КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-14-01089

НазваниеРазнообразие морфогенезов и типов клеточного поведения в эмбриональном и постэмбриональном развитии животных

РуководительЕресковский Александр Вадимович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет", г Санкт-Петербург

Года выполнения при поддержке РНФ 2020 - 2021 

КонкурсКонкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (18)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-106 - Биология развития

Ключевые словаморфогенез, эмбриональное развитие, регенерация, аннелиды, губки, эволюция

Код ГРНТИ34.21.00, 34.21.17, 34.15.49


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В ходе выполнения предыдущего гранта РНФ нами были получены принципиально новые приоритетные результаты, которые раскрывают механизмы морфогенезов у беспозвоночных, занимающих базальные ветви филогенетического древа, на примере губок и аннелид. Эти данные открывают новые перспективы для более глубокого понимания происхождения и путей эволюции основополагающих клеточных и молекулярно-генетических процессовы, регулирующих развитие животных при половом, бесполом размножении, а также при регенерации. Благодаря Проекту 2017 нами получены разнообразные транскриптомы губок Halisarca dujardini (Demospongiae) и Leucosolenia variabilis (Calсarea), а также аннелиды Enchytraeus coronatus. Это открывает возможности впервые в мире применить транскриптомику к изучению, в первую очередь, морфогенезов при регенерации и бесполом размножении губок и аннелид в сочетании с детальными описаниями клеточного поведения. В настоящем проекте мы планируем углубить представления об изучаемых процессах, и подготовить информационные – геномные и транскриптомные – ресурсы для перехода на качественно новый уровень исследования в последующем и создать основу для анализа функций генов с применением генетических технологий. Проблема реализации программ эмбриональных и восстановительных морфогенезов, регуляции этих процессов, крайне актуальна и важна для понимания эволюции многоклеточных животных и многих фундаментальных дисциплин, таких как стремительно развивающаяся эволюционная биология развития. Глубокое теоретическое осмысление сложнейших процессов, приводящих к формированию или восстановлению тела животного, возможно только при реализации комплексного подхода к исследованиям. Комплексность подхода должна включать не только разнообразные методики, позволяющие изучать процессы на разных уровнях (от морфологического до молекулярного), но и разнообразные модельные объекты для выявления вариативности и пластичности исследуемых процессов, а также оценки их возможных эволюционных преобразований. Работа по данному Проекту будет проводиться в нескольких направлениях. Одними из них будет исследование морфологических особенностей морфогенезов: общее описание морфогенеза, клеточные механизмы, оценка пролиферативной активности и апоптоза, установление клеточных источников формирования новых тканей. Другим направлением будет изучение молекулярных механизмов морфогенеза. Будут аннотированы и проанализированы ранее секвенированные нами транскриптомы губок и аннелид, что позволит выявить дифференциально экспрессирующиеся гены и сравнить их наборы и активность у разных видов при разных морфогенезах. Кроме того, будет установлена локализация экспрессии ряда генов в зачатках, прежде всего генов транскрипционных факторов и компонентов сигнальных путей. В рамках проекта также планируется впервые в мире провести сравнительно-транскриптомное исследование регенерации у губок. Также принципиально новым будет идентификация и анализ мультипотентного статуса клеток на разных стадиях жизненного цикла аннелид и при регенерации аннелид и губок путем идентификации генов-маркеров, специфичных для популяций мультипотентных (стволовых) клеток. Научная новизна предложенного исследования состоит в том, что по своей комплексности и подбору модельных объектов данный Проект не имеет аналогов, и для его выполнения существуют все необходимые предпосылки: (а) высококвалифицированные специалисты – эмбриологи, морфологи и молекулярные биологи, работающие в этой области многие годы и имеющие публикации в высокорейтинговых журналах, (б) взятые нами на вооружение и адаптированные для выполнения проекта экспериментальные подходы, а также методы световой, электронной, микроскопии, иммуноцитохимии в сочетании с конфокальной микроскопией, молекулярно-биологические методы, биоинформатический анализ, цитологические методы, (в) другие необходимые материально-технические средства – приборы и расходные материалы, (г) современные ресурсные центры. Успешное выполнение проекта позволит получить фундаментальные знания о механизмах морфогенезов, их регуляции и эволюции у Метазоа.

Ожидаемые результаты
Реализация проекта будет способствовать накоплению новых фундаментальных данных о морфогенезах и их клеточных источниках, особенностях клеточного поведения и межклеточного взаимодействия при различных формах развития животных - эмбриогенезе, бесполом размножении и при регенерации - обладающих разной тканевой организацией и занимающих разное филогенетическое положение среди Metazoa. Мы планируем углубить представления об изучаемых процессах у губок и аннелид, и подготовить информационные – геномные и транскриптомные – ресурсы для перехода на качественно новый уровень анализа в последующем. Проблема реализации программ эмбриональных и восстановительных морфогенезов, регуляции этих процессов, важна для понимания эволюции многоклеточных животных и их онтогенеза, а также многих фундаментальных биологических дисциплин, таких как биологии развития и эволюционная биология. Глубокое теоретическое осмысление сложнейших процессов, приводящих к формированию или восстановлению тела животного, возможно только при реализации комплексного сравнительного подхода к исследованиям. Комплексность нашего подхода будет включать не только разнообразные методики, позволяющие изучать процессы на разных уровнях (от морфологического до молекулярного), но и разнообразные модельные объекты для выявления вариативности и пластичности исследуемых процессов, а также оценки их возможных эволюционных преобразований. Помимо фундаментальной ценности, понимание механизмов построения тела животного, базирующихся на активности клеток, таких как дифференцировка, апоптоз, миграция, пролиферация, построение и разборка межклеточных контактов, имеет в перспективе и прикладное значение - все это создает основу для управления морфогенетическим процессами в интересах биомедицины и биотехнологии. По степени разработанности методов и подходов на моделях аннелид и губок, наша группа в настоящее время занимает одно из лидирующих положений в мировой науке. Мы имеем многолетний опыт содержания и лабораторных культур различных размножающихся видов аннелид, а также многолетний опыт лова этих животных в полевых условиях, искусственного осеменения и получения синхронных культур развития. Отработаны и адаптированы для объектов данного проекта методы электронной микроскопии, гистологической техники, иммуноцитохимии, ингибиторного анализа. Члены коллектива обладает навыками молекулярного клонирования, выявления экспрессии генов, трансгенеза и мутагенеза на уровне мировых стандартов. Полученные нами данные о клеточных и молекулярных механизмах, лежащих в основе морфогенезов в процессе формирования плана строения тела и при его восстановлении, являются приоритетными для Российской науки. Квалификационный уровень участников проекта, использование современных методов и подходов, наличие оснащенных ресурсных центров и биологических станций обеспечат проведение данного проекта на высоком уровне, не уступающем мировому. Полученные результаты будут обобщены в ряде публикаций в высокорейтинговых международных журналах, представлены на международных конференциях, станут основой для двух магистерских диссертаций, а также войдут в программы университетских курсов по биологии развития и клеточной биологии.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Показано, что в ходе постэмбриональных морфогенезов при бесполом размножении и регенерации у N. communis и E. coronatus, соответственно, клетки покровного или раневого эпителия приобретают вид малодифференцированных; мышечные слои демонстрируют признаки ослабления и появления брешей. Клетки бластемных масс имеют большое сходство с клетками модифицированного покровного эпителия. Ультраструктура этих клеток говорит об их недифференцированном состоянии. Процессы формирования бластемы и реорганизации покровов, за исключением наиболее ранних событий образования раневого эпителия, сопровождаются активной клеточной пролиферацией. Описанные события постэмбрионального развития происходят по типу эпиморфоза и вставочного роста, демонстрируя ограниченные морфаллактические процессы. В ходе реализации проекта в 2020 г были идентифицированы и клонированы гомологи ряда консервативных элементов Wnt сигналинга, прежде всего неканонического по типу Planar Cell Polarity (Wnt/PCP), а также некоторых генов-спецификаторов нейроэктодермы для изучаемых олигохет. Показано, что все белки, кодируемые идентифицированными генами, имеют типичные для соответствующих генов консервативные домены. Получены дополнительные данные по экспрессии Нох-генов у зародышей E. coronatus. Было подтверждено, что экспрессия Нох-генов происходит, в целом с соблюдением принципа колинеарности и сопровождает процессы массового перемещения клеток в ходе гаструляции и органогенеза. Полученные данные позволяют предположить диверсификацию функций паралогичных генов. У личинок Alitta virens была проанализирована динамика экспрессии генов-маркеров стволового и мультипотентного статуса, а также генов рецепторов FGF. Результаты гибридизации in situ показали, что эти маркеры имеют множественные и динамично меняющиеся домены экспрессии почти во всех тканях и органах. Наибольшего внимания в период развития метатрохофоры заслуживает домен сильной экспрессии генов vasa, piwi и fgfr2 в покровных клетках, расположенных непосредственно перед телотрохом, окружающим презумптивную область пигидия. Этот домен маркирует зачаток зоны роста, продуцирующий материал всех постларвальных сегментов. Тем самым мы подтвердили, что выбранные гены маркируют зоны локализации малодифференцированных активно делящихся клеток у A. virens. Примечательно, что эти клетки компетентны к восприятию стимулов FGF, что требует дальнейшей проработки с функциональной точки зрения. На A. virens проводили эксперименты по модуляции Wnt и FGF/RTK по новому дизайну. При ингибировании транскрипционного медиатора Wnt у регенератов A. virens был достигнут эффект полного подавления пролиферации и закладки бластемы. В дополнение к запланированным результатам мы выявили паттерны экспрессии регуляторных генов у личинок A. virens в условиях гиперактивации и ингибирования Wnt. Выявленные нарушения транскрипционного профиля показывают роль этого сигналинга в паттернировании ранних зародышей, что обеспечивает процессы формирования дефинитивных осей тела, вентральной нейроэктодермы, стомодеума и средней кишки. Полученные результаты свидетельствуют о принципиальной важности опосредованного каноническим Wnt взаимодействия между клетками на ранних этапах развития, что подтверждает выдвинутую нами ранее гипотезу. В результате регулярных сборов образцов удалось определить, что размножение и эмбриональное развитие L. variabilis происходит в осенне-зимний период. В тканях губок, собранных в середине октября, удалось обнаружить ооциты. Ооциты были обнаружены у ~30% исследованных особей. В конце февраля – начале марта в тканях нескольких особей были обнаружены зрелые личинки, готовые к вымету. У большей части губок, исследованных в этот период, ткани были свободны от репродуктивных элементов, что указывает, что основной вымет личинок произошел раньше. Ранее нами исследованы механизмы регенерации губок из разных классов на морфологическом уровне, с помощью электронной и конфокальной микроскопии, описаны изменения в активности деления клеток и апоптоза. Нами было показано, что восстановительные морфогенезы у губок из класса Demospongiae (Halisarca dujardini и Aplysina cavernicola) разительно отличаются от таковых из класса Calcarea (Leucosolenia variabilis): у обыкновенных губок процесс идет по типу эпителио-мезенхимного перехода, а у известковых – путем перестройки эпителиальных структур вокруг раны. На данном этапе мы начали работу по выяснению молекулярных механизмов, обеспечивающих эти отличия у эволюционно отдаленных видов губок. Так, была выделена РНК из регенератов разных стадий. Секвенирование РНК и оценка изменения уровней экспрессии генов (т.е. количества каждого транскрипта) позволит выявить гены, работающие на разных стадиях регенерации. Сравнение наборов таких генов у двух эволюционно отдаленных видов позволит нам предположить, какие молекулярные механизмы их регулируют, и чем эти отличия на морфологическом уровне обусловлены. Кроме того, у многоклеточных животных очень часто в восстановлении утраченной ткани принимают участие недифференцированные, мультипотентные клетки (т.е. способные к дифференцировке в разные типы клеток). Нами были клонированы гены, описанные как маркеры таких мультипотентных клеток у других беспозвоночных - piwi, vasa, nanos, boule, pumilio, tudor, pl10. С помощью гибридизации in situ мы планируем идентифицировать клетки, обладающие такими маркерами у интактной губки и проследить их вклад в регенерацию. Несмотря на то, что современные методы полногеномного секвенирования широко вошли в практику, эволюционная геномика до сих пор преподносит нам сюрпризы с каждым новым проанализированным геномом беспозвоночных. Так, опубликованный в 2020 г. геном губки Ephydatia muelleri оказался втрое больше ожидаемого размера, а синтения (сходство положения генов на хромосомах у разных видов) поддерживается лишь на уровне небольших групп генов, от трихоплекса до ланцетника. Основной проблемой в секвенировнии геномной ДНК являются повторы – длинные участки повторяющихся последовательностей, не позволяющие собрать несколько прочтений в один контиг. Мы использовали технологию Oxford Nanopore для получения прочтений длиной 20-30 тыс пар нуклеотидов, с последующей коррекцией короткими прочтениями, полученными по технологии Illumina. Из тканей губок Halisarca dujardini и Leucosolenia variabilis, аннелид A. virens и E. coronatus была выделена высокомолекулярная ДНК (длиной свыше 60 тыс пар оснований), и секвенирована по обеим методикам. Будет проведена гибридная сборка и аннотация геномов, что позволит получить платформу для дальнейших работ по изучению молекулярных механизмов морфогенезов такими методами, как ChIP-Seq и single cell RNAseq.

 

Публикации

1. Борисенко И., Подгорная О.И., Ересковский А. Novel protein from larval sponge cells is related to energy turnover enzyme conserved among invertebrates Society for Developmental Biology 79th Annual Meeting ONLINE. 2020, с.291 (год публикации - 2020).

2. Борисенко И., Предеус А., Лавров А., Ересковский А. Nanopore-based long reads assembly of sponge Halisarca dujardini draft genome Biodiversity genomics 2020, - (год публикации - 2020).

3. Борисенко И.Е., М.А. Даугавет, О.И. Подгорная, А.В. Ересковский Новый мажорный белок жгутиковых клеток личинки губки оказался консервативным: структура, эволюция, экспрессия и предполагае мые функции Гены и клетки, Т. XV. № 3, Приложение. С. 43-44 (год публикации - 2020).

4. Екимова И.А., Ересковский А.В., Шепетов Д., Токина Д.Б., Койнова А.С., Лавров А.И. Perceived complexity and distinct boundaries: a revision of calcareous sponge Leucosolenia complicata in the White Sea EVOLMAR2020. Book of Abstracts – Stazione Zoologica Anton Dohrn, с. 38 (год публикации - 2020).

5. Ересковский А.В. Alexander Onufrievich Kowalevsky (1840–1901). Evolutionary Developmental Biology – A Reference Guide., P. 1-17 (год публикации - 2020).

6. Ересковский А.В., Токина Д.Б., Саидов Д.М., Багдиджан С., Ле Гофф Э., Лавров А.И. Transdifferentiation and mesenchymal‐to‐epithelial transition during regeneration in Demospongiae (Porifera) Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution, Т. 334, с. 37-58 (год публикации - 2020).

7. Козин В.В., Гонобоблева Е.Л., Костюченко Р.П. Morphogenesis of the mesodermal layer in Alitta virens (Annelida: Nereididae) Society for Developmental Biology 79th Annual Meeting ONLINE. 2020., P. 297. (год публикации - 2020).

8. Козин В.В., Шалаева А.Ю., Кайров А.И., Борисенко И.Е., Халтурин К.В., Костюченко Р.П. Геномный, транскриптомный и функциональный анализ канонического Wnt-сигналинга у нереидных полихет Гены и клетки, Т. XV. № 3, Приложение. С. 137-138 (год публикации - 2020).

9. Койнова А.С., Лавров А.И., Ересковский А.В. The development of the whole sponge Leucosolenia cf. variabilis from the body wall piece Беломорская студенческая научная сессия СПбГУ – 2020. Тезисы докладов. – Свое издательство, Санкт-Петербург, 2020., с.64 (год публикации - 2020).

10. Костюченко Р.П., Никанорова Д.Д., Мелентий А.Г., Амосов А.В. Molecular patterning during the development of Enchytraeus coronatus: insights into the evolution of direct development in clitellate annelids Society for Developmental Biology 79th Annual Meeting ONLINE, July 9-15, 2020. Abstract book, Р. 292 (год публикации - 2020).

11. Лавров А.И., Саидов Д.М., Большаков Ф.В., Косевич И.А. Intraspecific variability of cell reaggregation during reproduction cycle in sponge Zoology, V. 140. 125795 (год публикации - 2020).

12. Подлевских А., Ересковский А., Борисенко И. TGF-beta expression during embryo development of sponge Halisarca dujardini Society for Developmental Biology 79th Annual Meeting ONLINE. 2020., С. 295 (год публикации - 2020).

13. Скоренцева К. В., Лавров А. И., Саидова А. А. Особенности поведения клеток в процессе формирования регенеративной мембраны у известковой губки Leucosolenia cf. variabilis Беломорская студенческая научная сессия СПбГУ – 2020. Тезисы докладов. – Свое издательство, Санкт-Петербург, 2020, с. 63 (год публикации - 2020).

14. Скоренцева К.В., Лавров А.И., Саидова А.А. Клеточные характеристики формирования регенеративной мембраны у известковой губки Leucosolenia cf. variabilis Студенческий Биохимический Форум – 2020: II межвузовская студенческая конференция: 09-10 февраля 2020 г., Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет: Материалы конференции, с. 46-47 (год публикации - 2020).

15. Фролова В.С., Лавров А.И., Ересковский А.В. Особенности прогрессивного развития примморфов известковых губок Белого моря (Calcarea, Porifera) Беломорская студенческая научная сессия СПбГУ – 2020. Тезисы докладов. – Свое издательство, Санкт-Петербург, 2020, с. 62 (год публикации - 2020).

16. Шалаева А.Ю., Козин В.В. Участие факторов роста фибробластов и МАР-киназного пути в контроле над пролиферацией у аннелиды Alitta virens Гены и клетки, Т. XV. № 3, Приложение. С. 38. (год публикации - 2020).

17. Шалаева А.Ю., Козин В.В. Активность FGF-сигналинга при регенерации Alitta virens Беломорская студенческая научная сесия СПбГУ – 2020. Тезисы докладов. Санкт-Петербург, 2020, с. 24 (год публикации - 2020).

18. Шалаева А.Ю., Костюченко Р.П., Козин В.В. The first report on structural and functional conservation of FGF signaling in regenerating annelid as exemplified by the polychaete worm Alitta virens Society for Developmental Biology 79th Annual Meeting ONLINE. 2020., P. 297 (год публикации - 2020).