Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Одной из основных задач проекта является создание полимерсом, которые планируется использовать в качестве ферментных многокомпонентных нанобиореакторов, предназначенных для борьбы с отравлениями фосфорорганическими ингибиторами (ФОИ). Предполагается, что полимеросомы будут содержать БХЭ в высокой концентрации и наночастицы, заполненные реактиватором активности холинэстераз (оксимом). В отчетный период нами впервые было проведено моделирование работы такого нанореактора in vitro, а именно была изучена кинетика реакции нейтрализации параоксона с помощью высоких концентраций человеческой БХЭ. Для создания полимерсомной оболочки были синтезированы два типа полимеров: поли (стирол-акриловая кислота) (PS-PAA) и производные монометиловых эфиров полиэтиленгликолей (MPEG-PPS-MPEG). Кроме того, мы провели работы по поиску оксимов, способных наилучшим образом реактивировать диэтилфосфорилированную БХЭ в присутствии высокой концентрации оксима. Для инкапсуляции в наночастицы на последующих этапах проекта нами был выбран пралидоксим (2-ПАМ), который обладает самой высокой kobs для БХЭ, ингибированной параоксоном. Вторым направлением работ в рамках проекта была экспрессия мутантов БХЭ в культуре клеток CHO. С целью увеличения уровня биосинтеза белка на данном этапе проекта была получена усовершенствованная система экспрессии БХЭ на основе вектора pcDNA 3.4 (Thermo Scientific, США). Исследования каталитической активности модельного мутанта БХЭ человека (G117H), были проведены с использованием высокочувствительного зонда «Probe IV», что позволяет определять каталитические параметры мутанта G117H с использованием на 3-4 порядка более низких концентраций фермента. Данная мутация позволяет БХЭ самореактивироваться после фосфорилирования различными ФОИ. Были проведены in vitro и in vivo исследования ингибиторов АХЭ человека, представляющие потенциальный медицинский интерес. Были определены кинетические параметры и механизмы ингибирования для обоих ингибиторов. Дополнительно были проведены работы по молекулярному моделированию процесса ингибирования АХЭ молекулой TFK и получено постадийное описания механизма взаимодействия фермента с ингибитором (быстрое связывание, медленный шаг, ковалентное взаимодействие). Результаты этой части опубликованы [Zueva et al., Biomolecules 2020, 10(12), 1608; DOI:10.3390/biom10121608]. Были проведены исследования in vivo на мышах и крысах для исследования возможности использования этого соединения для профилактики отравлений ФОИ. Это соединение обладает низкой токсичностью (LD50 = 19 мг/кг для мышей линии CD1 mice). Такой низкий для ингибиторов АХЭ уровень острой токсичности делает TFK перспективным для фармакологического применения. В связи с этим, на этапе 2020 года нами была исследована способность TFK увеличивать эффективность антидотной терапии отравления параоксоном. Известно, что если существует угроза отравления ФОИ, то превентивное (до отравления) применение обратимых ингибиторов АХЭ позволяет протектировать активный центр АХЭ от необратимого фосфорилирования ФОИ, что увеличивает эффективность последующей антидотной терапии. Было показано, что TFK в дозе 5 мг/кг увеличивает выживаемость мышей при отравлении параоксоном.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Одна из основных задач проекта - создание ферментных многокомпонентных нанобиореакторов, предназначенных для профилактики/лечения отравлений, вызванных фосфорорганическими соединениями (ФОС). Нанореакторы представляют собой полимерсомы, содержащие ферменты (бактериальную PTE и/или БХЭ человека дикого типа), а также наночастицы, наполненные реактиватором (оксим), специально разработанным для быстрой реактивации БХЭ. Созданы нанореакторы, содержащие мутанты фосфотриэстеразы термофильных архей Sulfolobus solfataricus (PTE) в качестве каталитической биоловушки, предназначенные для использования при профилактике и лечении отравления ФОС и исследованы in vitro и in vivo в отношении параоксона (POX), выступающего в качестве модели ФОС. Нанореакторы представляют собой монодисперсные полимерсомы (PDI = 0.18) сферической формы, диаметром 139 ± 3.5 нм и дзета-потенциалом -19 мВ, содержащие фермент в высокой концентрации 0.02 мМ и эффективностью капсулирования и загрузки 82% и 12%, соответственно. Полимерная мембрана представляла собой блок-сополимер полиэтиленгликоль-полипропиленсульфид, обеспечивающая проникновение реагента POX и выход продукта гидролиза (п-нитрофенол). Для создания новых полимерных оболочек нанореакторов были синтезированы серии блок-сополимеров поли(стирол-акриловая кислота) с удаленным концевым алкильным радикалом PS-PAA-SH и PS-PAA-C-CN и производные монометиловых эфиров полиэтиленгликоля при варьировании их гидрофильно-липофильного баланса. Был протестирован новый оксим (AB 746), способный реактивировать диэтилфосфорилированную БХЭ с высокой скоростью. Полученный реактиватор является одним из самых быстрых для реактивации фосфилированной БХЭ (константа реактивации = 0.05 мин-1 с параоксоном; константа диссоциации = 0.13 мкМ). Следует отметить, что теория ферментативных нанореакторов все еще находится в зачаточном состоянии. Поэтому параллельно с экспериментальной работой начата работа над теорией ферментативных нанореакторов, некоторые предварительные элементы этой теории были опубликованы в обзоре. Установлено, что предварительное (профилактическое) внутривенное введение нанореактора с загруженным ферментом (100 мкл) за 5 мин до заражения POX были способны защитить мышей (сдвиг составляет 7xLD50) без каких-либо дополнительных препаратов. Однократное введение загруженных PTE-нанореакторов через 1 мин после заражения POX защищало мышей от POX ip. (сдвиг составляет 3.3xLD50). Высокий терапевтический индекс, обеспечиваемый профилактическим введением ферментосодержащих нанореакторов, предполагает, что никаких других препаратов для защиты животных от острой токсичности POX не требуется. Это первый результат, демонстрирующий эффективность разрабатываемого нами подхода с использованием нанореакторов. Проведена экспрессия новых компьютерно-сконструированных мутантов БХЭ в культуре клеток CHO. Получены новые мутанты с невысокой активностью, однако, которые более активны, чем контрольный мутант G117H. В рамках исследования сложных каталитических механизмов холинэстераз представлен полный анализ ингибирования/активации ферментов (АХЭ и БХЭ) в широком диапазоне субстратов и конкурентов. Предложен механизм, учитывающий аллостерические взаимодействия как между каталитическими, так и периферическими центрами. Исследования ингибиторов АХЭ человека, представляющих медицинский интерес (альфа-токоферола и TFK) - завершены и опубликованы. In vivo исследования TFK показали, что он обеспечивает умеренную и непродолжительную защиту от токсичности ФОС. Модулирующий эффект альфа-токоферола противоположный, но слабый. Эксперименты ex vivo на изолированной мышечной диафрагме мышей показали, что альфа-токоферол не защищает АХЭ нервно-мышечного соединения от токсичности ФОС.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Работы, выполненные в течении третьего года, проекта включают 3 части: 1) проектирование и применение терапевтических ферментных нанореакторов для профилактики и постэкспозиционного лечения отравлений фосфорорганическими соединениями (параоксон в качестве модели ФОС); В качестве nR были спроектированы полимерные везикулы - полимерсомы, как наиболее перспективные для реализации настоящего проекта. В полимерсомы были инкапсулировали ферменты (hБХЭ и ФТЭ), продукты реакции (п-нитрофенол) и малые молекулы – реактиваторы hБХЭ (оксимы), была установлена структура nR и их физико-химические свойства. С целью получения мембраны (оболочки) nR были синтезированы новые блок-сополимеры, не влияющие на активность ферментов, а именно: “инвертированные » полимерные образцы PS-PAA и блок-сополимеры полисульфид-полиэтиленгликоль (PPS-PEG) с бензильной группой на конце полимерной цепи, в структуре которых отсутствует, чувствительная к различным физико-химическим факторам, связь S-S. Для контроля проницаемости мембраны nR и диффузии малых молекул (оксимы, pNp) были получены полимерсомы, содержащие pNp и 2-Pam с размерами 140 нм и 150 нм, соответственно, и эффективностью инкапсулирования 99%. Для всех полимерсом установлен взрывной характер высвобождения pNp. С увеличением концентрации блок сополимера наблюдается незначительное замедление выхода pNp. Устновлено, что для полимерсомы с максимальной концентрации блок-сополимера 0.5% (масс.) pNp (50%) высвобождается за 8 мин. Полное высвобождение pNp происходит примерно за 3-4 часа Инкапсулирование ферментов hБХЭ и ФТЭ в нанореакторы приводит к увеличению размеров от 94±2 нм (в отсутствие фермента) до 108±1 нм (в присутствии фермента) для mPEG44-PPS70-Ph и от 140±2 нм (в отсутствие фермента) до 161±2.5 нм (в присутствии фермента) в случае блок-сополимера mPEG16-PPS30-Ph, морфология нанореакторов - сферическая. Эффективность капсулирования SsoPOX в нанореакторы составляла около 70%. Контроль функциональности нанореакторов in vitro показал, что инактивация POX в кювете наблюдалась менее чем за 10 секунд, как со свободным, так и с загруженным SsoPOX в нанореакторы. Тесты in vivo с нанореакторами для защиты мышей от токсичности параоксона показали, что наиболее эффективными оказались нанореакторы на основе mPEG44-PPS70-Ph, загруженные Sso-Pox. Сдвиг ЛД50 для POX составляет 23.5×ЛД50 и 7.9×ЛД50 при внутривенном введении nR для профилактики и лечения, соответственно. Исследование фармакокинетики фермента SsoPOX, показало, что наблюдается разница между двумя типами полимерных мембран нанореакторов. Так внутривенно введенный как свободный SsoPOX так, загруженный в nR на основе mPEG16PPS34-S-S-PPS34mPEG16 демонстрирует t1/2 = 23±4 минуты. Внутривенное введенние SsoPOX загруженного в nR на основе mPEG44-PPS70-Ph демонстрирует t1/2 = 37±4 мин при его первом введении, 47±3 мин /27±5 мин при профилактике / лечении, соответственно. 2) Взаимодействие холинэстеразы с субстратами и фармакологическими лигандами. Опираясь на кинетику конкурирующих субстратов и с целью разобраться во внутреннем механизме каталитической модуляции, работа была направлена на активацию или ингибирование избытком субстрата из-за связывания заряженных субстратов или лигандов с периферическим анионным участком фермента (PAS). Установлено, что связывание вызывает аллостерическую модуляцию активности каталитического центра за счет движения как омега-петли, так и петли, связывающей ацил, которые соединяют PAS с каталитическим центром. В случае, когда происходит активация при высокой концентрации субстрата или за счет связывания лиганда, каталитическая константа умножается на коэффициент b, b>1t. Когда есть ингибирование, b<1. Работа была направлена на определение механистической значимости фактора b для того, чтобы определить, зависит ли немихаэлевское каталитическое поведение от ацилирования, деацилирования или от обеих стадий. Исследования проводились in silico на АХЭ и БХЭ человека с помощью молекулярного моделирования, КМ/ММ и молекулярной динамики, а также in vitro с помощью стационарной кинетики с использованием субстратов, несущих одинаковую ацильную часть. Также был использован арилацетиламидный субстрат с k2<<k3, затем скорость ацетилирования лимитируется (kcat = k2). Противоположные значения фактора b обоих ферментов для гидролиза ацил(тио)холина по сравнению с гидролизом бензоил(тио)холина показали, что оба взаимодействия ацил- и этанол/фенольной группы в каталитическом активном центре важны для определения активации или ингибирования. избытком субстрата. Однако кинетический анализ гидролиза (тио)холинового эфира, катализируемого холинэстеразой, не мог решить, зависит ли значение b от ацилирования, деацилирования или обеих стадий. Тем не менее, моделирование гидролиза (тио)холинового эфира показало, что вклад ацилирования в b является доминирующим. Наконец, исследование кинетики гидролиза арилацетиламидного субстрата ясно показало, что для обеих ХЭ фактор b зависит исключительно от ацилирования. Молекулярная динамика и КМ/ММ моделирование гидролиза обоих типов субстратов показали, что b зависит от диссоциации тетраэдрического промежуточного соединения субстрата на ацетилированный фермент и этанол/фенольный продукт P1. Таким образом, ацилирование является ключевой химической стадией активации/ингибирования избытком субстрата при катализе ХЭ. Аллостерический эффект, возникающий в результате связывания положительно заряженных субстратов на периферическом анионном участке, влияет на стадию ацилирования за счет движения как омега-петли, так и петли, связывающей ацил. Это вызывает активацию или ингибирование каталитической активности и определяет величину фактора b. Обратимые лиганды вызывают такие же модулирующие эффекты. 3) Новые мутанты БХЭ для их использования в нанореакторах в качестве биоловушек Были разработаны новые мутанты БХЭ на основе ранее описанных концепций создания новых каталитических механизмов, позволяющих гидролизовать фосфорилированный аддукт фермента. Были проведены КМ/ММ расчеты для описания энергетических характеристик каталитической реакции дефосфорилирования. Было также проведено молекулярно-динамическое моделирование, показавшее, что внесенные мутации негативно сказываются на стабильности фермента. В настоящее время происходит лавинообразное внедрение методов машинного обучения и искусственного интеллекта в сферу биофизики и хемоинформатики. Так, появился целый ряд инструментов, на основе нейронных сетей и схожих подходов, позволяющих оценить влияние точечных мутаций на фолдинг белковых молекул, их стабильность, а также предсказывающих стабилизирующие мутации. Это является основным направлением дальнейшей разработки каталитических биоловушек на основе БХЭ и других ферментов.