Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Фундаментальной задачей, на решение которой направлено настоящее исследование, является изучение механизмов функционирования медь-содержащих оксидоредуктаз, а также механизмов направленного транспорта и регулирования уровня ионов меди, обеспечивающих устойчивость живых организмов к изменениям концентрации меди в окружающей среде. В рамках настоящего проекта решение этой задачи проводится на примере медь-содержащего фермента – тиоцианатдегидрогеназы (TcDH), которая катализирует реакцию окисления тиоцианата с образованием цианата, серы и переносом двух электронов на акцептор. Анализ полученных нами ранее пространственных структур TcDH показал, что активный центр фермента содержит три иона меди (Cu1, Cu2 и Cu3) и набор консервативных аминокислотных остатков, в том числе остатки, координирующие ионы меди: His206, His381 и Asp314 для Cu1; His135, His528 и Lys103 для Cu2, причем ион Cu2 может занимать два положения, в одном из которых он координирован остаком Lys103, а в другом – нет; His437 и His482 для Cu3; а также каталитические остатки His136 и Glu288, участвующие в активации молекулы воды, осуществляющей нуклеофильную атаку на молекулу субстрата. Еще одним полуконсервативным остатком активного центра является остаток Phe436. Предполагается, что Phe436 участвует в формировании гидрофобной стенки активного центра и может влиять на свойства соседнего с ним остатка His437 – лиганда иона Cu3. На первом этапе выполнения проекта для проверки роли консервативных остатков в катализе и формулировки молекулярного механизма действия TcDH: 1. Получены, выделены и охарактеризованы точечные мутанты TcDH cо следующими заменами остатков активного центра: Lys103Arg, Lys103Gln, Phe436Leu, Phe436Ala, Phe436Gln. Мутант K103R образует в растворе высокомолекулярные агрегаты и в дальнейшей работе не использовался. Мутантные формы TcDH с точечными заменами Lys103Gln, Phe436Leu, Phe436Ala, Phe436Gln существуют в растворе в димерной форме, как и нативный фермент. Насыщенный ионами меди Cu(II) TcDH K103Q содержал 1.3 иона меди на субъединицу и не обладал ферментативной активностью. Получена структура TcDH K103Q. Сравнительный анализ структур TcDH «дикого типа» и TcDH K103Q показал, что замена Lys103, участвующего в координации иона меди Cu2, приводит к значительным перестройкам активного центра, в результате которых наблюдается частичная потеря или замещение (на ионы Zn из кристаллизационного раствора) всех трех ионов меди каталитического кластера, связанная с изменением положения остатка Asp314, координирующего Cu1, и отсутствием остатка Lys103, координирующего Cu2. Остаток Gln103 в мутантной форме не образует координационную связь с Cu2 и не образует водородные связи с Glu288. Можно предположить, что Lys103 играет ключевую роль в формировании и стабилизации каталитически активной конформации активного центра. Насыщенные ионами меди мутанты TcDH F436L и TcDH F436Q также не обладали ферментативной активностью. Для установления структурных особенностей, определяющих отсутствие активности у TcDH F436L и TcDH F436Q, поставлен скрининг условий кристаллизации этих мутантных препаратов TcDH. 2. Продолжена работа по поиску и характеристике новых ингибиторов TcDH. Охарактеризованы потенциальные ингибиторы TcDH, содержащие атомы азота и серы и способные связываться одновременно с несколькими ионами меди активного центра. К таким потенциальным ингибиторам относится амитрол (3-амино-1,2,4-триазол), 2-аминопиримидин, 3-амино-5-метилтио-1H-1,2,4-триазол и тиомочевина. Наиболее перспективным из них оказался амитрол (IC50 = 0,029 мМ). Амитрол является конкурентным ингибитором TcDH в реакции окисления тиоцианата. Значение Ki для амитрола составляет 22±0,9 мкМ. Согласно предложенной модели, связывание амитрола сопровождается образованием координационных связей с Cu2 и Cu3 и дополнительных водородных связей с остатками активного центра Glu288, Asp314 и His528. Получены кристаллы комплекса TcDH с амитролом для проверки этой модели методом рентгеноструктурного анализа. Следующим по эффективности ингибитором оказалась тиомочевина (IC50 1 мМ), при том, что мочевина не обладала ингибирующим эффектом вплоть до концентрации 100 мМ. Ингибирование тиомочевиной соответствует смешанному кинетическому механизму. Тиомочевина предпочтительно связывается со свободной формой фермента (Ki 0.6 mM); Ki’ для связывания с фермент-субстратным комплексом составляет 2 mM. Построение и сравнительный анализ моделей связывания обоих соединений в активном центре фермента, выполненный с применением комбинированного метода квантовой и молекулярной динамики, позволили выявить молекулярные механизмы стабилизации комплекса TcDH с тиомочевиной, связанные с заменой O/S. 3. Выделен и охарактеризован одногемовый цитохром с С552 - потенциальный акцептор электронов для TcDH в реакции окисления тиоцианата в клетке. Определены кинетические параметры реакции окисления тиоцианата TcDH с C552 в качестве акцептора электронов в рН-оптимуме активности: константа Михаэлиса Км для C552 равна 72.8 ± 21.1 мкM и максимальная активность Аmax 0.17 ± 0.02 мкмоль мин(-1) мг(-1). Для получения структуры С552 методом ЯМР получен изотопно-меченный препарат Cyt552, пригодный для проведения ЯМР экспериментов, качество которого (размер и свёрнутость белка, а также гомогенность и чистота) было подтверждено обзорными двумерными гетероядерными ЯМР спектрами 1H/15N-HSQC и 1H/13С-HSQC-CT. Пространственная структура Cyt552, полученная путём комбинации данных ЯМР спектроскопии и молекулярно-динамического моделирования содержит 7 альфа-спиралей, имеющих различную длину, которые соединены протяжёнными неструктурированными петлями. Fe-координиррующими остатками являются His59 и Met103, находящиеся на петлях между двумя альфа-спиралями. Cтруктура C552 топологически похожа на известные структуры нестандартных бактериальных цитохромов: цитохрома c551i из Paracoccus denitrificans (PDB ID 2gc7) и цитохрома cL из Methylobacterium extorquens (PDB ID 2c8s), который также является компонентом периплазматической электрон-транспортной цепи и служит акцептором электронов для метиламиндегидрогеназы. Для изучения механизма передачи электронов из активного центра восстановленной TcDH на физиологический акцептор электронов была построена модель комплекса TcDH и C552. Согласно построенной модели, гем-содержащий карман цитохрома примыкает к центральной полости (каналу) TcDH, так что расстояние между ионами Fe и ближайшего к нему иона Cu не превышает 20 А, что обеспечивает возможность прямого переноса электронов. Дополнительные эксперименты, в частности картирование остатков С552, участвующих во взаимодействии с TcDH, с помощью ЯМР спектроскопии необходимы для уточнения данных моделирования.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Фундаментальной задачей, на решение которой направлено настоящее исследование, является изучение механизмов функционирования медь-содержащих оксидоредуктаз, а также механизмов направленного транспорта и регулирования уровня ионов меди, обеспечивающих устойчивость живых организмов к изменениям концентрации меди в окружающей среде. В рамках настоящего проекта решение этой задачи проводится на примере медь-содержащего фермента – тиоцианатдегидрогеназы (TcDH), которая катализирует реакцию окислительного разложения тиоцианата с образованием цианата, серы и переносом двух электронов на акцептор. Анализ полученных нами ранее пространственных структур TcDH из бактерии Thioalkalivibrio paradoxus (TpTcDH) показал, что активный центр фермента содержит три иона меди (Cu1, Cu2 и Cu3) и набор из 10 необходимых для катализа аминокислотных остатков, участвующих в координации ионов меди и активации молекулы воды, осуществляющей нуклеофильную атаку на молекулу субстрата. Точечные мутации любого их этих остатков приводили к получению каталитически неактивной формы TcDH. Нами было сделано предположение, что наличие этого характерного набора из 10 аминокислот определяет принадлежность белка к тиоцианатдегидрогеназам. Для проверки этого предположения были проанализированы аминокислотные последовательности гомологов TpTcDH, обнаруженных в геномах более чем 50 бактерий. Для некоторых из них, в том числе для галофильных бактерий Thiohalobacter thiocyanaticus HRh1 и Guyparkeria sp. SCN-R1, показана способность расти на тиоцианате в качестве источника энергии и/или азота с образованием цианата в процессе роста. Несмотря на то, что идентичность аминокислотных последовательностей потенциальных TcDH из T. thiocyanaticus и Guyparkeria sp. с TpTcDH не превышала 30 % , они содержали характерный мотив из 10 аминокислот. После оптимизации условий культивирования бактерии T. thiocyanaticus на тиоцианате как основном источнике энергии, потенциальная TcDH из T. thiocyanaticus (TtTcDH) была выделена и охарактеризована. Показано, что TtTcDH обладает каталитической активностью в реакции окисления тиоцианата с образованием цианата и двух электронов, которые переносятся на акцептор. Таким образом, наличие консервативного мотива из 10 аминокислотных остатков у одного из наиболее удаленных гомологов TpTcDH действительно является признаком тиоцианатдегидрогеназ. Следует отметить, что TpTcDH и TtTcDH имеют существенные отличия. Одним из них является образование TtTcDH прочного комплекса с тиоредоксин-подобным белком, ген которого расположен непосредственно перед геном TcDH в геноме T. thiocyanaticus. Роль тиоредоксин-подобного белка в обеспечении каталитической активности и стабильности TtTcDH пока не установлена. Помимо 10 необходимых для катализа аминокислотных остатков в активном центре TpTcDH были локализованы полуконсервативные остатки, участвующие в формировании полости активного центра TpTcDH. Одним из таких остатков является Phe436. Предполагается, что у TpTcDH Phe436 участвует в формировании гидрофобной стенки активного центра и может влиять на свойства соседнего с ним остатка His437 – лиганда иона Cu3. В последовательностях TcDH из Guyparkeria sp. и T. thiocyanaticus, для которой подтверждена тиоцианатдегидрогеназная активность, этот остаток замещен на Leu. На первом этапе выполнения проекта для проверки роли Phe436 в катализе были получены, выделены и охарактеризованы точечные мутанты TpTcDH с заменой F436L и F436Q. Насыщенные ионами меди мутанты TcDH F436L и F436Q не обладали ферментативной активностью. Для установления структурных особенностей, определяющих отсутствие активности у TcDH F436L и F436Q, получены структуры мутантных белков методом рентгеноструктурного анализа. Анализ полученных структур показал, что: - в обеих структурах TcDH F436Q и F436L в активном центре отсутствует необходимый для катализа ион Cu3. Возможно, мутации F436 могли повлиять на свойства соседнего остатка Н437 и его способность связывать ион Cu3. Однако утверждать это только на основании структурных данных нельзя, поскольку ион Cu3 часто отсутствует и в структурах нативного фермента. - F436 может играть существенную роль в конформационных изменениях фермента при переходе от открытой формы активного центра к закрытой, образующейся при связывании субстрата. Вероятно, меньший размер боковой группы Q436 нарушает координированные конформационные переходы, ведущие к образованию закрытой конформации активного центра и он остается в открытой форме, что приводит к потере ферментативной активности. Таким образом, можно предположить, что остаток F436 выполняет роль триггера при закрытии активного центра TcDH от растворителя при связывании субстрата. Для исследования механизма транспорта и встраивания ионов меди в активный центр TcDH для формирования трехядерного медного каталитического кластера был получен и охарактеризован медь-связывающий белок CopC, ген которого расположен рядом с опероном TcDH в геноме бактерии Tv. paradoxus и в геномах других бактерий рода Thioalkalivibrio, содержащих ген TcDH. Методами тушения триптофановой флуоресценции и изотермической титрационной калориметрии охарактеризовано взаимодействие CopC с ионами меди и с TcDH. Показано, что CopC образует с ионами двухвалентной меди Cu(II) комплекс, содержащий 1 ион меди на одну молекулу (мономер) СорС, что совпадает с данными рентгеноструктурного анализа, согласно которому CopC представляет собой димер, каждая субъединица которого содержит один ион меди. Константы диссоциации комплекса, определенные двумя методами, совпадают и составляют (1.7+-0.5) мкМ. В присутствии восстановителей наблюдается диссоциация ионов меди из молекулы CopC. Таким образом, ионы одновалентной меди Cu(I) не связываются c CopC. CopC образует комплекс с неактивной формой TcDH, содержащей 1 ион меди Cu1, стехиометрия комплекса 1 : 1. Константа диссоциации комплекса, определенная двумя разными методами, равна 1 мкМ. Образование комплекса сопровождается переносом ионов меди в активный центр и активацией TcDH. Конечный препарат TcDH имеет активность 10.5 мкмоль/мин на мг фермента и содержит (2.8 +- 0.2) ионов меди на 1 субъединицу фермента. Аналогичный результат был получен при активации TcDH ионами Cu(II). Таким образом, мы имеем полностью активированный препарат TcDH, а CopC может выполнять роль медь-переносящего белка-шаперона для TcDH, способствуя его активации.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Фундаментальной задачей, на решение которой направлено настоящее исследование, является изучение механизмов функционирования медь-содержащих оксидоредуктаз, а также механизмов направленного транспорта и регулирования уровня ионов меди, обеспечивающих устойчивость живых организмов к изменениям концентрации меди в окружающей среде. В рамках настоящего проекта решение этой задачи проводится на примере медь-содержащего фермента – тиоцианатдегидрогеназы (TcDH), который катализирует реакцию окислительного разложения тиоцианата с образованием цианата, серы и переносом двух электронов на акцептор. Ранее на основании анализа данных о структуре и функции TcDH из бактерии Thioalkalivibrio paradoxus было показано, что TcDH содержит в активном центре уникальный каталитический кластер, сформированный 3 ионами меди; с привлечением методов молекулярной и квантовой механики был сформулирован предполагаемый механизм каталитической стадии реакции. Однако, несмотря на высокое разрешение (1.45 А), высокая анизотропия и двойникование кристаллов не позволили установить точную координацию и степень окисления ионов меди в активном центре, а следовательно их роль в катализе. Не удавалось также экспериментально подтвердить предложенный с помощью моделирования способ связывания субстрата в активном центре фермента, поскольку диссоциация ионов меди из активного центра при кристаллизации не позволяла получить комплексы фермента с ингибиторами и субстратом. Для проверки предложенного механизма катализа была поставлена задача улучшения качества кристаллов. На первых этапах выполнения проекта для устранения двойникования был использован метод точечного мутагенеза аминокислотных остатков на поверхности белковой глобулы для изменения упаковки молекул в кристалле. Однако, точечный мутагенез аминокислотных остатков на поверхности молекулы TcDH из Tv. paradoxus (tpTcDH) не привел к устранению двойникования и улучшению качества кристаллов. Второй подход, использованный нами для получения кристаллов TcDH более высокого качества - поиск и кристаллизация гомологичного белка из другого организма. На данном этапе выполнения проекта был выбран гомолог TcDH из термофильной бактерии Hydrogenophilia bacterium - hbTcDH. Степень гомологии аминокислотных последовательностей hbTcDH и tpTcDH составляет 60%. Аминокислотные остатки, отвечающие за связывание ионов меди, катализ и формирование стенок активного центра и субстратного канала, у hbTcDH и tpTcDH консервативны. Получена рекомбинантная форма hbTcDH, которая как и tpTcDH, представляла собой димер. Охарактеризованы процесс активации hbTcDH ионами меди и каталитические свойства активированного препарата. Показано, что hbTcDH является умеренно термостабильным белком, сохраняя каталитическую активность в течение 24 часов при 50 оС, что соотносится с оптимальной температурой роста H. bacterium. Получены кристаллы свободной формы hbTcDH и комплекса c конкурентным ингибитором – тиомочевиной. В отличие от ранее полученных кристаллов tpTcDH, кристаллы hbTcDH представляли собой монокристаллы. Структуры свободной формы hbTcDH и комплекса с тиомочевиной были решены с атомным разрешением (1.1 и 1.05 А). Атомное разрешение позволило точно установить координацию ионов меди уникального трехъядерного медного центра hbTcDH. Опираясь на теоретические положения и полученные структурные данные, удалось соотнести каждому иону меди его заряд, что позволило выделить ряд редокс состояний медного кластера фермента. На основе этих состояний были предложены основные этапы каталитического процесса hbTcDH. В кристалле димер фермента состоял из субъединиц в “закрытой” и “открытой” конформациях, отличающихся доступностью активного центра для растворителя. Структура комплекса фермента с тиомочевиной может служить моделью переходного состояния, возникающего при атаке нуклеофилом атома углерода тиоцианата. На основании структуры комплекса фермента с тиомочевиной был предложен способ связывания субстрата - иона тиоцианата в активном центре hbTcDH, который соответствует способу, ранее предложенному на основании молекулярного докинга. Продолжена работа по характеристике удаленных гомологов tpTcDH (идентичность аминокислотной последовательности около 30 %). Особенностью этих гомологов является присутствие в геномах соответствующих бактерий рядом с геном TcDH гена тиоредоксин-подобного белка Tlp, роль которого неустановлена. В качестве основных объектов исследования были выбраны TcDH и Tlp из бактерии Thiohalobacter thiocyanaticus HRh1. На данном этапе выполнения проекта разработаны методы получения рекомбинантных форм обоих белков в растворимой форме. Получение растворимой формы ttTcDH потребовало использования экспрессионной системы, содержащей последовательность гена белка SUMO в качестве белка-носителя, а также дополнительной плазмиды pGro7 (Takara), содержащей гены молекулярных шаперонов. Для структурной и функциональной характеристики наработан гомогенный препарат рекомбинантного Tlp. Получены кристаллы Tlp. Роль Tlp в реакции окисления тиоцианата, катализируемой ttTcDH, неизвестна. Особенностью Tlp из T. thiocyanaticus является отсутствие характерного для тиоредоксинов мотива CXXC. Однако ранее для тиоредоксин-подобных белков была показана способность образовывать комплексы с глутатионом, которые могут участвовать в переносе молекулярной серы или встраивании ионов меди в активный центр медь-содержащих белков. Методами тушения триптофановой флуоресценции и изотермической титрационной калориметрии охарактеризовано взаимодействие Tlp из бактерии T. thiocyanaticus с окисленной (GSSG) и восстановленной (GSH) формами глутатиона. В обоих случаях комплекс имеет стехиометрию 1 : 1. Константы диссоциации комплексов Tlp с глутатионом, определенные двумя разными методами, близки и составляют для комплекса Tlp-GSH 1.5 – 0.6 мкM и 0.8 - 0.3 мкМ для комплекса Tlp-GSSG. Микромолярный уровень констант диссоциации позволяет предположить, что взаимодействие глутатиона и Tlp может быть физиологически значимым для бактерии T. thiocyanaticus.