Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В проекте разработаны методы расчёта вибронной структуры полос в спектрах двухфотонного поглощения хромофорных групп фотоактивных белков с выходом за рамки приближения Франка-Кондона и с учетом термического заселения начальных колебательных уровней в рамках стационарного и нестационарного формализма. В рамках временного формализма была реализована возможность рассчитывать абсолютные сечения двухфотонного поглощения с учетом вибронной структуры в франк-кондоновском и герцберг-теллеровском приближении. В рамках стационарного формализма для переходов в первое возбужденное состояние впервые разработан подход, позволяющий рассчитывать вероятности вибронных переходов при двухфотонном возбуждении с использованием двухуровневой модели с учетом вибронных взаимодействий и термического заселения начальных колебательных уровней. Преимущество данной модели заключается в возможности описании вероятности двухфотонного перехода в терминах дипольного момента перехода и разности средних дипольных моментов в основном и возбужденном состоянии, а также их производных по колебательным смещениям вдоль нормальных мод. Эти величины могут быть рассчитаны с использованием неэмпирических методов высокого уровня точности, в том числе с помощью инвариантной многоконфигурационной квазивырожденной теории возмущений. Данная модель также допускает обобщение на случай явного учета ангармонических мод большой амплитуды. Двухуровневая модель позволяет анализировать колебательные моды, возбуждение которых способствует увеличению вероятности двухфотонного перехода. Впервые показано, что колебательные моды, при которых происходит существенное изменение среднего дипольного момента в плоскости сопряжения хромофорных групп в основном электронном состоянии (полносимметричные моды, активные в ИК спектроскопии), наиболее сильно связаны с двухфотонным переходом. Это позволит увеличить сечение двухфотонного поглощения при селективном возбуждении определенных колебательных мод. С помощью реализованного в рамках проекта временного формализма получены новые данные о фотофизических свойствах заряженных хромофорных групп флуоресцентных белков при нелинейном двухфотонном возбуждении. На основании анализа вибронной структуры полос в спектрах однофотонного и двухфотонного поглощения установлена причина различного положения максимумов поглощения в этих спектрах и впервые установлена связь колебательных мод, активных при возбуждении в линейном и нелинейном режиме, с модами, связанными с фотооткликом депротонированной хромофорной группы зеленого флуоресцентного белка – фотоиндуцированным переносом электрона из возбужденного состояния в присутствии окислителей. В проекте установлен механизм безызлучательной релаксации ряда модифицированных хромофоров фотоактивных биомолекулярных систем в газовой фазе – хромофорных групп ретиналь-содержащих белков с заблокированным внутримолекулярным вращением по определенным двойным связям и флуоресцентных белков, энергетический спектр которых содержит несколько электронно-возбужденных состояний в видимом диапазоне, включая низколежащее оптически темное состояние. В совместных теоретико-экспериментальных работах определены средние времена жизни этих хромофоров в возбужденных состояниях. Предложены пути управления сверхбыстрой фотоиндуцированной динамикой в таких системах с помощью химических модификаций и различного микроокружения. Исследованы процессы релаксации возбужденных состояний депротонированного хромофора зеленого флуоресцентного белка при линейном и нелинейном возбуждении в растворе, которые приводят к фотоионизации. Предложена методика оценки вертикальной энергии фотоионизации заряженных хромофоров в водном окружении, основанная на разработанном в проекте гибридном методе для получения равновесной геометрической конфигурации модельной системы большого размера с явным учетом вплоть до 19,000 молекул воды и метода XMCQDPT2/EFP. В совместных теоретико-экспериментальных работах впервые определены четыре первых вертикальных потенциала ионизации депротонированного хромофора зеленого флуоресцентного белка в водном растворе. Показано, что фотоиндуцированный срыв электрона происходит по механизму резонансной многофотонной ионизации через образование промежуточных электронно-возбужденных состояний аниона в растворе. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли электронно-возбужденных состояний сольватированного хромофора в процессе фотоиндуцированного переноса электрона, в том числе на растворитель. В 2020 году в рамках проекта синтезированы наночастицы серебра для последующего формирования на их основе гибридных бионаносистем с флуоресцентными белками. Наночастицы имеют форму нанобрусков; их размером можно управлять путем изменения условий синтеза. Кроме того, по результатам компьютерного моделирования для усиления флуоресценции при двухфотонном возбуждении предложено использовать наночастицы золота с формой полумесяца. Проведено численное моделирование констант скоростей излучательных процессов релаксации гибридной бионаносистемы, состоящей из молекул зеленого флуоресцентного белка EGFP на поверхности перфорированной тонкой пленки серебра, нанесенной на подложку из стекла в водной среде. Установлено, что наибольшее усиление флуоресценции наблюдается для молекул, расположенных на стекле вблизи нижней границы наноотверстий, при этом наибольший вклад в усиление составляет увеличение скорости возбуждения за счет локального усиления электрического поля при возбуждении плазмонного резонанса в пленке серебра. Полученные данные о времени жизни флуоресценции позволили соотнести два характеристических времени, наблюдавшихся в эксперименте, с молекулами, адсорбированными на металле и внутри наноотверстий. Экспериментально созданы гибридные наносистемы, включающие модифицированный хромофор зеленого флуоресцентного белка NEt2-BF2-BDI, диспергированный в тонкой пленке ПММА на поверхности перфорированной тонкой пленки серебра. Изучены процессы релаксации возбужденного состояния модифицированного хромофора зеленого флуоресцентного белка NEt2-BF2-BDI в полимерной матрице на поверхности перфорированных пленок серебра. Установлено, что интенсивность флуоресценции увеличивается в 6 раз по сравнению с пленкой ПММА без серебра, при этом время жизни возбужденного состояния уменьшается в 1.5 раза. В 2020 году результаты проекта опубликованы в 1 статье, индексируемой в международных базах данных Web Of Science и Scopus, и подготовлено 4 статьи, которые планируется опубликовать в высокорейтинговых журналах, индексируемых в международных базах данных Web Of Science и Scopus. Одна из этих статей сейчас находится в редакции журнала Nature Communications и успешно прошла первый этап рецензирования. Результаты проекта представлены на 7 международных конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В проекте разработан и реализован метод расчета электронно-колебательных спектров фотоактивных биомолекулярных систем и их хромофорных групп при двухфотонном переходе в первое возбужденное состояние в рамках двухуровневой модели с учетом вибронных взаимодействий и термического заселения начальных колебательных уровней. Метод реализован в рамках двух формализмов – стационарного и временного, демонстрирующих идентичные результаты. Влияние белкового окружения моделируется в рамках метода потенциалов эффективных фрагментов, позволяющего учитывать поляризацию волновой функции основного и возбужденного состояний под действием поля, создаваемого молекулярным окружением. Описание квантовой подсистемы проводится c использованием инвариантной многоконфигурационной квазивырожденной теории возмущений XMCQDPT2. Проведено моделирование и анализ структуры полос в спектрах двухфотонного поглощения флуоресцентного белка EGFP и проведено сопоставление с формой полос в спектрах белка EGFP при однофотонном возбуждении. Показано, что колебательные моды, при которых происходит существенное изменение среднего дипольного момента в плоскости сопряжения хромофорной группы в основном электронном состоянии, наиболее сильно связаны с двухфотонным переходом в белке EGFP. Активность этих мод приводит к сдвигу максимума полосы поглощения в коротковолновую область спектра по сравнению с максимумом поглощения при однофотонном поглощении. Важно отметить, что наиболее интересным следствием высокой активности валентного колебания двойных связей сопряженной системы депротонированного хромофора EGFP при двухфотонном возбуждении является возможность использования нелинейного режима возбуждения для повышения эффективности окислительной фотоконверсии белка EGFP в присутствии окислителей, которая сопровождается переходом зеленой формы в красную. Установлен механизм термической изомеризации хромофорной группы белков зрительной рецепции с учетом неадиабатического взаимодействия основного и первого возбужденного электронных состояний. Получены наиболее точные оценки барьеров термической изомеризации на сегодняшний день и рассчитана эффективная константа скорости с учетом двух каналов термической изомеризации – радикального и ионного. Впервые показано, что характеристическое время изомеризации в газовой фазе сопоставимо со временем в белковом окружении. Также разработана теоретическая модель для интерпретации экспериментальных данных по определению энергии активации мономолекулярных реакций в газовой фазе. С помощью предложенной модели показано хорошее соответствие рассчитанных барьеров термической изомеризации изолированного протонированного основания Шиффа ретиналя с экспериментальными данными. Исследовано влияние химических модификаций и белкового окружения на фотоиндуцированную динамику протонированного основания Шиффа ретиналя. Введение химической модификации, блокирующей внутримолекулярное вращение по связи С11-С12 в локированной хромофорной группе ретиналь-содержащих белков, позволяет не только на порядок снизить время жизни возбужденного состояния за счет значительного понижения энергетического барьера реакции вследствие предварительного скручивании полиеновой цепи ретиналя по связи С9-С10 в основном состоянии, но и открывает путь для управления механическим фотооткликом хромофора, приводя к направленному вращению при фотоизомеризации. В рамках проекта впервые показано, что модифицированный аналог хромофорной группы ретиналь-содержащих белков является перспективным для создания молекулярного мотора. Установлено, что белковое окружение аналогичным образом влияет на фотоиндуцированную динамику хромофорной группы. Скручивание полиеновой цепи ретиналя в основном электронном состоянии за счет взаимодействий с белковым окружением приводит к возбуждению определенных колебательных мод хромофора уже на ранних этапах динамики, что способствует протеканию реакции фотоизомеризации и обеспечивает ее селективность в родопсинах I и II типов. При этом эффективность обратных реакций фотоизомеризации в родопсинах I и II типа сильно различается. [направлено в JACS] Проведены совместные экспериментальные и теоретические исследования фотоиндуцированной динамики релаксации возбужденных состояний в модифицированных аналогах хромофора зеленого флуоресцентного белка. Показано, что биомиметики аниона хромофора зеленого флуоресцентного белка, дифтор- и диметоксизамещенные хромофоры, обладающие флуоресцентными свойствами при связывании с определенными последовательностями РНК, являются более устойчивыми к фотоокислению. В диметоксизамещенных производных одним из важных каналов безызлучательной релаксации становится канал внутренней конверсии, который связан с наличием долгоживущего фешбаховского резонанса, энергетически хорошо отделенного от резонанса формы. [PCCP 2021] С помощью разработанного в рамках проекта комбинированного метода расчёта потенциалов ионизации биомолекулярных систем в конденсированной фазе на основе многоконфигурационной теории возмущений рассчитаны значения первого и второго потенциалов ионизации ряда биологических хромофоров в водном окружении, которые позволяют интерпретировать экспериментальные фотоэлектронные спектры, полученные при многофотонной ионизации. Установлена роль высоковозбужденных электронных состояний сольватированного хромофора GFP в процессах фотопереноса электрона в конденсированной фазе. Показано, что главную роль в фотоиндуцированном переносе электрона на растворитель играют короткоживущие резонансы формы, что подтверждает результаты и выводы, сделанные нами в рамках проекта при изучении электронной структуры изолированного хромофора зеленого флуоресцентного белка и его биомиметиков. [Nature Communications 2022] Исследовано влияние плазмонной наноструктуры – перфорированной тонкой пленки серебра на распределение времен жизни возбужденного состояния модифицированного хромофора зеленого флуоресцентного белка NEt2-BF2-BDI, диспергированного в тонкой пленке поли-метилметакрилата. Установлено, что в присутствии сплошной пленки серебра максимум распределения сдвигается от 3.7 нс в сторону значений времени жизни порядка 2.1 нс, что обусловлено переносом энергии возбуждения на металл. При появлении отверстий в пленке наблюдается увеличение ширины распределения за счет большей гетерогенности системы, при этом положение максимума остается практически неизменным. [J. Phys. Conf. Ser. 2021] Определены основные закономерности усиления флуоресценции в гибридных бионаносистемах при двухфотонном возбуждении. Установлено, что на эффективность усиления флуоресценции в первую очередь влияет степень усиления локального электромагнитного поля в точке, где находится молекула флуорофора, при длине волны, соответствующей полосе его двухфотонного поглощения, что обусловлено квадратичной зависимостью от интенсивности поля. Наличие спектрального перекрывания между полосой испускания флуорофора и полосой квадрупольной плазмонной моды за счет повышения константы скорости вынужденного испускания может приводить к дополнительному усилению флуоресценции при условии сохранения напряженности электрического поля на длине волны двухфотонного возбуждения. Показано, что в гибридной системе, состоящей из наночастицы серебра с формой квадратного параллелепипеда (220х63х63 нм) и флуоресцентного белка NirFP (eqFP670), расположенного вблизи вершины наночастицы, при двухфотонном возбуждении возможно достижение коэффициента усиления флуоресценции, достигающего трех порядков. [Nanomaterials 2021] В 2021 году были успешно защищены две дипломные работы студентов лаборатории квантовой фотодинамики кафедры физической химии химического факультета МГУ, активно участвующих в реализации проекта. По результатам проекта в 2021 году опубликованы четыре статьи в рецензируемых международных журналах первого квартиля [Nature Communications 2022, Nanomaterials 2021, Nanomaterials 2020, PCCP 2021] и представлен 21 доклад на международных и всероссийских конференциях.