КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 20-14-00155

НазваниеХолинэстеразы как активные компоненты нанореакторов для детоксикации фосфорорганических соединений. Взаимодействия с новыми лекарственными препаратами.

РуководительХарламова Александра Дмитриевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет", Республика Татарстан

Года выполнения при поддержке РНФ2020 - 2022

КонкурсКонкурс 2020 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые словаХолинэстеразы, кинетика, фармакология, токсикология, ингибиторы холинэстераз, фосфорорганические соединения, холинэргическая система, реактиваторы, биоловушки (биоскавенджеры), нанореакторы

Код ГРНТИ34.15.63


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Холинэстеразы (ХЭ) представляют собой хорошо изученные ферменты, открытые около 100 лет назад. Однако некоторые аспекты их каталитического действия и даже физиологической роли в организме остаются не до конца ясны. Ацетилхолинэстераза (АХЭ) играет ключевую роль в холинэргической системе, прекращая действие ацетилхолина. Физиологическая роль близкого к ней фермента — бутирилхолинэстеразы (БХЭ) остается до конца неясной. По всей видимости, этот фермент осуществляет контроль экстрасинаптического ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях, может инактивировать гормон голода грелин, а также может выполнять функции АХЭ в экстремальных физиологических условиях. Кроме того, БХЭ имеет важное значение в метаболизации большого количества лекарств и ксенобиотиков. БХЭ легких, кожи и плазмы крови служат естественной защитой против таких отравляющих веществ, как карбоксил-, карбамил-, и фосфорные эфиры, действуя как эндогенные биоловушки для этих ядов. И АХЭ, и БХЭ относятся к наиболее быстрым ферментам, и их каталитические механизмы взаимодействия с естественными субстратами (ацетилхолином) и, в целом, с положительно заряженными субстратами невероятно сложны. Каталитическая сложность обусловлена уникальной молекулярной структурой этих ферментов. Каждая мономерная субъединица представляет собой однодоменный фермент, в котором каталитический центр расположен на дне глубокого канала, также сложность обусловливается наличием периферического сайта для аллостерического связывания и высокой конформационной подвижностью. На протяжении более 40 лет мы изучали каталитические и ингибиторные механизмы работы человеческих холинэстераз дикого типа и мутантных форм, взаимосвязь между трехмерной структурой, активностью, стабильностью и динамикой этих ферментов. В последние 20 лет мы также были заинтересованы в инженерии ферментов с целью создания мутантов ХЭ, способных расщеплять молекулы фосфорорганических соединений (ФОС), и таким образом, выступать в качестве каталитических биоловушек против этих отравляющих соединений, что могло бы использоваться в дальнейшем в медицине. Таким образом, проект, который мы представляем, соответствует нашим предыдущим исследованиям и недавним достижениям. В этом исследовательском проекте мы планируем: 1) встроить биоловушки и реактиваторы ХЭ в инъектируемые нанореакторы для введения до и после отравления ФОС. Чтобы повысить эффективность этого метода против большого спектра ФОС, в нанореакторы будут инкапсулированы несколько реактиваторов (оксимы внутри твердо-липидных наночастиц) и несколько ферментов: БХЭ дикого типа, мутанты этого фермента, разрабатываемые совместно с нашими коллегами. Также рассматривается возможность использования фосфотриэстераз бактериального происхождения; 2) исследовать фармакологические свойства нескольких ингибиторов, представляющих потенциальный интерес для лечения нейродегенеративных заболеваний, а также для профилактики отравления ФОС. Эти вещества, содержащие трифторкетонную группу и токоферол, являются обратимыми ингибиторами АХЭ, которые были идентифицированы в рамках нашего предыдущего проекта РНФ. Эта работа будет состоять из следующих компонентов: Фаза in vitro будет включать: а) подготовку нанореакторов, исследование их стабильности и физико-химических свойств, а также параметров кинетики по отношению к модельным ФОС; б) оценку каталитических свойств и стабильности ферментов, подготовленных для включения в нанореакторы, в т.ч. экспрессированных мутантов БХЭ; в) исследование кинетических механизмов ингибирования и защиты АХЭ выбранными обратимыми лигандами; Фаза in vivo будет посвящена исследованиям отобранных лигандов и функционирования нанореакторов на животных: а) сдвиг LD50 параоксона у мышей; б) исследование способности нанореакторов предотвращать нейроднгенеративные изменения, вызванные отравлением параоксоном Новизна этого проекта заключается, в основном, в использовании нанореакторов. Нанореакторный подход в медицине является относительно новым, но уже была показана его экспериментальная эффективность в лечении рака, в борьбе с токсичностью активных форм кислорода при воспалительных процессах, а также для коррекции метаболических и генетических дефектов с помощью инкапсулированных ферментных коктейлей, действующих в каскадных реакциях. Этот подход до сих пор не был реализован в лечении/детоксикации при отравлении фосфорорганическими соединениями.

Ожидаемые результаты
Мы планируем: 1) разработать нанореакторы, содержащие инкапсулированные реактиваторы и ферменты, которые инактивируют ФОС для лечения отравления этими ядами; этот пункт включает экспрессию в клетках яичников китайских хомячков (СНО) новых мутантов БХЭ, способных гидролизовать ФОС 2) начать исследование лигандов холинэстераз, представляющих фармакологический интерес для защиты холинергической системы (нервно-мышечное соединение и центральные холинергические синапсы) от антихолинэстеразных токсинов, а также для использования в паллиативном лечении некоторых нейродегенеративных заболеваний, в частности, болезни Альцгеймера и миастении гравис. Подробнее об этих пунктах: 1) Включение нескольких биоловушек, способных реагировать стехиометрически (человеческая БХЭ дикого типа) и каталитически (мутанты человеческой БХЭ) со всеми типами ФОС в инъектируемый нанореактор, содержащий инкапсулированные оксимы (реактиваторы фосфорилированных БХЭ дикого типа), безусловно, самая серьезная цель этого проекта. Инкапсуляция ферментного коктейля и реактиваторов в герметичные наноконтейнеры представляется сложной задачей. Однако ученые, которые будут участвовать в нашем проекте, освоили нанотехнологию инкапсуляции. Испытания in vitro и in vivo будут проводиться для исследования снижения токсического действия параоксона как модельного ФОС. Нанореакторы будут действовать как циркулирующий «нано-комбинат» для детоксикации большого спектра ФОС. Это будет первый подобный комплекс, изготовленный для этой цели. В течение примерно 25 лет разрабатывалась концепция каталитических биоловушек на основе холинэстераз. Первоначальные попытки не позволили создать работающие мутанты ХЭ, способные гидролизовать ФОС с высокой скоростью. Фактически, первые мутанты человеческой БХЭ (1995-2002) были сделаны на основе смоделированной трехмерной структуры человеческой БХЭ, с использованием атомных координат АХЭ Torpedo californica. Затем были разработаны другие мутанты, на основе реальной трехмерной структуры человеческой БХЭ (2003-2008). Однако ни структура интермедиатов реакции фосфорилирования/дефосфорилирования и энергии ее активации, ни молекулярная динамика фермента не учитывалась. На протяжении нескольких лет мы участвуем в совместных работах с группой специалистов по молекулярному моделированию, которые проводят расчеты энергетических профилей реакций и оценку конформационной стабильности мутантов с использованием методов КМ/ММ и молекулярной динамики. Отправной точкой для создания более эффективных каталитических биоловушек на основе холинэстераз являются недавно полученные экспериментальные результаты для мутантных ферментов, разработанных при помощи компьютерного дизайна. Эти мутанты БХЭ человека будут экспрессироваться в клетках CHO. Каталитические биоловушки как биофармацевтические препараты являются наиболее перспективными новыми средствами против отравления фосфорорганическими агентами. Поскольку наша исследовательская группа имеет обширный и признанный опыт в этой области, мы надеемся, что наши результаты окажут значительное влияние на научное сообщество. 2) В нашем предыдущем исследовании (проект РНФ 17-14-01097) мы искали модуляторы холинэстеразы, способные связываться с ХЭ, сдвигая медленное равновесие между формами этих ферментов в сторону той, которая наиболее медленно реагирует с ФОС. Неожиданным результатом было то, что, большинство аффинных лигандов связываются с формой, которая быстрее реагирует с ФОС. Однако, один из этих лигандов (незаряженный трифторкетон, TFK) — т.н. аналог переходного состояния (более корректно — тетраэдрического интермедиата) ацетилхолина — образует лабильную ковалентную связь с каталитическим серином активного сайта ХЭ. Это, в свою очередь, может защитить ХЭ от чрезвычайно токсичных ковалентных ингибиторов, точно так же, как действуют карбаматы, такие как пиридостигмин и физостигмин. Поскольку это соединение является незаряженным, мы считаем, что холинэстеразы периферической и центральной нервной систем, могут быть временно защищены от токсичных молекул ФОС, будучи связанными с другими лигандами. Таким образом, такой ингибитор может быть использован для профилактики отравления ФОС. Этот ингибитор (TFK) будет испытан на животных в модели отравления параоксоном. TFK также близок по строению силильному соединению — зифросилону — который рассматривался как потенциальное лекарственное средство для паллиативного лечения болезни Альцгеймера. Однако сродство TFK к человеческой АХЭ выше, чем у зифросилона. В связи с этим, TFK также будет испытан на крысах, с моделью болезни Альцгеймера. Другой лиганд АХЭ, который также будет испытан in vivo — альфа-токоферол. В дополнение к его ингибирующему действию на АХЭ (ингибитор медленного связывания типа A), это соединение также является антиоксидантом. Таким образом, он обладает преимуществами многоцелевого направленного лиганда (MTDL).


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Одной из основных задач проекта является создание полимерсом, которые планируется использовать в качестве ферментных многокомпонентных нанобиореакторов, предназначенных для борьбы с отравлениями фосфорорганическими ингибиторами (ФОИ). Предполагается, что полимеросомы будут содержать БХЭ в высокой концентрации и наночастицы, заполненные реактиватором активности холинэстераз (оксимом). В отчетный период нами впервые было проведено моделирование работы такого нанореактора in vitro, а именно была изучена кинетика реакции нейтрализации параоксона с помощью высоких концентраций человеческой БХЭ. Для создания полимерсомной оболочки были синтезированы два типа полимеров: поли (стирол-акриловая кислота) (PS-PAA) и производные монометиловых эфиров полиэтиленгликолей (MPEG-PPS-MPEG). Кроме того, мы провели работы по поиску оксимов, способных наилучшим образом реактивировать диэтилфосфорилированную БХЭ в присутствии высокой концентрации оксима. Для инкапсуляции в наночастицы на последующих этапах проекта нами был выбран пралидоксим (2-ПАМ), который обладает самой высокой kobs для БХЭ, ингибированной параоксоном. Вторым направлением работ в рамках проекта была экспрессия мутантов БХЭ в культуре клеток CHO. С целью увеличения уровня биосинтеза белка на данном этапе проекта была получена усовершенствованная система экспрессии БХЭ на основе вектора pcDNA 3.4 (Thermo Scientific, США). Исследования каталитической активности модельного мутанта БХЭ человека (G117H), были проведены с использованием высокочувствительного зонда «Probe IV», что позволяет определять каталитические параметры мутанта G117H с использованием на 3-4 порядка более низких концентраций фермента. Данная мутация позволяет БХЭ самореактивироваться после фосфорилирования различными ФОИ. Были проведены in vitro и in vivo исследования ингибиторов АХЭ человека, представляющие потенциальный медицинский интерес. Были определены кинетические параметры и механизмы ингибирования для обоих ингибиторов. Дополнительно были проведены работы по молекулярному моделированию процесса ингибирования АХЭ молекулой TFK и получено постадийное описания механизма взаимодействия фермента с ингибитором (быстрое связывание, медленный шаг, ковалентное взаимодействие). Результаты этой части опубликованы [Zueva et al., Biomolecules 2020, 10(12), 1608; DOI:10.3390/biom10121608]. Были проведены исследования in vivo на мышах и крысах для исследования возможности использования этого соединения для профилактики отравлений ФОИ. Это соединение обладает низкой токсичностью (LD50 = 19 мг/кг для мышей линии CD1 mice). Такой низкий для ингибиторов АХЭ уровень острой токсичности делает TFK перспективным для фармакологического применения. В связи с этим, на этапе 2020 года нами была исследована способность TFK увеличивать эффективность антидотной терапии отравления параоксоном. Известно, что если существует угроза отравления ФОИ, то превентивное (до отравления) применение обратимых ингибиторов АХЭ позволяет протектировать активный центр АХЭ от необратимого фосфорилирования ФОИ, что увеличивает эффективность последующей антидотной терапии. Было показано, что TFK в дозе 5 мг/кг увеличивает выживаемость мышей при отравлении параоксоном.

 

Публикации

1. Зуева И.В., Лущекина С.В., Потье И.Р., Дарвеш С., Массон П. 1-(3-Tert-Butylphenyl)-2,2,2-Trifluoroethanone as a Potent Transition-State Analogue Slow-Binding Inhibitor of Human Acetylcholinesterase: Kinetic, MD and QM/MM Studies Biomolecules, 10(12), 1608 (год публикации - 2020).

2. Мухаметгалиева А.Р., Лущекина С.В., Агълямова А.Р., Массон П. Steady-state kinetics analysis and molecular modeling of human cholinesterases competing substrates over wide concentration ranges: toxicological and pharmacological implications Vth International Conference ?Actual Scientific & Technical Issues of Chemical Safety? (ASTICS-2020) Kazan, October 6 - 8, 2020. / Book of Abstracts eds.: Prof. Alexander V. Roshchin, PhD Elena G. Raevskaya [Electronic resource] Kazan. 2020, P. 192-193 (год публикации - 2020).