КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 20-14-00166

НазваниеОпухоль-специфический фолдинг мембранных белков

РуководительКиямова Рамзия Галлямовна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет", Республика Татарстан

Года выполнения при поддержке РНФ2020 - 2022

КонкурсКонкурс 2020 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словамембранные белки, фолдинг, топогенез, опухоль-специфический эпитоп, NaPi2b, моноклональные антитела, липиды, рак яичника

Код ГРНТИ34.15.05


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Поиск специфических мишеней для таргетной противоопухолевой терапии остается приоритетной задачей в современной онкологии. Мембранные белки в силу своей локализации представляют особый интерес для противоопухолевой терапии. Как известно, злокачественная трансформация клеток сопровождается значительными изменениями клеточного микроокружения, включая окислительный стресс, гипоксию, снижение рН среды (Lecoeur et al., 2001; Grill et al., 2016; Christiansen et al., 2014). Эти факторы, наряду с накопленными мутациями, аберрантными модификациями и потерей асимметрии липидов плазматической мембраны, что свойственно опухолевым клеткам, могут значительно влиять на фолдинг и топогенез (пространственное распределение на клеточной мембране) мембранных белков. На данный момент недостаточно информации об особенностях изменения топологии и конформации мембранных белков в опухолевых клетках. Выявление фундаментальных закономерностей фолдинга мембранных белков в условиях измененного микроокружения опухолевых клеток является крайне важным для молекулярной онкологии и позволит разработать новые подходы для таргетной терапии и диагностики конкретных видов опухолей. В рамках этого проекта мы предлагаем новую концепцию образования опухоль-специфических эпитопов мембранных белков в результате аберрантного фолдинга в условиях гипоксии и низкого рН на модели фосфатного транспортера NaPi2b. Натрий–зависимый фосфатный транспортер NaPi2b был идентифицирован в качестве молекулярной мишени для моноклональных антител MX35 (Yin, Kiyamova et al., 2008), которые распознают эпитоп в районе большого экстрамемдранного домена 4 (ЭМД 4). На сегодняшний день гуманизированные версии антител МХ35 – Rebmab200 и XMT-1536 проходят клинические испытания для лечения рака яичника и легкого (Lindegren et al., 2015; Lopes dos Santos et al., 2013; Tolcher et al., 2019). NaPi2b (антиген МХ35) - это мембранный белок, который принимает участие в поддержании фосфатного гомеостаза в организме (Murer et al., 2004). Несмотря на то, что NaPi2b экспрессируется в нормальных тканях, терапевтические антитела MX35 накапливаются, преимущественно, в опухолевых клетках (Rubin et al., 1993; Finstad et al., 1997; Andersson et al., 2009), что позволяет, вкупе с особенностями распознавания NaPi2b моноклональными антителами, предположить наличие опухоль-специфичного эпитопа, конформацию и/или доступность которого может обеспечить только клетка опухоли. В данном проекте мы фокусируемся, прежде всего, на молекулярных механизмах, посредством которых мутации, окислительные (гипоксия) и липидные стрессы (потеря асимметрии липидов), а также посттрансляционные модификации (N-гликозилирование), характерные для клеток опухоли, приводят к аберрантному фолдингу четвертого экстрамембранного домена NaPi2b, вызывая экспонирование криптического или скрытого, потенциального опухоль-специфического эпитопа. Для решения поставленных задач будут привлечены специалисты в области молекулярной биологии, генной инженерии, биоинформатики, биологии липидов и мембранных белков. Будут применены современные методы биоинформатического анализа и молекулярной биологии, включая уникальную технологию Истерн-Вестерн блоттинга для изучения влияния липидов на фолдинг транспортера NaPi2b. Будет использована лазерная сканирующая конфокальная микроскопия и проточная флуориметрия с использованием антител против различных доменов транспортера NaPi2b для изучения доступности потенциального опухоль-ассоциированного эпитопа в клетках опухолевых клеточных линий в условиях, имитирующих опухолевое микроокружение. Для экспрессии фрагментов NaPi2b, будут использованы уникальные штаммы E. coli, способные к N-гликозилированию белков, что позволит очистить гликозилированные фрагменты NaPi2b для структурных исследований методом ядерно-магнитного резонанса. Кроме того, мы планируем разработать систему на основе различных амфипатических сополимеров для выделения мембранных белков в окружении липидов клеточной мембраны, которые могут быть использованы для структурных исследований с помощью криоэлектронной микроскопии. Таким образом, изучение фолдинга мембранного транспортера NaPi2b в условиях злокачественной трансформации приведет к пониманию молекулярных механизмов экспонирования потенциальных опухоль-специфических эпитопов мембранных белков в опухолевых клетках, что может быть в дальнейшем использовано для разработки новых, более специфичных средств диагностики и направленной терапии опухолевых заболеваний.

Ожидаемые результаты
В результате реализации проекта мы ожидаем получить принципиально новые данные о влиянии условий микроокружения опухоли (окислительный стресс, гипоксия, снижение рН) и модификаций (дисульфидные связи, гликозилирование) на фолдинг экстрамембранных доменов фосфатного транспортера NaPi2b, мишени для терапевтических гуманизированных моноклональных антител Rebmab200 и XMT-1536. Будет выявлена роль дисульфидных связей и N-гликозилирования в районе потенциального «криптического» эпитопа NaPi2b на распознавание моноклональными антителами, на транспортную активность транспортера, а также будут определены ключевые остатки цистеина, вовлеченные в образование дисульфидных связей и сайты гликозилирования, которые вносят существенный вклад в опухоль-специфическую конформацию эпитопа в районе экстрамембранного домена 4 (ЭМД4) NaPi2b. Впервые будет продемонстрировано взаимное влияние липидов, гликозилирования и окислительного фолдинга на конформацию экстрамембранного домена транспортера NaPi2b, а также действие отдельных липидов в качестве молекулярных шаперонов на распознавание потенциального опухоль-специфического эпитопа транспортера NaPi2b. Будет показана роль условий, имитирующих опухолевое микроокружение, на распределение липидов фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина и распознавание потенциального опухоль-специфического эпитопа NaPi2b специфическими антителами в клетках рака яичника. Будут разработаны новые подходы мирового уровня для выделения мембранного белка NaPi2b и его фрагментов с использованием полимерных систем в окружении нативных липидов, а также мутантных штаммов E.coli, способных к гликозилированию вновь синтезированных белков, для изучения структуры транспортера NaPi2b и его отдельных доменов методами ядерно-магнитного резонанса и криоэлектронной микроскопии. Будут выявлены новые типы опухолей и когорты больных для лечения и диагностики терапевтическими антителами Rebmab200 и XMT-1536. Полученные результаты позволят подтвердить или опровергнуть гипотезу о том, что структурная организация потенциального «криптического» эпитопа транспортера NaPi2b обусловлена оксидативным фолдингом, вызванным измененным метаболизмом и микрооружением, которые сопровождают злокачественное перерождение клеток. Полученные фундаментальные знания будут иметь важное значение для понимания молекулярных механизмов фолдинга мембранных белков в условиях опухолевого микроокружения клеток. Кроме того, полученные результаты будут иметь огромное значение для разработки новых, более специфичных диагностических и терапевтических препаратов и к снижению риска развития тяжелых побочных эффектов за счет специфического распознавания и элиминации преимущественно опухолевых клеток, что приведет к скорейшему выздоровлению больного и уменьшению затрат на его лечение и реабилитацию.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Целью данного проекта является изучение молекулярных механизмов образования потенциальных опухоль-специфических эпитопов в составе экстрамембранных доменов мембранных белков. Такие эпитопы представляют собой уникальные мишени для терапии онкологических заболеваний, в том числе, моноклональными антителами. В качестве объекта исследования нами выбран натрий-зависимый фосфатный транспортер NaPi2b, идентифицированный как мишень для терапевтических антител MX35 (Kiyamova et al., 2008; Yin et al., 2008) и созданных на их основе гуманизированных антител Rebmab200 (Santos et al., 2013), XMT-1536 (Bodyak et al., 2016) и ХМТ-1592 (Fessler et al., 2020), которые в настоящее время проходят клинические испытания для лечения рака яичника, легкого и почки. Особенности распознавания NaPi2b в Вестерн-блот анализе антителами MX35, а также то, что эти антитела специфично накапливаются именно в опухолевых клетках (Rubin et al., 1993; Finstad et al., 1997; Andersson et al., 2009), позволили нам сделать предположение о существовании опухоль-специфического эпитопа в составе транспортера NaPi2b (эпитоп MX35). Этот эпитоп MX35 был идентифицирован в пределах 311-340 а.о. большого внеклеточного домена (ЭМД4) NaPi2b (Kiyamova et al., 2008; Yin et al., 2008). Данные литературы и наши предварительные результаты показывают, что распознавание эпитопа МХ35 антителами зависит от добавления восстанавливающих агентов типа ДТТ в эукариотических клеточных линиях, но не в клетках бактерий. Это, а также тот факт, что NaPi2b является интенсивно гликозилированным мембранным белком с потенциальными сайтами гликозилирования, расположенными в области ЭМД4, позволило сделать предположение о влиянии гликозилирования ЭМД4 на доступность эпитопа MX35 для антител. Кроме того, поскольку злокачественная трансформация клеток связана со значительными изменениями фосфолипидного состава клеточных мембран (Azordegan et al., 2013), мы не исключаем возможности участия также липидов мембран в фолдинге внеклеточного ЭМД4 транспортера, где располагается эпитоп МХ35, по аналогии с белками прокариот (Bogdanov et al., 1996; Bogdanov et al., 2010; Dowhan et al., 2019). Таким образом, мы предполагаем, что распознавание эпитопа MX35 антителами может быть обусловлено конформацией ЭМД4 транспортера NaPi2b, стабилизированной дисульфидными связями, гликозилированием и липидами плазматической мембраны (Minigulova et al., 2019). При этом именно условия опухолевого микроокружения, для которых характерны гипоксия, ацидоз, окислительный и липидный стресс, могут способствовать экспонированию эпитопа МХ35 в клетках опухолей, что делает транспортер NaPi2b привлекательной мишенью для разработки специфичных противоопухолевых препаратов, включая моноклональные антитела. Задачами первого этапа проекта было изучение с помощью методов биоинформатики и молекулярной биологии особенностей строения и топологии NaPi2b, выявление ключевых остатков цистеина и/или аспарагина, которые влияют на образование конформации ЭМД4, ответственной за распознавание эпитопа MX35 моноклональными антителами L2 (20/3), аналогичными по свойствам антителам MX35, и на транспортную активность NaPi2b, а также проверка вклада фосфолипидов в формирование конформации ЭМД4, обеспечивающей доступность эпитопа MX35 для моноклональных антител. Анализ топологии транспортера NaPi2b методами in silico позволил предсказать его топологию и пространственную структуру. Предсказанная структура NaPi2b представляет собой 8 трансмембранных доменов, расположенных в плазматической мембране, внутри которых располагаются QSSS мотивы, обращенные друг к другу и ответственные за связь с ионами натрия и фосфата. Внутрь цитоплазмы обращены С- и N-концевые домены, а снаружи мембраны располагается большой внеклеточный домен ЭМД4, содержащий потенциальный опухоль-специфический эпитоп для антител МХ35 и L2 (20/3), а также терапевтических гуманизированных антител Rebmab200, XMT-1536 и XMT-1592, границы которого определены в пределах 250-360 а.о. С помощью молекулярной динамики in silico мы показали, что наиболее вероятные дисульфидные связи в районе ЭМД4 NaPi2b образуются между остатками цистеина в положениях 350 и 322. Ряд дисульфидных связей, определенный in silico по степени вероятности их образования, представляет собой С350-С322>>>С350-С328>>С350-С303>>С322-С328=ЭМД4 без дисульфидных связей. Интересно отметить, что остаток цистеина в положении 350 может образовывать дисульфидные связи со всеми остальными тремя остатками цистеина в районе ЭМД4. Предположительно связь С350-С322 (наиболее вероятная согласно результатам анализа in silico) является основной в физиологических условиях, а остальные связи, возможно, являются альтернативными и могут возникать при изменении физиологических условий, в том числе условий опухолевого микроокружения. Для выявления ключевых остатков цистеина, дисульфидная связь между которыми обуславливает конформацию ЭМД4, важную для распознавания эпитопа МХ35 и транспорта фосфатов, с помощью сайт-направленного мутагенеза в экспериментальных условиях были созданы генетические конструкты, кодирующие NaPi2b с заменами остатков цистеина на остатки аланина в положениях 303, 322, 328 и 350 (C303A, C322A, C328A, C350A). Созданными рекомбинантными конструктами были трансфицированы клетки рака яичника линии OVCAR-8, в которых отсутствует эндогенная экспрессия NaPi2b, и проверены в Вестерн-блот анализе антителами N-NaPi2b (15/1), распознающими N-концевой домен NaPi2b, и L2 (20/3), распознающими эпитоп MX35. Также была проанализирована транспортная активность мутантных по остаткам цистеина форм транспортера NaPi2b в этих клетках. Показано, что для распознавания эпитопа MX35 важны все четыре остатка цистеина в районе ЭМД4 транспортера NaPi2b, а для его транспортной активности из четырех остатков цистеина критичным является только остаток цистеина в положении 350. При этом наиболее вероятная дисульфидная связь С350-С322 приводит к конформации ЭМД4, обеспечивающий средний уровень транспорта, предположительно характерный для физиологичных условий (рН=7). Вторая по вероятности дисульфидная связь С350-С328 обеспечивает самый высокий уровень транспорта, а самая наименее вероятная связь С350-С303 обеспечивает транспортную активность ниже среднего уровня. В случае, когда мутация затрагивает ключевой остаток цистеина в положении 350, уровень транспортной активности становится очень низким, почти таким же, как на клетках OVCAR-8, которые не экспрессируют NaPi2b. Эти данные согласуются с данными in silico, которые свидетельствуют, что в отсутствии C350, дисульфидные связи образоваться не могут. Эти данные еще раз подтверждают, что конформация ЭМД4 важна для транспортной активности NaPi2b Таким образом, можно заключить, что мы впервые обнаружили роль большого внеклеточного домена транспортера в регуляции его транспортной активности и описали новый потенциальный механизм этой регуляции за счет изменения конформации большого внеклеточного домена транспортера (ЭМД4) из-за ре-аранжировки дисульфидных связей внутри ЭМД4. Пока не совсем понятно, как регулируется эта ре-аранжировка, но мы предполагаем, что большую роль в этом играет микроокружение клеток, включая специфику опухолевого микроокружения, которое сопровождается изменением рН, гипоксией, окислительным и липидным стрессом. Для изучения влияния этих условий на изменение конформации ЭМД4 в результате ре-аранжировки дисульфидных связей, что может влиять на распознавание эпитопа МХ35 и транспортную активность, предполагается использовать предсказанную нами модель пространственной структуры NaPi2b. Для выявления роли гликозилирования в распознавании эпитопа МХ35 были проведены эксперименты in silico и in vitroДля выявления сайтов гликозилирования, потенциально ответственных за распознавание эпитопа МХ35, были экспериментально созданы генетические конструкты, кодирующие мутантные варианты NaPi2b с заменами остатков аспарагина на остатки аланина в положениях 308, 313, 321, 335 и 340: sdm1 (N308А), sdm2 (N313А и N321А), sdm3 (N335А и N340А), sdm4 (N313А, N321А, N335А и N340А) и sdm5 (N335А, N340А, N313А и N321А). Созданными рекомбинантными конструктами были трансфицированы клетки линии OVCAR-8 и проверены в Вестерн-блот анализе антителами N-NaPi2b (15/1) и L2 (20/3). Показано, что замены N335А и N340А не приводят к изменению характера распознавания эпитопа МХ35 как в условиях с ДТТ, так и без него. Это свидетельствует о том, что, возможно, остатки аспарагина в положениях 335 и 340 не гликозилируются, либо это гликозилирование не играет роли в распознавании антителами эпитопа МХ35. А вот замены в положениях N308, N313 и N321 оказались критичными для распознавания эпитопа МХ35 антителами L2 (20/3) по данным Вестерн-блот анализа. Интересно отметить, что согласно результатам анализа in silico система 3NAG с гликозилированными остатками аспарагина в положениях 308, 313 и 321 является более стабильной, по сравнению с системой 2NAG (335 и 340), что подтверждает наши экспериментальные данные. Следующим этапом работы должно быть создание мутантных форм NaPi2b с индивидуальными заменами остатков аспарагина в положениях 295, 313 и 321 на остатки аланина с последующей проверкой их в Вестерн-блот анализе, чтобы определить, какой из них играет роль в экранировании эпитопа MX35. На сегодняшний день с уверенностью можно говорить, что остаток аспарагина в положении 308 является критичным для распознавания эпитопа МХ35 антителами L2 (20/3). В рамках первого этапа проекта нами также были отработаны условия дегликозилирования NaPi2b в составе клеточных лизатов с помощью PNGase F, фермента, который отщепляет высокоманнозные, гибридные и сложные олигосахаридные остатки между N-ацетилглюкозамином и остатком аспарагина. Подобранные условия будут использованы в будущих экспериментах по оценке вклада гликозилирования в распознавание эпитопа MX35 антителами L2 (20/3). С помощью уникальной технологии Eastern-Western-блот анализа получены предварительные данные об участии фосфолипидов, в частности цвиттериона фосфатидилэтаноламина, содержащего первичную аминогруппу и остатки жирных кислот с одинаковой степенью ненасыщенности (DOPE, ФЭ), в распознавании эпитопа MX35 моноклональными антителами L2 (20/3). Таким образом, в рамках первого года выполнения проекта «Опухоль-специфический фолдинг мембранных белков» показано, что остатки цистеина С303, С322, С328, С350, остатки аспарагина N308, N313 и N321, а также, предварительно, ФЭ обеспечивают формирование структуры ЭМД4, определяющей доступность эпитопа MX35 для антител МХ35, L2 (20/3), а также терапевтических гуманизированных антител Rebmab200, XMT-1536 и XMT-1592. Нам впервые удалось показать роль большого внеклеточного домена натрий-зависимого транспортера NaPi2b в регуляции его транспортной активности и описать новый потенциальный механизм этой регуляции за счет изменения конформации большого внеклеточного домена транспортера (ЭМД4) из-за ре-аранжировки дисульфидных связей внутри ЭМД4 транспортера и возможного участия фосфолипидов в этом процессе. С помощью специально разработанного подхода методами in silico проведен анализ топологии и предложена модель пространственной структуры транспортера NaPi2b. Полученные результаты внесли большой вклад в понимание структурных и функциональных особенностей транспортера NaPi2b, важных при дальнейшем изучении NaPi2b в качестве мишени для противоопухолевой терапии в физиологичных условиях и в условиях опухолевого микроокружения клеток.

 

Публикации

1. - Аспирантка ИФМиБ стала призером конкурса QIAGEN 2020 Медиапортал Казанского федерального университета, - (год публикации - ).

2. Богданов М.В., Пиршев К., Есилевский С., Рябичко С., Бойко В., Иванченко П., Киямова Р.Г., Гуан З.К., Рамсеер С., Доухан В. Phospholipid distribution in the cytoplasmic membrane of Gram-negative bacteria is highly asymmetric, dynamic, and cell shape-dependent SCIENCE ADVANCES, том 6, выпуск 23, номер статьи eaaz6333 (год публикации - 2020).

3. Киямова Р.Г., Минигулова Л.Ф., Скрипова В.С., Нургалиева А.К., Решетникова Д.Д., Савинская Л.А., Филоненко В.В., Богданов М.В. N-glycosylation status of membrane phosphate transporter NaPi2b is crucial for its epitope recognition by monoclonal antibody in tumour cells ANNALS OF ONCOLOGY, том 31, приложение 5, с. S1227-S1228, аннотация к встрече 34P (год публикации - 2020).