Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Для создания композитных сенсорных платформ нами получены новые универсальные полимерные матрицы на основе природных полимеров, служащие одновременно основой сенсора, сорбционным материалом для удерживания на его поверхности наночастиц серебра и флуоресцентного индикатора, а также сорбентом для извлечения и направленного транспорта аналитов. Предлагаемый нами подход апробирован на важнейших для контроля жизнедеятельности человека молекулах-маркеров различных заболеваний – биогенных аминах (БА). Применение металлов для определения биогенных аминов и их метаболитов можно разделить на два направления: металл-сенсибилизированную и металл-усиленную флуоресценцию, оба этих подхода комбинированно были использованы в первом этапе работы для разработки высокочувствительной сенсорной платформы для определения указанных аналитов. Металл-сенсибилизированная система для определения биогенных аминов основана на формировании тройного комплекса аналита с ионами европия(III) и окситетрациклином (Eu3+–ОТЦ) в мицеллярной среде неионогенного поверхностно-активного вещества Твин 80. Благодаря присутствию в растворе мицеллообразующего ПАВ, экранирущего флуорофор от молекул воды, увеличивалась интенсивность флуоресценции за счёт заключения комплекса Eu3+–ОТЦ–БА в мицеллы. Показано, что увеличение квантового выхода флуоресценции тройного комплекса Eu3+–ОТЦ–БА возможно осуществлять с помощью стабилизации (повышения «жесткости» структуры) комплекса и уменьшения количества молекул воды в его координационной сфере. Для решения этой задачи разработаны различные способы формирования 2D- и 3D-форм природных полимеров (пленочные структуры, гели) методами накапывания, спин-коатинга, трафаретной и струйной печати на поверхности стандартных предметных оптических (кварцевых) стекол и в многолуночных планшетах. При этом было показано, что наиболее интенсивный и воспроизводимый сигнал с минимальным фоном в видимой области спектра формируется в 3D-гелевых композитных структурах на основе альгината и коллагена, полученных простым методом накапывания и зафиксированных в лунках планшета для иммунохимического анализа. Последнее обеспечивает возможность одновременного анализа несколько десятков образцов с использованием серийного оборудования. Подобраны условия формирования тройного комплекса Eu3+-ОТЦ-БА в альгинатном гидрогеле и разработаны методики определения трех биогенных аминов (допамина, адреналина и гомованилиновой кислоты) на уровне их пикомолярных концентраций. Использование данной флуоресцентной твердофазной системы возможно для определения БА в биологических жидкостях (моче, плазме крови), но невозможно при работе с живыми клеточными культурами ex и in vivo из-за токсичного влияния ряда компонентов индикаторной реакции – европия(III) и ОТЦ. Для преодоления этой трудности разработана композитная структура - гелевая сэндвич-система, где токсичные для клеток компоненты индикаторной системы молекулы ОТЦ и катионы Eu3+ находятся в уже изученной нами альгинатной фазе, а биообъекты, в том числе клеточные структуры, выделяющие БА, в отдельной фазе – коллагеновой. Выбор второй фазы обусловлен тем, что для роста и развития клеточных культур лучше всего подходят 3D–гелевые структуры на основе белков, и коллаген наиболее изучен для решения поставленной задачи. Металл-усиленная флуоресценция. Начаты исследования по управлению спектральным диапазоном поверхностного плазмонного резонанса (ППР) путем целенаправленного изменения размера наночастиц золота/серебра, формы, агрегатов на их основе и, как следствие, спектральными свойствами поверхности в целях обеспечения совпадения спектров поглощения наноструктурированной поверхности и длины волны возбуждения или самой молекулы-аналита, или индикаторного вещества для реализации эффекта ППР. Спектры возбуждения флуоресценции показали, что оптимальной длиной возбуждения флуоресценции тройного комплекса с наночастицами серебра является 404 нм (без наночастиц серебра λex = 415 нм), а длина волны испускания флуоресценции осталась прежней - 617 нм. Так как коэффициент усиления флуоресценции (согласно литературным данным) сильно зависит от природы, формы, размера, дисперсии и окружения наночастиц, нами были опробованы разные методы синтеза серебряных НЧ. В качестве оптимального выбран цитратный способ их получения. Спектр НЧ имел только один пик на 400 нм, что согласно табличным данным соответствует наночастицам серебра размером 15-25 нм. Использование наночастиц серебра AgNPs разных концентраций дает усиление флуоресценции в 2.5–3 раза для данной системы. На примере дофамина было показано что наилучшее относительное усиление в присутствии 1 пМ дофамина получено при концентрации цитратных AgNPs, эквивалентной 60 мкМ серебра. Таким образом, продемонстрировано, что применение металл-усиленной флуоресценции позволяет увеличить интенсивность эмиссии флуорофора и, как следствие, понизить пределы обнаружения аналитов. Разработка мультисенсорных платформ Создаваемые в проекте сенсорные системы предполагается объединять в платформы, состоящие из нескольких элементов, отклик каждого из которых на разные компоненты системы различен. Для этого выбирают модельные системы, включающие флуорофоры и аналиты, позволяющие, с одной стороны, дискриминировать образцы сложного состава флуоримет¬рическим методом «отпечатков пальцев», а с другой стороны – определять в таких образцах аналиты количественно. Для получения максимальных спектральных различий выбирали флуорофоры, взаимодействующие с низкомолекулярными органическими соединениями по различным механизмам. Предварительно выбирали также неспецифические флуорофоры, позволяющие учесть матричные эффекты. В качестве такого флуорофора рассмотрели флуоресцеин (Фл). Установили, что эмиссия Фл тушится в присутствии биологической матрицы (гомогената мышц индейки), что позволяет использовать этот краситель как неспецифический флуорофор для коррекции полезных сигналов в визуализаторе при возбуждении при 254 нм. Показали, что для одновременного определения двух и более компонентов может быть использована смесь флуорофоров: карбоцианина и третбутилфталоцинина алюминия. Эмиссия первого из названных флуорофоров тушится тетрациклинами, цефалоспоринами, сульфаниламидами, изониазидом, хлорамфениколом и метамизолом, тогда как второй флуорофор дает сигнал с рядом анионов. Полученные результаты создают основу для разработки твердофазных сенсорных систем для одновременного определения нескольких компонентов в биоматрицах флуориметрическим методом. Оценка эффективности дискриминации образцов Стандартных методов хемометрики не всегда достаточно для решения текущих задач. При разработке методов «отпечатков пальцев» желательно располагать критериями выбора флуорофоров, которые позволили бы разделять классифицируемые объекты на наибольшее число групп. Задача усложняется в том случае, когда на графиках счетов разделены не все образцы. Мы предложили простой способ оценки эффективности дискриминирования путем подсчета числа пересечений доверительных эллипсов на графике счетов (уровень значимости 82%). Два эллипса могут пересекаться в двух, трех или четырех точках; случай, когда один эллипс лежал внутри другого, принимали за 4 пересечения. Подсчитывали общее число пересечений ЧисП всех эллипсов на данном графике счетов, что и служило критерием эффективности дискриминирования в использованных условиях. Для сравнения предложенного параметра со стандартными рассчитывали стандартный параметр "общая чувствительность". (Этот показатель служит мерой эффективности классификации, являясь отношением правильно классифицированных образцов к числу всех образцов.) Для расчета ОЧ необходима информация о правильно и неправильно отнесенных образцах (что не требуется при использовании предлагаемого нами критерия ЧисП). Значения ОЧ, основанные на расчете расстояния Махаланобиса между классами, а также ЧисП и числа разделенных групп рассчитаны для 36 образцов меда. Оказалось, что параметр ЧисП в определенной степени сходен с параметром ОЧ (коэффициент кореляции 0.79). Предложенный параетр позволил выбрать наиболее эффективный флуорофор: Ru(bpy)32+ занимает лидирующие позиции среди других флуорофоров и по параметру ЧисП (112), и по числу разделенных групп, и по значениям общей чувствительности ОЧ. Таким образом, параметр ЧисП показал свою эффективность при оценке качества дискриминирования на примере образцов меда. Он не требует выделения проверочного набора данных и может быть рассчитан без использования программного обеспечения, если построены доверительные эллипсы и может быть использован как независимая характеристика качества дискриминирования образцов в различных (не только флуориметрических) методах "отпечатков пальцев" (этот подход описан нами в Sensors, 2020, 20(18), 5351; https://doi.org/10.3390/s20185351).

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На данном этапе выполнения проекта для реализации эффекта поверхностного плазмонного резонанса (ППР) и усиления сигнала флуоресценции необходимо было создать наноструктурированную поверхность на основе наночастиц серебра. Наиболее воспроизводимых результатов удалось достичь при их синтезе по методу Леопольда-Лендла. Средний размер наночастиц (НЧ) серебра по данным спектрофотометрии и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) составил 30–50 нм. В качестве модельных аналитов были выбраны низкомолекулярные маркеры нейромедиаторного обмена – катехоламины (КА), которые были успешно апробированы на первом этапе проекта. В качестве субстрата для равномерного распределения наночастиц, компонентов индикаторных систем и определяемых веществ по поверхности подложки выбран природный полимер – хитозан, поскольку он является оптически прозрачным, пористым материалом с высокой сорбционной емкостью. Для создания хитозановой пленки методом нанесения полимерного раствора использовали четыре разные концентрации: 0.5; 0.75; 1.0; 2.0 и 5.0 масс. %. Полученную свободно стоящую хитозановую пленку выдерживали в растворе наночастиц серебра в течение 30 мин в ультразвуковой ванне, высушивали и проверяли на ППР-активность методом рамановской спектроскопии. Максимальной величиной коэффициента усиления (КУ) ППР обладала подложка, изготовленная из 1% раствора хитозана: пики модельного соединения на ней самые интенсивные и имеют лучшее соотношение сигнал/шум. По данным СЭМ было показано, что на субстрате из 1%-го хитозана наночастицы серебра распределены заметно равномернее и плотнее, чем на остальных. Показано, что под воздействием ультразвука НЧ глубже заходят в поры хитозана, и полимер сорбирует большее число таких наночастиц и большее количество «горячих точек», способствующих усилению сигнала. Полученные ППР сенсорные элементы характеризовались высокой воспроизводимостью от сенсора к сенсору и оставались стабильными не менее 1 месяца. Разработанные ППР сенсорные элементы апробированы в определении ключевых катехоламинов: дофамина (ДА), адреналина (АД) и норадреналина (НА). Эти катехоламины содержатся в биологических жидкостях человека на уровне десятков нМ, а при патологических состояниях еще ниже, поэтому необходима разработка подходов к определению этих соединений на уровне 1–10 нМ. В связи с этим разработка сенсорных элементов на основе усиленной флуоресценции является актуальной задачей. Использование метода усиленной флуоресценции не применимо к катехоламинам напрямую, так как их максимумы поглощения находятся в УФ области (220-240 нм), что не совпадает с областью поглощения наночастиц серебра. Для решения этой задачи нами предложена твердофазная индикаторная система, в которой определяемые соединения связывали в комплекс с Cu2+, поглощающий в видимой области спектра и обеспечивающий ППР, при этом в качестве флуоресцентного зонда применяли терефталат натрия. Формирование комплексов катехоламинов с медью было предсказано в результате компьютерного моделирования и описано с помощью теории функционала плотности (DFT) расчета молекулярных орбиталей (MO) и анализа орбиталей естественных связей (NBO). Все теоретические расчеты проводили с использованием программы Q Chem 5.3. Проведен рентгеноспектральный микроанализ (РСМА) распределения меди(II) в пленке хитозана. Установлено, что при нанесении раствора сульфата медь ложится на наноструктурированную поверхность неоднородными агрегатами с бимодальным распределением по размеру с латеральными размерами (10±2) мкм и (4,4±1,3) мкм (усреднение по 12 частицам), а в случае накапывания раствора на пленку хитозана концентрируется, в основном, в месте складок полимера. Исходя из данных РСМА было предложено смешивать 0.01 М раствор сульфата меди с 1% раствором хитозана в соотношении 1:1 для более равномерного ее распределения по поверхности сенсорного элемента. Максимумы поглощения КА с медью смещаются в более длинноволновую (видимую) область спектра: 556, 480 и 600 нм для ДА, АД и НА, соответственно, что позволяет проводить анализ методом ППР, в том числе мультиплексно. Пределы обнаружения биогенных аминов методом ППР составили 2, 7 и 5 нМ для ДА, АД и НА соответственно. Эти же результаты и аналитические характеристики ППР сенсорных элементов были достигнуты при регистрации сигнала методом усиленной флуоресценции при введении флуоресцентного зонда терефталата натрия в индикаторную систему. Несмотря на многочисленные преимущества и широкое применение пероксидазы и других гемсодержащих белков в биосенсорных технологиях и биоаналитических приложениях, системы на их основе имеют ключевой недостаток: они требуют добавления извне основного субстрата – пероксида водорода, поскольку чрезвычайно сложно включить этот реагент в состав сенсорного устройства на стадии его изготовления. В рамках выполнения настоящего проекта предложен подход к созданию безреагентных сенсорных элементов на основе гемсодержащих белков и ферментов, который заключается в замене добавляемого извне (ex-situ) пероксида водорода на наночастицы ZnO2, генерирующих пероксид водорода непосредственно в составе сенсорного элемента под действием буферного раствора с рН < 6 (in-situ). Наночастицы синтезированы из ацетата цинка и раствора пероксида водорода при рН 8-9. В результате получены сферические агрегаты пероксида цинка со средним диаметром 30-40 нм, согласно результатам СЭМ. Этот подход позволит существенно ускорить массовый экспресс-анализ на основе гемсодержащих белков и ферментов: его производительность достигает 96 проб за 7 мин, то есть около 5 с на одну пробу. Подход может быть применен в различных биосенсорах, использующих пероксид водорода. Для расширения круга соединений, определяемых флуориметрическими методами, повышения экспрессности, устранения матричных эффектов биологических объектов предложен комплекс подходов и разработан ряд флуориметрических методик на основе красителей, излучающих в ближней ИК (БИК) области спектра. Предложено использовать реакции каталитического окисления БИК-красителей для определения органических аналитов различных классов, влияющих на скорость таких реакций. В качестве аналитического сигнала используется либо интенсивность флуоресцении при фиксированном времени, либо ряд таких интенсивностей (кинетическая кривая), получаемых при фотографировании флуоримерического планшета с образцами в простом БИК-визуализаторе. Из ряда рассмотренных редокс-систем в качестве окислителя выбрали пероксид водорода, а катализатора – медь(II). На вид кинетических кривых окисления красителей влияют различные лекарственные вещества, в частности, сульфаниламиды, аминогликозиды, фенотиазины, цефалоспорины, пенициллины, террациклины. Показали, что с использованием реакции окисления коммерчески доступного карбоцианинового красителя можно распознать 8 сульфаниламидов в одном растворе по методу главных компонент. Возможно определение фталилсульфатиазола в водном растворе и в гомогенате мыщц индейки (0.08–0.5 мМ, sr = 0.09), что подтверждает перспективность использования предлагаемой БИК-платформы для получения сигналов аналитов в сложных биоматрицах. Предложенная платформа использована при разработке массивов флуорофоров (sensor array), предназначенных как для распознавания модельных аналитов, так и для одновременного определения нескольких аналитов. Использовали массив трех красителей, один из которых отвечает за формирование аналитических сигналов по механизму агрегации в присутствии ПАВ (цетилтриметиламмоний), а два других окисляются пероксидом в присутствии меди(2+). Показана возможность распознавания девяти лекарственных веществ: цефлоспоринов (цефтриаксон, цефтазидим, цефотаксим, цефазолин), фенотиазинов (хлорпромазин, промазин и прометазин) и пенициллинов (бензилпенициллин и ампициллин). Все вещества разделяются на графике счетов, причем выделяются группы фенотиазинов, пенициллинов и цефалоспоринов. Методика проста, экспрессна и не требует спектральных приборов. Можно заключить, что предложенная сенсорная платформа обладает высокой распознающей способностью, и ее целесообразно использовать в дальнейшем для дискриминации объектов сходного состава. Для разработки способов одновременного определения нескольких аналитов в реакцию каталитического окисления БИК-красителя вводили компоненты лекарственного средства бисептол: сульфаметоксазол (5 мкМ – 0.25 мМ) и триметоприм (30 мкМ – 0.3 мМ) в мольных соотношениях от 5:1 до 1:50 (11 разных соотношений по 3 параллельных опыта). За протеканием реакции следили, получая фотографии планшета при времени 0–39 мин. Градуировочную модель строили с помощью искусственных нейронных сетей в программе Statistica. Наилучшая нейросеть показала ошибки: обучения 0.056, валидации 0.147 и тестирования 0.31. Таким образом, с помощью предлагаемой системы возможно полуколичественное одновременное определение двух аналитов в водном растворе. Изучаемые системы на основе БИК-красителей пригодны также для классификации и дискриминации сходных между собой объектов сложного состава. Вместо традиционно используемых спектров собственной флуоресцении мы добавляем к объектам флуорофор(ы) и используем фотографию. Подход опробован на примере 17 образцов яблочного сока 9 производителей, классифицируемых с помощью карбоцианинового красителя. Известно, что при решении задач дискриминации целесообразно объединение различных типов данных; мы обрабатывали совместно данные флуориметрии и отражательной спектрофотометрии, получаемые фотографированием 96-луночного планшета. Нашли, что результаты целесообразно представлять в координатах интенсивность БИК-флуоресценции – интенсивность отражения в видимой области, причем образцы одного и того же завода объединяются в группы (Мултон, Прогресс, Сады Придонья). Получали также полные спектры флуоресценции образцов – как собственной, так и с добавкой флуорофора. Картины дискриминации образцов, полученные на основе фотографических изображений и спектров флуоресценции, различаются; во втором случае разделение отдельных образцов на графиках счетов более полное, но производители не выделяются в отдельные группы. По сравнению с получением спектров фотографический способ регистрации отклика существенно экспресснее и позволяет обойтись без использования спектрофлуориметра. В целом, используемый в работе метод БИК-флуориметрии с фотографической регистрацией сигнала подтверждает свою высокую производительность, удобство и целесообразность использования для определения и обнаружения низкомолекулярных органических аналитов. Предлагаемые подходы позволяют получать отклик аналитов разной природы (в том числе не обладающих флуоресценцией и непосредственно не взаимодействующих с флуорофорами), и уверенно измерять сигнал в биоматрицах за счет использования БИК-области спектра. Предложенные системы являются платформами, на основе которых может быть создан целый ряд методик определения и распознавания аналитов разной природы и дискриминации различных объектов, а сами платформы должны совершенствоваться с целью улучшения аналитических характеристик. https://istina.msu.ru/publications/article/415780043/

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Разработана простая масштабируемая методика получения ППР-сенсора на основе свободностоящей хитозановой пленки, НЧС и оксида графена. Хитозан позволил равномерно распределить НЧС из коллоида и, как следствие, получить воспроизводимый сигнал комбинационного рассеяния. Добавление оксида графена (ОГ) в коллоидный раствор НЧС подавляет фоновый сигнал флуоресценции от аналита и приводит к увеличению отношения интенсивности сигнала к фоновой интенсивности флуоресценции до 6 раз по сравнению со структурами без ОГ. Предложенный подход открывает многообещающие возможности для обеспечения более чувствительного обнаружения в том числе флуоресцентных аналитов с помощью коротковолновых лазеров (532, 633 нм) вместо ИК (785, 1024 нм) и способствует практическому применению разработанных плазмонных композитов в портативных спектрометрах комбинационного рассеяния. Предложен новый подход к молекулярной иммобилизации и резонансному комбинационному усилению соединений с помощью комплексов-усилителей (Molecular Immobilization and Resonant Raman Amplification by Complex-Loaded Enhancers, MIRRACLE) на покрытых хитозаном плазмонных металлических наноструктурированных субстратах и продемонстрировали перспективность его применения на ряде маркеров нейромедиаторного обмена. Этот подход был апробирован на модифицированных медь(II)-хитозан-модифицированных плазмонных металлических наноструктурированных субстратах для чувствительного и быстрого определения катехоламинов (КА) дофамина, адреналина и норадреналина. Предложен способ прямого воспроизводимого и высокочувствительного определения макромолекулярных соединений. Плазмонная сенсорная система на основе хитозановой пленки, наночастиц Ag и оксида графена позволила надежно определить количество агрегатов амилоида-β (Aβ) с пределом обнаружения 1,5 нМ с использованием портативного спектрометра комбинационного рассеяния с лазером 532 нм. Сенсорная структура, полученная методом лазерно-индуцированного осаждения (AgNP/LID), обеспечивают высокую чувствительность количественного определения агрегатов Aβ при концентрациях до 15 пМ (в пересчете на пептидный мономер). Таким образом, AgNP/LID в сочетании с лазером с длиной волны 633 нм открывает возможность продолжения фундаментальных исследований агрегации Aβ и образования бляшек: конформации, условий, стабильности, кинетики и т. д., где необходимо разрешение мод. В то время как плазмонную композитную поверхность на основе хитозана и наночастиц Ag можно применять для анализа биологических образцов «на месте оказания медицинской помощи». Успешно продолжены исследования по in situ генерации пероксида водорода «по требованию» из наночастиц ZnO2 путем регулирования pH буферным раствором в сенсорных системах на основе пероксидазы из корней хрена. Благодаря этому подходу исключается необходимость добавления основного субстрата извне, что позволяет перейти к безреагентным оптическим сенсорам с участием указанного фермента. Проведенный нами поиск эффективных оптических индикаторных систем выявил возможность предложить и реализовать новый подход в области оптических методов «отпечатков пальцев». Методы «отпечатков пальцев» – это методы качественного анализа, позволяющие различать объекты близкого состава и проводить их кластеризацию, дискриминацию и аутентификацию. В количественном варианте методы «отпечатков пальцев» позволяют определять содержание аналитов в смесях. Оптические варианты методов «отпечатков пальцев», как правило, используют собственные спектры (поглощения, эмиссии и т.д.) образцов. Увеличить информативность этих методов можно, вводя добавки веществ, взаимодействующих с компонентами объекта, например, добавляя флуорофор, в таком случае сигнал собственных флуорофоров образца складывается со спектром добавки, зависящим от присутствия и концентрации других (нефлуоресцирующих) компонентов образца. Это второе поколение метода отпечатков пальцев. Третьим поколением метода стало предложенное нами в рамках настоящего проекта проведение индикаторной реакции в присутствии образца; в этом случае все спектральные характеристики измеряются не однократно, а во времени (Журн. аналит. химии, 2021, 76, 1089). В литературе удается найти лишь единичные работы со сходной идеологией. В рамках этого подхода реализована комбинация нескольких индикаторных реакций (окисления карбоцианиновых красителей и реакции агрегации) при периодическом измерении поглощения и флуоресценции их продуктов в нескольких спектральных диапазонах, что позволяет различить объекты близкого состава, такие как экстракты клубней картофеля, получивших различные дозы ионизирующего излучения. Решение этой задачи актуально в связи с ожидаемым принятием закона о радиационной обработке пищи и потребностью в методах контроля поглощенной продуктами дозы спустя какое-то время после облучения (ранее такая задача не ставилась). Предлагаемая методика экспрессна, поскольку для регистрации сигналов реакционную смесь фотографируют в 96-луночных планшетах, при этом не используется полноспектральное оборудование. Обработка результатов оцифровки изображения методами главных компонент и дискриминантного анализа позволяет различить образцы, получившие отличающиеся на порядок дозы (10000, 1000, 100 и 10 Гр, а также необлученные). Изучены разные типы ионизирующего излучения (поток электронов и рентгеновское), а также возможность работы со смесями двух разных сортов картофеля. В обоих случаях образцы удается распознать с правильностью от 89 до 100%. Сделан вывод о том, что проведение индикаторных реакций с использованием кинетического фактора является мощным инструментом дискриминации образцов близкого состава. Истина МГУ: http://istina.msu.ru/projects/311956247/ Препринт публикации о методах "отпечатков пальцев": http://ssrn.com/abstract=4236701