КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 17-14-01189

НазваниеИзучение роли длинных некодирующих РНК в формировании протеома растительной клетки

РуководительФесенко Игорь Александрович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2020 г. - 2021 г. 

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (18).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-207 - Системная биология; биоинформатика

Ключевые словадлиные некодирующие РНК, протеом, пептиды, тандемные повторы, масс спектрометрия, мох Physcomitrella patens

Код ГРНТИ34.15.00

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Кодирующий потенциал геномов прокариот и эукариот до сих остается недооцененным. Связано это в том числе и с тем, что рамки считывания меньше 100 кодонов отбрасываются при биоинформатической аннотации, чтобы исключить большое количество ложных предсказаний. Однако с развитием новых чувствительных методов детекции белков и пептидов в клетке, микробелки, кодируемые такими рамками, стали все чаще идентифицировать у разных живых организмов. В связи с большим количеством коротких рамок в эукариотических геномах, изучение возможных функций микробелков, кодируемых такими рамками, представляет важную задачу современной биологии растений. Несмотря на то, что сотни потенциально транслирующихся коротких рамок считывания были обнаружены в разных организмах (Martinez et al., 2019; Fesenko et al., 2019), на сегодняшний момент охарактеризованы функции только небольшого количества микробелков, аннотированных в геномах млекопитающих. Например, анализ транскрипции длинных некодирующих РНК (RNA-seq), совмещенные с предсказанием эволюционно консервативных коротких открытых рамок считывания, позволил идентифицировать два микробелка – dwarf open reading frame (DWORF) и myoregulin (MLN), участвующих в регуляции сокращения сердечной мышцы (Anderson et al, 2015; Nelson et al, 2016). Микробелок HOXB-AS3, супресиррующий рост опухоли рака прямой кишки, был обнаружен при анализе экспрессии антисенс-некодирующих РНК в различных тканях. Микробелок SPAR участвует в регуляции работы комплекcа mTORC1 и влияет на регенерацию мышц (Matsumoto et al, 2017). Микробелки играют важную роль и при ответе на стрессовые воздействия. Например, 54-аа микробелок PEGASUS, регулирует стрессовый ответ, связанный с unfolded protein response (UPR) в клетках млекопитающих (Chu et.al., 2019). Приведенные примеры подчеркивают важность изучения функций микробелков, кодируемых короткими открытыми рамками считывания. Однако количество системных работ по аннотации коротких рамок у растений, а также изучению функций кодируемых ими микробелков исчезающе мало. Более того, на растениях не проведено ни одного исследования, направленного на изучение функций микробелков, кодируемых транскриптами, классифицированными как длинные некодирующие РНК. Механизмы регуляции трансляции длнкРНК остаются за рамками большинства исследований. В рамках проекта будет изучена функция консервативных микробелков растений, выявленных нами ранее при выполнении Проекта 2017 при изучении протеома/пептидома модельного растения – мох Physcomitrella patens. Кроме того, мы изучим возможные механизмы регуляции трансляции коротких рамок, расположенных на длинных некодирующих РНК и мРНК. Известно, что на регуляцию трансляции может влиять метилирование мРНК. Однако связь между регуляцией трансляции коротких рамок считывания и модификацией длнкРНК ранее не изучали. Данная задача может быть решена в рамках проекта с использованием данных нативного секвенирования полиаденилированной РНК, выполненного нами ранее на нанопоровом секвенаторе MinIon. Кроме того, регуляция трансляции коротких рамок может быть связана с регуляцией деградации РНК. Так, на арабидопсисе показана нонсенс-опосредованная деградация длинных некодирующих РНК и антисенс транскриптов (Drechsel et al., 2013; Kurihara et al., 2009). В рамках проекта с использованием полученных ранее мутантов по этой системе будет изучено влияние деградации РНК на регуляцию представленности микробелков в клетке.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения работ по проекту будут получены уникальные данные о функциях обнаруженных нами ранее регуляторных микробелков у растений. Будет выявлена локализация этих микробелков, их влияние на внутриклеточные процессы, а также обнаружены возможные белковые партнёры. Также в ходе проекта будет установлена роль метилирования РНК и нонсенс-опосредованной деградации РНК в контроле трансляции кОРС (коротких Открытых Рамок Считывания), находящихся на длнкРНК. В связи с большим интересом к функциям микробелков, кодируемых короткими рамками считывания, наше исследование будет соответствовать самым высоким международным стандартам. Первый год выполнения проекта будет направлен на изучение функций идентифицированных микробелков на клеточном уровне. Для этого с помощью конструкций для транзиентной и конститутивной сверхэкспрессии будет установлена их локализация, выявлены потенциальные белковые партнеры, изучены последствия их нокаута и сверхэкпрессии на клеточном уровне. Учитывая уже полученные при выполнении Проекта 2017 данные фенотипического, протеомного и транскриптомного анализов, это позволит впервые описать функции микробелков у растений на таком высоком уровне. Кроме того, в первый год выполнения проекта будут проведены исследования по изучению эпитранскриптома, выявлены метилированные мРНК и длнкРНК, а также новые изоформ-специфичные транскрипты. Это данные послужат основой для изучения механизмов, регулирующих трансляцию микробелков у растений. Необходимо отметить, что в Проекте 2017 мы выполнили секвенирование нативных РНК на нанопоровом секвенаторе и отработали алгоритм анализа данных. На второй год выполнения проекта планируется получить и провести фенотипический анализ мутантов по коротким рамкам, расположенным на транскриптах, дифференциально регулируемых системой нонсенс-опосредованной деградации мРНК. Показано, что данный механизм может контролировать представленность длнкРНК, а значит опосредованно влиять на представленность в клетке микробелков от коротких рамок. Учитывая тот факт, что данный механизм ответственен за регуляцию в клетках транскриптов стрессового ответа, полученные данные позволят выявить новые пептидные регуляторы стрессового ответа. Мутанты по этим микробелкам будут подробно исследованы на клеточном уровне. Следует отметить, что данный вопрос будет впервые изучен на модельном объекте в рамках выполнения проекта. Кроме того, мы оценим взаимосвязи модификаций длинных некодирующих РНК и трансляции соответствующих коротких открытых рамок считывания. Будут получены данные по количественным изменениям в протеомах мутантных линий. Учитывая новизну и актуальность этих данных, статьи по результатам заявленных исследований могут быть опубликованы в высокорейтинговых журналах. Несмотря на то, что планируемое исследование имеет в первую очередь фундаментальный характер, его результаты и выявленные в итоге закономерности могут быть использованы в сельском хозяйстве для получения новых высокопродуктивных и устойчивых к стрессам культур. Вместе с тем, полученные в работе результаты могут быть использованы при дальнейшем исследовании фундаментальных проблем физиологии и молекулярной биологии растений в научно-исследовательских учреждениях. Также результаты могут использоваться в учебном процессе в университетах и других ВУЗах, ведущих подготовку биологов широкого профиля.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Функциональная роль микробелков, кодируемых короткими открытыми рамками считывания, привлекает всё большее внимание исследователей в последние годы. Ранее в ходе выполнения проекта РНФ, мы изучили возможность трансляции коротких открытых рамок считывания у растений используя объект системной биологии - мох Physcomitrella patens. Функции четырех из этих микробелков (PSEP1, PSEP3, PSEP18 и PSEP25) были изучены с использованием мутантных растений со сверхэкспрессией/нокаутом по соответствующим генам. Были проанализированы протеомы и ростовые характеристики этих мутантов. Одной из основных задач на 2020 год было дополнить полученные данные по физиологической роли исследуемых микробелков цитологической характеристикой и анализом интерактома. Более выраженный физиологический эффект проявляли микробелки PSEP1 и PSEP3. Оба микробелка локализованы в цитозоли и ядре. Согласно полученным нами ранее данным, микробелок PSEP3 регулирует фотосинтетические процессы, причём как его недостаток, так и избыток негативно сказываются на росте растений. Мы обнаружили, что индукция сверхэкспрессии этого микробелка приводит к увеличении продукции активных форм кислорода и гибели клеток. В отличие от PSEP3, микробелок PSEP1 стимулирует рост протонемы. Этот процесс сопряжен с увеличением интенсивности везикулярного транспорта в апексах полярно растущих клеток. Кроме того, мы обнаружили, что в отсутствии микробелка PSEP1 происходит более интенсивная регенерация клеточной стенки, разрушенной в результате выделения протопластов. Таким образом, микробелок PSEP1 модулирует процессы полярного роста и везикулярного транспорта. Регуляция трансляции микробелков с длинных некодирующих РНК может находится под строгим посттранскрипционным контролем. Для изучения механизмов такого контроля, мы проанализировали транскриптом мутантной линии мха P.patens с нарушенной системой нонсенс-опосредованной (NMD) деградации мРНК. Был использован метод нанопорового прямого секвенирования полиаденилированной фракции РНК, что на таких мутантах у растений было сделано впервые. Благодаря этому методу нам удалось показать большое количество локусов и изоформ, транскрипция которых находится под контролем NMD. Среди представленных транскриптов нами выявлены и длинные некодирующие РНК, экспрессия которых была характерна только в мутантных линиях. Выполненное прямое секвенирование РНК и эпитранскриптомный анализ позволил нам выявить наличие модификаций РНК, характерных для растений с дефектной NMD системой. Такие модификации могут определять судьбу транскрипта, его время жизни и активность трансляции открытых рамок считывания. Нам удалось установить достоверное присутствие метилированных оснований на нескольких длнкРНК у мутантов, что по всей видимости свидетельствует о механизмах их регуляции, связанных с модификацией оснований.

 

Публикации

1. Андрей Князев, Анна Глушкевич, Игорь Фесенко Direct RNA sequencing dataset of SMG1 KO mutant Physcomitrella (Physcomitrium patens) Data in Brief, Volume 33, 2020, 106602 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1016/j.dib.2020.106602

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Система нонсенс-опосредованной деградации РНК является одним из ключевых звеньев в контроле качества транскриптов. В ходе работ по проекту за 2021 год мы показали, что такой важный и малоизученный пласт транскриптов, как длинные некодирующие РНК, в том числе, кодирующие функциональные пептиды, также регулируются NMD-системой. Мы подтвердили этот факт при помощи ряда методов - нанопоровое секвенирование РНК, ПЦР в реальном времени после обратной транскрипции и протеомный анализ. Поскольку NMD-система регулирует транскрипцию в том числе в стрессовых условиях, при помощи ПЦР в реальном времени мы исследовали экспрессию ряда NMD-зависимых генов при стрессе и показали, что часть из них также регулируется стрессом. Наиболее выраженная зависимость экспрессии от функционирования NMD-системы была выявлена для пептида PSEP3. Этот пептид содержит участки низкой комплексности, имеет паралога в геноме P.patens и отличается высокой консервативностью. Мы выявили экспрессию пептида PSEP3 в протонеме, а также отдельные локусы экспрессии в апикальной и базальной частях гаметофоров. Растения, нокаутные по генам SMG1 и PSEP3 оказались более уязвимы к стрессовым воздействиям, а именно их жизнеспособность сильнее снижается в условиях солевого и осмотического стрессов. При этом одновременное нокаутирование этих генов проявлялось более быстрым ростом протонемы. Посттранскрипционные модификации - ещё один из возможных пунктов регуляции экспрессии генов. Наиболее изученными из них являются полиаденилирование РНК и метилирование азотистых оснований. Мы проанализировали не только роль этих модификаций в регуляции синтеза белков, но и в контроле экспрессии продуктов, кодируемых длинными некодирующими РНК, а также косвенное участие системы NMD в этом процессе. Мы выявили, что трансляция длнкРНК более интенсивно идет с транскриптов с более короткими поли(А)-хвостами. Еще одним важным аспектом изучения функционирования длнкРНК является понимание закономерностей их эволюции. Мы проанализировали эволюционные траектории обнаруженных нами у P.patens длнкРНК в наборе транскриптомных данных разных видов растений. Наши результаты свидетельствуют о существовании группы коротких открытых рамок считывания, которые действительно могут кодировать высококонсервативные пептиды, на которые действует стабилизирующий отбор, и группы кОРС, которые поддерживаются отбором в группах сравнительно близкородственных организмов (специфичных для вида и линии), как это было показано на животных. Таким образом, у животных и растений действуют общие закономерности эволюции длнкРНК, позволяющие рассматривать их как “сырой материал” эволюции белков, а также как самостоятельные функционально значимые единицы. Работы по проекту завершены, все запланированные эксперименты выполнены полностью.

 

Публикации

1. Ляпина И.С., Филиппова А., Ковальчук С., Зиганшин Р., Мамаева А.С., Лазарев В.Н., Лацис И., Михальчук Е., Панасенко О., Иванов О., Иванов В.Т., Фесенко И.А. Possible role of small secreted peptides (SSPs) in immune signaling in bryophytes Plant Molecular Biology, 106, 123-143 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1007/s11103-021-01133-z

2. Мамаева А.С., Глушкевич А.И., Фесенко И.А. Quantitative proteomic dataset of the moss Physcomitrium patens SMG1 KO mutant line Data in Brief, 40 (2022), 107706 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1016/j.dib.2021.107706

3. Фесенко И.А., Шабалина С.А., Мамаева А.С., Князев А.Н., Глушкевич А.И., Ляпина И.С., Зиганшин Р., Ковальчук С., Харлампиева Д., Лазарев В.Н., Тальянский М.Э., Кунин Е.В. A vast pool of lineage-specific microproteins encoded by long non-coding RNAs in plants Nucleic Acids Research, 49, 18, 10328-10346 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1093/nar/gkab816

4. Ляпина И.С., Иванов В.Т., Фесенко И.А. Peptidome: Chaos or Inevitability International Journal of Molecular Sciences, 22(23), 13128 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/ijms222313128

Возможность практического использования результатов
Микробелки, кодируемые длинными некодирующими РНК у растений являются малоизученными регуляторными молекулами. Такие микробелки могут быть задействованы в регуляции целого спектра различных физиологических процессов, включая рост, определение полярности, морфогенез, фотосинтез и адаптацию к стрессам. Таким образом, полученные в воде проекта новые сведения в перспективе могут быть применены в сельском хозяйстве при создании новых сортов растений и агротехнологических подходов. Понимание закономерностей функционирования, экспрессии и эволюции таких молекул обеспечат подобное практически-ориентированное исследование необходимой фундаментальной базой.