Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Разработка новых высокочувствительных селективных систем и тест-систем детектирования кадриомаркеров в крови и сыворотке крови является важной задачей. Решающую роль играет разработка оптимальных детекторных меток. Работы, направленные на использование люминесцентных полупроводниковых квантовых точек (КТ) в качестве меток ведутся достаточно давно и весьма успешно. При этом крайне важно провести систематическое исследование различных по природе КТ, а так же КТ одинаковой природы, но обладающих разными размерами и спектральными свойствами для того, чтобы установить оптимальные для применения в сложных реальных матрицах, таких как цельная кровь и сыворотка крови человека. В данном проекте проведен синтез нескольких типов КТ, рассмотрены различные варианты их гидрофилизации, выбор КТ с отличающимися спектральными характеристиками, конъюгирование с антителами и проверка конъюгатов. Большое внимание уделено эффектам матрицы крови и сыворотки крови на КТ с целью установить оптимальные для анализа кардиомаркеров в крови КТ. Особенно важна тонкая настройка свойств люминесцентной метки при определении и таких сложных аналитов как кардиомаркеры NT-proBNP и BNP. В крови присутствует целый коктейль родственных пептидов. Поэтому при их анализе важен как подбор иммунореагентов, преимущественно обеспечивающих селективность, так и выбор меток и архитектура конъюгатов, обеспечивающих чувствительность. В первый год выполнения проекта получены следующие основные результаты: 1. Получены серии фракций КТ AgInS/ZnS с отличающимися оптическими свойствами, испусканием в видимой и ближней ИК области спектра, средний размер которых изменяется от 4 до 2 нм и менее. Уменьшение размера приводит к синему смещению максимума люминесценции и увеличению ее интенсивности, что позволяет получать серию ярких КТ с цветом свечения, варьирующимся от темно-красного до голубовато-зеленого. При этом с увеличением номера фракции наблюдается увеличение КВ 11% до 58%. 2. Получены КТ на основе селенида кадмия различной структуры: стандартные КТ ядро/оболочки, а так же так называемые сплавные (alloyed) КТ. Произведён трёхэтапный высокотемператруный органический синтез коллоидных КТ структуры ядро/оболочка на основе полупроводниковых материалов состава CdSe/CdS и CdSe/CdS/ZnS с использованием медленного многоступенчатого впрыскивания прекурсоров и квантовым выходом до 73 %. КТ состава CdSe/CdS и CdSe/CdS/ZnS переведены в водный коллоид методом лигандного обмена с использованием силоксанов, содержащих функциональные карбоксильные и глицидокси группы для биоконьюгации. Формирование сплавных КТ ядро-оболочка состава CdZnSeS/ZnS осуществлено методом высокотемпературного металлоорганического синтеза. Гидрофилизацию проводили путем покрытия КТ амфифильным полимером ПМАО-ДМ1000, синтез которого был разработан ранее, либо дигидролипоевой кислотой. Для дальнейшего конъюгирования использовали карбоксильные группы. 3. Охарактеризованы спектральные и коллоидные свойства полученных КТ. Установлены параметры, обеспечивающие максимальную интенсивности сигналов КТ. Показано отсутствие цитотоксического воздействия на клетки водных коллоидов всех полученных КТ. Проведена систематическая оценка влияния матрицы крови (цельной крови и сыворотки) на коллоидную стабильность и интенсивность люминесценции синтезированных КТ установлено, что работа с цельной кровью приводит к более сильному снижению люминесценции КТ по сравнению с сывороткой крови в тех же разбавлениях. Все исследованные образцы КТ сохраняют коллоидную стабильность и в цельной крови, и в сыворотке, независимо от разведения. При этом, КТ состава CdZnSeS/ZnS, а так же КТ AIS/ZnS с максимумом испускания 638 нм позволяют детектировать люминесцентный сигнал при минимальном разведении матрицы. 4. Осуществлена конъюгация полученных КТ AIS/ZnS с максимумом испускания 638 нм с антителами, специфическими к NT-proBNP и BNP. Конъюгаты КТ - специфические антитела проверяли связыванием с иммобилизованными в лунки микропланшета, либо на иммунохроматографической мембране антивидовыми антителами. В обоих форматах продемонстрировано эффективное специфическое связывание. Найдены работоспособные сэндвич системы определения NT-proBNP. Полученные результаты составят надежную базу для разработки и оптимизации иммунохимических методов определения NT-proBNP и BNP в крови, запланированных на 2021 год. В завершающей стадии находится подготовка обзора литературы по методам определения кардиомаркеров BNP и NT-proBNP в крови, плазме и сыворотке. Ведется подготовка материалов для статей на основе полученных экспериментальных результатов. Сделаны приглашенный и устный оклад на международных конференциях. Все запланированные результаты получены в полном объеме.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Основные работы направлены на оптимизацию и изучение компонентов систем, основанных на модуляции сигналов люминесценции, их реализации в формате иммунохроматографических тест-методов и гомогенном формате. Разработана высокоэффективная методика гидрофилизации КТ меркаптосоединениями. Определена оптимальная композиция КТ для применения в системах, основанных на тушении люминесценции при взаимодействии с ферментативно генерируемым тушителем – КТ состава CdZnSeS/ZnS. Определен приоритет разработки эффективных иммунореагентов на основе ферментов и антител. Разработан набор акцепторов для систем ферстеровского резонансного переноса энергии на основе золотых наночастиц, модифицированных цитратом натрия, углеродными наноструктурами, полученными гидротермальным методом из биологически активных соединений – биотина (витамин В7), и так же лимонной кислоты и этилендиамина. Показана возможность формирования гибридных структур на основе золотых наночастиц и углеродных наноструктур, а также золотых и магнитных частиц. Получены золотые наночастицы, модифицированные биотином, а также конъюгаты этих наночастиц с антителами путем нековалентного связывания за счет технологии «click-chemistry» между стрептавидином в составе комплекса с биотинилированными антителами. Разработаны методики твердофазного люминесцентного имуноанализа определения BNP и NT-proBNP. Установлены оптимальные варианты конъюгации и пары меченых антител для каждого из форматов иммуноанализа. Получены значения констант Штерна-Фольмера тушения флуоресценции, показано, что взиаимодействие в система носит динамических характер. Значения констант Штерна-Фольмера тушения флуоресценции КТ составили: 1.7 * 107 M-1 (для константы, полученной на основе измерения интенсивности) и 1.5 * 107 M-1 (для константы, полученной на основе измерения кинетики затухания). Данные значения указывают на то, что данные системы не являются оптимальными для использования в аналитических целях. Разработаны подходы к включению КТ в нановолокна для дальнейшего использования в тест-зоне иммунохроматографических тестов и определению аналитов на основе Ферстеровского резонансного переноса энергии. Разработаны иммунохроматографические тесты и варианты гомогенного анализа с использованием оптимальных пар имунореганетов. Минимальное значение концентрации NT-proBNP, которое можно было распознать визуально составило 2 нг/мл. Показана возможность использования лиофильной сушки реагентов (конъюгаты наночастиц с антителами) без потери работоспособности систем. Разработанная методика «ускоренной» модификафии КТ позволяющая заменить 6–10 часовую инкубацию при нагревании до 30 мин обработки в УЗ ванне, а также добиться более глубокого замещения лигандов. Подготовлены две статьи в изжаниях первого квартилы (Trends in Analytical chemistry, импакт-фактор 12,292 и Analytical and Bioanalytical Chemistry, импакт фактор 4.142) и одна в реферируемом в реферируемом в WOS & Scopus сборнике). Результаты работ доложены в виде четырех докладов (два устных).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В третий год выполнения проекта будут получены все заявленные результаты проекта: Для определения NT-proBNP и proBNP разработан конкурентный формат при использовании в качестве метки силанизированных КТ. Яркая стабильная метка QD-SiO2 позволила проводить анализ в условиях ограниченных концентраций иммунореагентов при конкурентном формате. КТ были сконъюгированы с моноклональными антителами, специфичными к пептидам 61-76, В качестве покровного антигена использован proBNP. Данный формат позволил определять все пептиды, в которых есть последовательность пептидов 61-76 молекулы NT-proBNP. Были протестированы NT-proBNP и proBNP. В микропланшетном варианте использовали интервал концентраций NT-proBNP и proBNP от 0,001 нг/мл до 100 нг/мл. ПрО NT-proBNP (10 % подавления сигнала) составил 0.01 нг/мл, IC50 (50% подавления сигнала) составли 4 нг/мл. В иммунохроматографическом варианте при концентрациях > 0,1 нг/мл флуоресцентные сигналы на тестовой линии отсутствовали как для NT-proBNP, так и для proBNP. Образцы с концентрацией 0,025 нг/мл и выше не давали флуоресценции в тестовой зоне. Значение отсечки NT-proBNP и proBNP в фосфатно-солевом буфере было установлено как 0,025 нг/мл. Применение антител, специфичных к аминокислотным остаткам 61-76 в структурах pro-BNP и NT-proBNP, позволяет определить оба пептида без дискриминации. Таким образом, в реальном образце анализ будет показывать сумму pro-BNP и NT-proBNP. Для определения BNP в иммунохроматографическом сэндвич формате в качестве метки использовали ЗНЧ. ЗНЧ конъюгировали со специфическими антителами к BNP (клон 24с5сс, специфический к пептидам 11- 22 молекулы BNP). Для формирования тест линии на нитроцеллюлозную мембрану наносили покровные специфические к BNP антитела (клон 50Е1сс). Для формирования контрольной линии на нитроцеллюлозную мембрану наносили антитела козы к иммуноглобулинам мыши (GAMI). Для сохранения гидратной оболочки антител, находящихся на мембране, подобраны стабилизаторы, что позволило детектировать антиген с концентрацией 1 мкг/мл. Использование двухуровневой конъюгации позволило снизить количество специфических антител. Использование конъюгата ЗНЧ@GAMI@Ат определило возможность обнаружения антигена с концентрацией 1 нг/мл. Таким образом, ЗНЧ наиболее часто используемые в качестве метки в ИХА могут быть применены для обнаружения BNP. Определение малых концентраций аналита (<100 нг/мл) требует использования более сложных иммунокомплексов. Следующим тестированным иммунохроматографическим форматом определения NT-proBNP стало использование пары меток – КТ и ЗНЧ. Индикаторные антитела были связаны с наночастицами золота, а на тест- и контрольные линии наносили КТ, включенные в нановолокна. Формат позволяет оценивать результаты в видимом свете (классическое детектирование на основе окраски наночастиц золота), и в ультрафиолете (тушение люминесценции КТ наночастицами золота). Тушение определяется двумя факторами – перенос энергии от возбужденного состояния КТ на ЗНЧ, а так же эффектом внутреннего фильтра от ЗНЧ. Показано что данный метод не позволил достичь чувствительности двух описанных версий, при этом он сопряжен с большими экспериментальными сложностями. Изучено использование разработанных тестов на основе КТ в сыворотке крови человека. Неразбавленная сыворотка крови приводит к сильному матричному эффекту и нечетким оптическим сигналам. Отсутствие матричных эффектов достигалось при 50-кратном и выше разбавлении. При оптимальном разбавлении сыворотки крови 1/50 для NT-proBNP в микропланшетах ПрО и IC50 составили 0.5 и 200 нг/мл, соответственно (в пересчете на неразбавленную сыворотку). Значение отсечки иммунохроматографического определения NT-proBNP в сыворотке составило 1,5 нг/мл. Методом введено-найдено в крови пациентов NT-proBNP не обнаружено, что указывает на его отсутствие в концентрации выше ПрО. По материалам выполнения проекта (со ссылкой на поддержку проекта) в 2022 году опубликовано 5 статей, из них две входящие в первый квартиль, отраженные в списке публикаций по проекту. Так же опубликованы три работы в материалах конференции, реферируемые в Scopus. Одна публикация направлена в печать, находится на рассмотрении на момент подписания отчета. Результаты выполнения проекта руководитель и исполнители представляли на следующих конференциях: XX International Conference Laser Optics (ICLO) - 2022, 20-24 June 2022, Sankt Petersburgh, Russia (пленарный и три стендовых доклада); IV Съезд аналитиков России (25.09.2022-01.10.2022, г. Москва) (ключевой секционный и стендовый доклады); Saratov Fall Meeting 2022: 10th Symposium on Optics and Biophotonics, Саратов, 26-30 сентября 2022 г. (устный доклад).