания от употребления табачных изделий, а так же своевременной диагностики и лечения. В связи с этим важна возможность диагностики сердечной недостаточности еще до проведения инструментального обследования. Оперативная постановка диагноза и своевременное начало лечения позволяют не только сохранить жизнь, здоровье и трудоспособность человека, но и сократить затраты на здравоохранение и последующую реабилитацию. Разработка основ высокотехнологичного здравоохранения и технологий здоровьесбережения находятся в русле Стратегии научно-технологического развития России до 2035 года. В связи с этим разработка эффективных детектирующих систем и их применение для создания высокочувствительных средств экспресс-определения содержания высокоинформативных биомаркеров является актуальной задачей. Проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы, заключающейся в создании новых детектирущих систем на основе люминесцентных и гибридных наночастиц с контролируемыми свойствами и подходов к их применению для высокочувствительных средств экспресс-диагностики. Данная проблема важна для аналитической химии и медицинской диагностики. В качестве биомаркеров будут использованы мозговой натрийуретическй пептидный гормон (BNP, МНП) и его N-концевой фрагмент (NT-proBNP, NT-проМНП), являющиеся высокоинформативными маркерами функционального состояния сократительного потенциала сердечной мышцы, который используют при диагностике сердечной недостаточности, в том числе ее ранних стадий. Применение новых подходов, основанных на использовании стабильных в воде коллоидов люминесцентных квантовых точек (КТ) с улучшенными свойствами, модифицированных золотых наночастиц, магнитных наночастиц, наноструктур, содержащих органические люминофоры и комплексы ионов редкоземельных элементов с долгоживущей люминесценцией, позволит разработать комплекс методик экспресс-определения BNP/NT-proBNP в пробах цельной крови с высокой чувствительностью и в широком диапазоне определяемых концентраций. В качестве механизма модуляции люминесцентного сигнала КТ будет использован Ферстеровский резонансный перенос энергии (ФРПЭ, FRET) с участием наночастиц. Научная новизна проекта состоит в проведении комплекса исследований на переднем крае развития науки и техники по направленному синтезу наночастиц с контролируемыми свойствами и их применению при разработке новых форматов клинического анализа. В ходе выполнения проекта будут совмещены достижения нанотехнологии, биохимии, нанобиофотоники с целью создания индикаторных систем для иммунохимических экспресс-методов определения клинически значимых биомаркеров с перспективой применения достигнутых результатов для расширения круга определяемых веществ. Таким образом, реализация проекта позволит вывести на принципиально новый уровень возможности применения люминесцентных меток для повышения чувствительности клинических анализов. В основу проекта ляжет направленная оптимизация пары донор-акцептор энергии ФРПЭ для достижения максимальной чувствительности аналитического сигнала в присутствии целевого аналита и разработка методов высокочувствительной экспресс-диагностики. Идеальный тест для клинической диагностики point-of-care должен быть одностадийным (например, без этапов промывки и разделения), чувствительным (обнаружение низких концентраций, соответствующих клиническому диапазону, либо ниже его), специфическим (распознавание родственных соединений в сложных смесях), быстрым (взаимодействие преимущественно в жидкой фазе и быстрое измерение), воспроизводимым (низкие коэффициенты вариации), стабильным (метки и иммунореганеты должны быть стабильные при хранении и в условиях анализа), простым в использовании (без сложной подготовки), мультиплексным (одновременное измерение нескольких аналитов) и универсальным (универсальный формат, который можно расширить для определения других биомаркеров путем замены иммунореганетов). Этим требованиям отвечают иммунохроматографический анализ и гомогенный анализ на основе модуляции люминесцентных сигналов, в частности, ФРПЭ. В ходе проекта предполагается применение новых оригинальных подходов для: (а) получения КТ (нетоксичных водных коллоидов КТ AgInS2/ZnS с высоким квантовым выходом люминесценции, стабилизированных полимерами и оболочками оксида кремния КТ CdSe/CdS/ZnS, как бинарных так и сплавных) для усиления сигнала сенсора; (б) получения наносистем с гибридными свойствами на основе наночастиц золота (люминесцентные, магнитные свойства); (в) систематической оптимизации пары донор-акцептор ФРПЭ на основе вариации архитектуры полученных наноматериалов и конъюгатов; (г) разработки на основе этих наноматериалов новых аналитических систем, а так же установлении закономерностей их функционирования. Результаты достижимы, поскольку у коллектива проекта существует достаточный научный задел по всем ключевым направлениям «базы» проекта. Авторы имеют подтвержденный успешно выполненными проектами и публикациями в журналах первого квартиля опыт получения люминесцентных наночастиц (полупроводниковые КТ, получаемые методами высокотемпературного и водного синтезов; углеродные наноструктуры, получаемые методом гидротермального синтеза; комплексы редкоземельных элементов с долгоживущей люминесценцией), модификации свойств КТ и других наночастиц, получения гибридных наночастиц и наноструктур, их биоконъюгации и применения в анализе (метка для иммуноанализа, донор для переноса энергии), разработки и валидации новых форматов тест-методов, разработки тест-методов, определения биологически активных соединений различной природы. Это дает авторам проекта преимущество в виде высокой вариабельности исследуемых параметров, возможность оптимизировать каждый этап работ, следовать вновь появляющимся в процессе выполнения проекта мировым тенденциям и предвосхищать их. Авторы имеют большой опыт выполнения научных проектов, в том числе в составе коллабораций, в том числе международных. Успешное выполнение этих проектов, серьезный научный задел, разносторонний бэкграунд, а также высокая публикационная активность подтверждают получение запланированных результатов в полном объеме. Авторы проекта имеют необходимые для выполнения проекта оборудование и инфраструктуру.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта: Будут разработаны фундаментальные основы создания принципиально новых и соответствующих мировому уровню компонентов пары донор энергии-акцептор энергии - функционализированные люминесцентные КТ и гибридные наночастицы, характеризующиеся контролируемыми свойствами, высокой коллоидной стабильностью, небольшим размером (до 10 нм для люминесцентных структур), многофункциональностью (люминесцентные, плазмонные, магнитные свойства), низкой токсичностью, высокой эффективность ФРПЭ; Полученные оптимальные системы будут использованы при разработке иммунохимических методов и тест-методов определения кардиомаркеров в крови. Будут разработаны аналитические иммунохимические тест-методы (иммунохроматографический тест и гомогенный анализ) определения кардиомаркеров BNP и NT-proBNP в крови, основанные на модуляции сигнала люминесцентных КТ за счет ФРПЭ при образовании сэндвич-иммунокомплекса с определяемым веществом, установлены оптимальные пары донор-акцептор, целенаправленно выбраны оптимальные конъюгаты специфических антител с наночастицами, установлены подходы к наиболее информативной регистрации аналитического сигнала; будут оценены достоинства и ограничения предложенных подходов. Методы внелабораторной экспресс-диагностики кардиомаркеров BNP и NT-proBNP в кровиа будут использованы для анализа клинических образцов. BNP NT-proBNP являются наиболее чувствительными маркерами острой и хронической сердечной недостаточности, их уровень коррелирует с тяжестью и функциональным классом сердечно-сосудистой недостаточности, увеличиваясь пропорционально угрозе остановке сердца и является прогностическим показателем летального исхода. Будут выявлены дальнейшие направления развития предложенных подходов, в которых созданные системы будут использованы для определения других клинически значимых маркеров. Разрабатываемая система аналитических платформ не имеет аналогов в мировой литературе и практических исследованиях. Будет рассмотрена возможность применения математических алгоритмов для повышения чувствительности определения. Универсальность результатов связана с возможностью распространения полученных подходов для определения других клинически значимых соединений. Проведенные исследования заложат основу создания нового поколения средств клинической экспресс-диагностики. Ожидаемые результаты будут иметь высокую научную, практическую, экономическую и социальную значимость для нашей страны, поскольку в настоящее время практически все современные диагностические приборы и расходные материалы для экспресс-диагностики кардиомаркеров представлены ведущими производителями Западной Европы, либо США. Использование зарубежных систем экспресс-диагностики в такой значимой области как диагностика заболеваний сердечно-сосудистой системы, несет в себе риски, делая актуальным отечественные разработки в данной сфере. Так же результаты важны для дальнейшего развития предлагаемых принципиально новых подходов в ведущих лабораториях мира.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Разработка новых высокочувствительных селективных систем и тест-систем детектирования кадриомаркеров в крови и сыворотке крови является важной задачей. Решающую роль играет разработка оптимальных детекторных меток. Работы, направленные на использование люминесцентных полупроводниковых квантовых точек (КТ) в качестве меток ведутся достаточно давно и весьма успешно. При этом крайне важно провести систематическое исследование различных по природе КТ, а так же КТ одинаковой природы, но обладающих разными размерами и спектральными свойствами для того, чтобы установить оптимальные для применения в сложных реальных матрицах, таких как цельная кровь и сыворотка крови человека. В данном проекте проведен синтез нескольких типов КТ, рассмотрены различные варианты их гидрофилизации, выбор КТ с отличающимися спектральными характеристиками, конъюгирование с антителами и проверка конъюгатов. Большое внимание уделено эффектам матрицы крови и сыворотки крови на КТ с целью установить оптимальные для анализа кардиомаркеров в крови КТ. Особенно важна тонкая настройка свойств люминесцентной метки при определении и таких сложных аналитов как кардиомаркеры NT-proBNP и BNP. В крови присутствует целый коктейль родственных пептидов. Поэтому при их анализе важен как подбор иммунореагентов, преимущественно обеспечивающих селективность, так и выбор меток и архитектура конъюгатов, обеспечивающих чувствительность. В первый год выполнения проекта получены следующие основные результаты: 1. Получены серии фракций КТ AgInS/ZnS с отличающимися оптическими свойствами, испусканием в видимой и ближней ИК области спектра, средний размер которых изменяется от 4 до 2 нм и менее. Уменьшение размера приводит к синему смещению максимума люминесценции и увеличению ее интенсивности, что позволяет получать серию ярких КТ с цветом свечения, варьирующимся от темно-красного до голубовато-зеленого. При этом с увеличением номера фракции наблюдается увеличение КВ 11% до 58%. 2. Получены КТ на основе селенида кадмия различной структуры: стандартные КТ ядро/оболочки, а так же так называемые сплавные (alloyed) КТ. Произведён трёхэтапный высокотемператруный органический синтез коллоидных КТ структуры ядро/оболочка на основе полупроводниковых материалов состава CdSe/CdS и CdSe/CdS/ZnS с использованием медленного многоступенчатого впрыскивания прекурсоров и квантовым выходом до 73 %. КТ состава CdSe/CdS и CdSe/CdS/ZnS переведены в водный коллоид методом лигандного обмена с использованием силоксанов, содержащих функциональные карбоксильные и глицидокси группы для биоконьюгации. Формирование сплавных КТ ядро-оболочка состава CdZnSeS/ZnS осуществлено методом высокотемпературного металлоорганического синтеза. Гидрофилизацию проводили путем покрытия КТ амфифильным полимером ПМАО-ДМ1000, синтез которого был разработан ранее, либо дигидролипоевой кислотой. Для дальнейшего конъюгирования использовали карбоксильные группы. 3. Охарактеризованы спектральные и коллоидные свойства полученных КТ. Установлены параметры, обеспечивающие максимальную интенсивности сигналов КТ. Показано отсутствие цитотоксического воздействия на клетки водных коллоидов всех полученных КТ. Проведена систематическая оценка влияния матрицы крови (цельной крови и сыворотки) на коллоидную стабильность и интенсивность люминесценции синтезированных КТ установлено, что работа с цельной кровью приводит к более сильному снижению люминесценции КТ по сравнению с сывороткой крови в тех же разбавлениях. Все исследованные образцы КТ сохраняют коллоидную стабильность и в цельной крови, и в сыворотке, независимо от разведения. При этом, КТ состава CdZnSeS/ZnS, а так же КТ AIS/ZnS с максимумом испускания 638 нм позволяют детектировать люминесцентный сигнал при минимальном разведении матрицы. 4. Осуществлена конъюгация полученных КТ AIS/ZnS с максимумом испускания 638 нм с антителами, специфическими к NT-proBNP и BNP. Конъюгаты КТ - специфические антитела проверяли связыванием с иммобилизованными в лунки микропланшета, либо на иммунохроматографической мембране антивидовыми антителами. В обоих форматах продемонстрировано эффективное специфическое связывание. Найдены работоспособные сэндвич системы определения NT-proBNP. Полученные результаты составят надежную базу для разработки и оптимизации иммунохимических методов определения NT-proBNP и BNP в крови, запланированных на 2021 год. В завершающей стадии находится подготовка обзора литературы по методам определения кардиомаркеров BNP и NT-proBNP в крови, плазме и сыворотке. Ведется подготовка материалов для статей на основе полученных экспериментальных результатов. Сделаны приглашенный и устный оклад на международных конференциях. Все запланированные результаты получены в полном объеме.

 

Публикации


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Основные работы направлены на оптимизацию и изучение компонентов систем, основанных на модуляции сигналов люминесценции, их реализации в формате иммунохроматографических тест-методов и гомогенном формате. Разработана высокоэффективная методика гидрофилизации КТ меркаптосоединениями. Определена оптимальная композиция КТ для применения в системах, основанных на тушении люминесценции при взаимодействии с ферментативно генерируемым тушителем – КТ состава CdZnSeS/ZnS. Определен приоритет разработки эффективных иммунореагентов на основе ферментов и антител. Разработан набор акцепторов для систем ферстеровского резонансного переноса энергии на основе золотых наночастиц, модифицированных цитратом натрия, углеродными наноструктурами, полученными гидротермальным методом из биологически активных соединений – биотина (витамин В7), и так же лимонной кислоты и этилендиамина. Показана возможность формирования гибридных структур на основе золотых наночастиц и углеродных наноструктур, а также золотых и магнитных частиц. Получены золотые наночастицы, модифицированные биотином, а также конъюгаты этих наночастиц с антителами путем нековалентного связывания за счет технологии «click-chemistry» между стрептавидином в составе комплекса с биотинилированными антителами. Разработаны методики твердофазного люминесцентного имуноанализа определения BNP и NT-proBNP. Установлены оптимальные варианты конъюгации и пары меченых антител для каждого из форматов иммуноанализа. Получены значения констант Штерна-Фольмера тушения флуоресценции, показано, что взиаимодействие в система носит динамических характер. Значения констант Штерна-Фольмера тушения флуоресценции КТ составили: 1.7 * 107 M-1 (для константы, полученной на основе измерения интенсивности) и 1.5 * 107 M-1 (для константы, полученной на основе измерения кинетики затухания). Данные значения указывают на то, что данные системы не являются оптимальными для использования в аналитических целях. Разработаны подходы к включению КТ в нановолокна для дальнейшего использования в тест-зоне иммунохроматографических тестов и определению аналитов на основе Ферстеровского резонансного переноса энергии. Разработаны иммунохроматографические тесты и варианты гомогенного анализа с использованием оптимальных пар имунореганетов. Минимальное значение концентрации NT-proBNP, которое можно было распознать визуально составило 2 нг/мл. Показана возможность использования лиофильной сушки реагентов (конъюгаты наночастиц с антителами) без потери работоспособности систем. Разработанная методика «ускоренной» модификафии КТ позволяющая заменить 6–10 часовую инкубацию при нагревании до 30 мин обработки в УЗ ванне, а также добиться более глубокого замещения лигандов. Подготовлены две статьи в изжаниях первого квартилы (Trends in Analytical chemistry, импакт-фактор 12,292 и Analytical and Bioanalytical Chemistry, импакт фактор 4.142) и одна в реферируемом в реферируемом в WOS & Scopus сборнике). Результаты работ доложены в виде четырех докладов (два устных).

 

Публикации

1. Горячева О.А., Пономарева Т.Д., Дрозд Д.Д., Кокорина А.А., Русанова Т.Ю., Мишра П.К., Горячева И.Ю. Heart failure biomarkers BNP and NT-proBNP detection using optical labels TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2022, 146, 116477 (год публикации - 2022).

2. Кокорина А.А., Ращевская Р.О., Горячева И.Ю. Nets of biotin-derived gold nanoparticles as a label for the C-reactive protein immunoassay Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2021, 413, 27, 6867 – 6875 (год публикации - 2021).

3. Строкин П.Д., Дрозд Д.Д., Цюпка Д.В., Мошков А.С., Горячева И.Ю. 2-mercaptoethanol and dihydrolipoic acid biligandcoated alloyed quantum dots Proceedings of SPIE, 11845, Saratov Fall Meeting 2020: Optical and Nanotechnologies for Biology and Medicine, 1184517 (год публикации - 2021).