Аннотация результатов, полученных в 2020 году
За первый год выполнения проекта WT-форма эндонуклеазы Cas9 была наработана, выделена из супер-продуцирующих клеток E. coli по устоявшейся методике и охарактеризована методами масс-спектрометрии. Оценка целевой и нецелевой активности белка Cas9 in vitro на ДНК плазмидах показала высокую специфичность. Для изучения структуры белка были синтезированы химерная sgRNA, состоящая из 103 нуклеотидов, и 32-х звенные ДНК-субстраты. После чего были проведены эксперименты по водородно-дейтериевому обмену с последующей регистрацией полученных после расщепления пептидов методом масс-спектрометрии как отдельно белка, так и после образования фермент-субстратного комплекса. Визуализация пептидов, подвергшихся обмену водорода на дейтерий, представлена в виде видеофайлов как для белка (https://drive.google.com/file/d/1XEStyZlRpskc8GtxaOxtEcF9DGHfichK/view?usp=sharing), так и для фермент-субстратного комплекса (https://drive.google.com/file/d/1hn0fM3jDucY_THKFX2bnGNmEj9Tu9JNG/view?usp=sharing). Для этого, в том числе, получена трехмерная модель белка Cas9 и комплекса белка с РНК-ДНК субстратом методами компьютерного моделирования. И проведена молекулярная динамика комплекса Cas9-РНК-ДНК, со стабильностью комплекса на протяжении всей MD симуляции (10 нс). Показано, что отклонение атомных координат системы находятся в основном в диапазоне 2.0-4.0 Å. Наряду с этим показано, что расстояние между ионом Mg2+ и аминокислотами Asp-10 и Glu-766 остаётся порядка 2.0 Å. В течение отчетного периода проекту были посвящены как публикации на сайте телеканала ВЕСТИ Новосибирск (https://www.nsktv.ru/news/medicine/novosibirskie_uchenye_poluchili_grant_na_issledovaniya_v_sfere_genomnogo_redaktirovaniya/), так и на одноименном Youtube-канале (https://www.youtube.com/watch?v=qrbjWwwtmPQ&feature=emb_logo). Полученные результаты, в совокупности с уже имеющимися данными по структурной динамике Cas9, позволяют глубже понять особенности специфичности и селективности узнавания последовательности ДНК эндонуклеазой Cas9.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За второй год выполнения проекта были изучены структурные особенностей селективности и специфичности узнавания и расщепления эндонуклеазой Cas9 целевой ДНК, не полностью комплементарной sgRNA. Показано, что значимые отличия наблюдаются в доменах RuvC-I и REC3, при образовании комплексов с дуплексами, содержащими некомплементарные пары оснований. Также было изучено влияние положения некомплементарной пары оснований на эффективность работы фермента. Показано, что замены нуклеотидов в положениях около последовательности РАМ, могут приводить к существенному снижению скорости реакции расщепления олигонуклеотидов эндонуклеазой Cas9, однако реакция расщепления может проходить с не полностью комплементарным ДНК-субстратом. В рамках компьютерного моделирования проведен термодинамический анализ комплексообразования полученных траекторий МД. Расчет свободной энергии связи для ассоциации компонентов комплексов проводили методами MM-PBSA и MM-GBSA. Общая цель методов MM-PBSA и MM-GBSA заключается в расчете разницы свободной энергии между двумя состояниями, которые чаще всего представляют собой связанное и несвязанное состояние двух сольватированных молекул. Были получены значения энтальпий комплексообразования для: Cas9+РНК-ДНК; Cas9-РНК+ДНК; РНК+ДНК; ДНК+ДНК (для всех изучаемых дуплексов). Эксперименты показали, что для полного связывания белка необходимо 4 молекулы РНК. Образование комплекса характеризуется параметрами Kd = 8.86•10-7±2.10•10-7, dH = -34.5±2.7 ккал/моль, dS = -88.0±9.5 ккал/моль и dG = -7.94±0.68 ккал/моль. Изучение образования целевого комплекса, Cas9-РНК-ДНК проводили добавлением к заранее сформированному комплексу фермента с рибонуклуиновой кислотой как оцДНК, так и ДНК-дупллекса. Данная схема эксперимента была выбрана по причине того, что диссоциация ДНК-дуплекса может вносить вклад в наблюдаемые тепловые эффекты при формировании комплекса с РНК. Однако в результате проведенных экспериментов оцДНК и дцДНК показали близкую эффективность взаимодействие с Cas9-РНК с Kd = 9,80•10-9 и с Kd = 4.29•10-8±2.26•10-9 соответственно. В результате компьютерного моделирования было проведено уточнение структуры белка Cas9 на основе результатов водородно-дейтериевого обмена, получена уточненная модель комплекса Cas9 с РНК-ДНК-дуплексом, содержащим ионы Mg2, и проведено моделирование структуры 20 ДНК дуплексов. По результатам структурного анализа, выполненного методами масс-спектрометрии водородно-дейтериевого обмена (HDX-MS) и молекулярного моделирования (MD), предложен механистический механизм взаимодействия эндонуклеазы Cas9 с направляющей РНК (sgRNA) и ДНК-субстратом. Полученные данные указывают на существенное изменение конформации доменов RuvC III, REC3, HNH и CTD, линкерных последовательностей Arg и L-II при связывании Cas9 с РНК и ДНК. В то же время домены REC1-2 и RuvC II характеризуются большей стабильностью. Сравнение модельных структур и характера обмена амидных протонов в последовательности свободного белка (apoCas9) и его комплексов с sgRNA и ДНК-субстратом, позволило установить участки, вовлеченные во взаимодействие с нуклеиновой кислотой (Рисунок 9). В частности, пептиды нуклеазных субдоменов RuvC II and RuvC III при переходе от свободной формы фермента к связанной в большей или меньшей степени увеличивают доступность своих амидных протонов для обмена. Вероятнее всего, конформация этих доменов существенно изменяется при связывании с sgRNA, при этом структура становится более «рыхлой», а амидные протоны более доступными для растворителя. По данным моделирования взаимодействие α-спирального пептида 719-727 с sgRNA в области оснований G11-C14 протоспейсера приводит к его трансформации в слабо организованную петлевую структуру и возрастанию эффективности обмена. В другом нуклеазном домене HNH было детектировано 4 пептида со средним уровнем обмена. Образование комплекса с РНК также приводит увеличению доступности амидных протонов этого участка для растворителя и усилению обмена. В течение отчетного периода проекту были посвящены публикации в СМИ на сайте ТАСС Наука (https://nauka.tass.ru/nauka/13202007), на сайте Академгородок 2.0 (https://academcity.org/content/perspektivnyy-belok) и на сайте Интерфакс Россия (https://www.interfax-russia.ru/siberia/news/strukturu-belka-vosstanavlivayushchego-dnk-cheloveka-vpervye-opisali-novosibirskie-uchenye). Полученные результаты, в совокупности с уже имеющимися данными по структурной динамике Cas9, позволяют глубже понять особенности специфичности и селективности узнавания последовательности ДНК эндонуклеазой Cas9.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
За третий год выполнения проекта были наработаны, выделены, очищены и охарактеризованы мутантные формы Cas9: D10A, H840A и двойной мутант D10A H840A. Мутантные формы Cas9 были получены по известной методике с некоторыми модификациями, которые позволили повысить выход и чистоту выделенных белков. В течение года было наработано достаточное количество ферментов для проведения всех запланированных экспериментов. Белки D10A, H840A, двойной мутант D10A•H840A были охарактеризованы как биохимическими методами (показана их электрофоретическая гомогенность), так и методами масс-спектрометрии: трипсиновый гидролизат белка методом MALDI-TOF, пепсиновый гидролизат белка методом ВЭЖХ-МС высокого разрешения. Были получены данные о степени обмена протонов на дейтерий для мутантных форм Cas9: D10A, H840A и двойной мутант D10A H840A для построения их структуры в растворе. Для этого проведена регистрация изменений распределения дейтерия в пептидах, полученных после расщепления трёх мутантных форм Cas9: D10A, H840A и двойного мутанта D10A•H840A. Изучено влияние точечных мутаций на трёхмерную структуру Cas9 в растворе. Наряду с установлением структурно-динамических особенностей существования мутантных форм Cas9 в растворе, нам удалось улучшить метод HDX-MS, тем самым увеличив ранее неразрешенные участки белка. Благодаря усовершенствованию метода нам удалось установить структурные особенности участков Cas9 в пептидах, содержащих точечные мутации (ранее данные участки последовательности были разрешены не в полной мере). Таким образом, проанализировав процессы H/D обмена, происходящие в четырёх различных формах эндонуклеазы (дикий тип, D10A, H840A, D10A_H840A), можно сделать вывод, что несмотря на видимые различия в тепловых картах, все трёхмерные структуры форм белка с хорошей точностью совпадают. Большой вклад в различие между 3D структурами вносят свободно флуктуирующие петли, а также элементы вторичной структуры, находящиеся близко к поверхности. Такие элементы могут, как выходить на поверхность белковой глобулы, так и скрываться за окружающими доменами. Для полученных мутантных форм Cas9 была определена каталитическая активность для сопоставления с различием в полученных структурах. Для этого была проведена оценка целевой и нецелевой активности мутантных форм белка Cas9 in vitro на ДНК плазмидах. Анализ активности мутантных форм на модельных субстратах показал более низкий процент расщепления для никазы H840A по сравнению с ферментом дикого типа и мутантом D10A. Наличие мисматчей, в различных положениях от протоспейсера, полученных за счет замены нуклеотидов в некомплементарной цепи не оказали влияния на эффективность работы никаз. Двойной мутант D10A•H840A не проявлял каталитической активности, ни на плазмидах, ни на модельных субстратах. На основе экспериментальных данных методом компьютерного моделирования предложено строение мутантных форм Cas9: D10A, H840A и двойного мутанта D10A H840A и показаны отличия от дикого типа фермента. В рамках компьютерного моделирования был проведен термодинамический анализ комплексообразования полученных траекторий МД и сравнение значений для комплексов Cas9-РНК/ДНК и Cas9/РНК дикого типа Cas9 и трёх его мутантных форм. Также мы проанализировали влияния внесённых мутаций на структуру активных центров ферментов. Нами было проведено компьютерное моделирование по алгоритму молекулярной динамики структур эндонуклеазы Cas9 с единичными заменами D10A и H840A, а также двойного мутанта D10A H840A. В результате анализа молекулярно-динамических траекторий было показано, что основной вклад в энергию связывания с ДНК вносит молекула РНК, однако влияние белкового окружения в термодинамическую составляющую ощутимо и составляет ~20 ккал/моль. По результатам термодинамического анализа, внесение мутаций в Cas9 немного дестабилизирует трёхкомпонентный комплекс, в то же время, происходит стабилизация комплекса белка с направляющей РНК.