Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На сегодняшний день известны только две биолюминесцентные системы, для которых были описаны пути биосинтеза основных компонентов — люциферазы и люциферина. Одна из них представлена биолюминесцентной системой бактерий, а другая — грибов. Биолюминесцентная система грибов была расшифрована и успешно реконструирована в модельном организме нашей группой в рамках выполнения проекта, поддержанного РНФ в 2017-2019 годах. По сравнению с автономной биолюминесцентной системой, основанной на бактериальной люциферазе, биолюминесцентная система грибов имеет ряд преимуществ, в частности, по спектральным характеристикам (максимум испускания бактериальной системы — 490 нм (синий свет), а биолюминесцентной системы грибов — 525 нм (жёлтый свет)) и нетоксичностью субстратов системы для клеток. Однако в настоящее время система биолюминесценции грибов однозначно уступает бактериальной системе по яркости: например, с помощью бактериальной системы уже возможно регистрировать свечение единичных клеток, тогда как подобная яркость для системы биолюминесценции грибов пока недоступна. Поэтому улучшение разработанной нами автономной биолюминесцентной системы, основанной на люциферазе и генах биосинтеза люциферина грибов, является актуальной научной задачей, имеющей существенный потенциал для практического применения. В течение первого года выполнения проекта с помощью гетерологичной экспрессии 3 основных генов ферментов цикла кофейной кислоты и гена вспомогательного фермента фосфопантетеинилтрансферазы в дрожжах Pichia pastoris мы определили, что обе стадии биосинтеза гиспидина из кофейной кислоты могут иметь лимитирующий эффект. Каждая из рассмотренных стадий обладает потенциальным запасом возможностей для увеличения общей эффективности системы. Полученные в ходе работы данные демонстрируют актуальность проведения мутагенеза гиспидин-3-гидроксилазы (H3H) и гиспидинсинтазы (HispS) с целью оптимизации биосинтеза люциферина грибов. В связи с чем было принято решение провести мутагенез (H3H) — фермента, катализирующего реакцию образования люциферина — с целью оптимизации активности этого фермента и, соответственно, биосинтеза люциферина грибов. В результате нами получена библиотека случайных мутаций гена h3h для экспрессии в Pichia pastoris. Полученные мутантные формы H3H были протестированы в гетерологичной системе Pichia pastoris, экспрессировавших ген люциферазы грибов. Нами была обнаружена мутация, которая приводила к более эффективной конверсии гиспидина в люциферин по сравнению с диким типом. Остальные варианты демонстрировали меньшую эффективность, чем дикий тип H3H. Кроме того, нами были проанализированы мутантные клоны, несущие h3h с потерянной гидроксилазной активностью. Секвенирование последовательностей h3h этих клонов позволило определить участки группирования мутаций в последовательности фермента, которые, по-видимому, напрямую связаны с его активностью. Мы изучили способность церуленина — противогрибкового антибиотика, ингибирующего биосинтез жирных кислот — опосредовано увеличивать синтез гиспидина при увеличении внутриклеточной концентрации малонил-КоА. При использовании drop-тестов нами было показано, что концентрации церуленина 1-10 мкМ способны ингибировать рост клеток Pichia pastoris, а низкие концентрации (0,5 мкМ) приводили к увеличению люминесцентного сигнала примерно в 2 раза в дрожжах, экспрессирующих гены цикла кофейной кислоты и вспомогательный ген фосфопантетеинилтрансферазы, в ответ на добавление кофейной кислоты. Предположительно данный эффект связан с большей доступностью малонил-КоА, необходимого для биосинтеза гиспидина из кофейной кислоты. Таким образом, добавление церуленина можно рассматривать как один из способов модуляции биолюминесцентного сигнала для системы цикла кофейной кислоты в Pichia pastoris. В этом году нами была создана тест-система на базе Pichia pastoris для количественного сравнения яркости люцифераз из различных светящихся базидиомицетов, а также их искусственно модифицированных форм. Она является результатом двух последовательных трансформаций и содержит независимо встроенные в геном гены люциферазы N. nambi и люциферазы светляка. Были подобраны условия для измерения биолюминесценции люциферазы светляка и рабочая концентрация D-люциферина. Было показано линейное соответствие количества клеток дрожжей при последовательном разведении и уровня биолюминесцентного сигнала при измерении и для люциферазы светляка, и для люциферазы грибов в этой тест-системе. Также нами был создан вариант тест-системы для количественной оценки яркости люцифераз грибов для линий клеток млекопитающих. Проверка осуществлялась на клетках линии НЕК293Т. Были проверены моноцистронные варианты векторов, где гены люцифераз (грибов и светляка) были разделены тремя типами линкеров. Мы создали 6 вариантов векторов, в которых предусмотрели различное положение люцифераз (как на С-конце, так и на N-конце белка) для каждого из отобранных линкеров. Было показано, что биолюминесцентный сигнал люциферазы зависел от положения ее гена в конструкции. Мы предполагаем, что это связано с невысокой эффективностью разрезания линкеров и присутствием ферментов в составе гибридного белка. Нам удалось получить работающую тест-систему, при которой гены люцифераз экспрессировались отдельно. Мы сделали выбор в пользу тест-системы на основе бицистронной матрицы, в случае которой экспрессия генов люцифераз осуществлялась под разными промоторами и не зависела от эффективности разрезания линкеров.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Значительное внимание во всем мире уделяется поиску новых и совершенствованию уже существующих биолюминесцентных систем, которые позволят визуализировать внутриклеточные процессы in vivo. Несколько лет назад описанная биолюминесцентная система грибов на примере N. nambi — первая эукариотическая система с расшифрованным механизмом биосинтеза люциферина, показала возможность ее применения для работы с различными модельными организмами, такими как дрожжи, растения и клетки млекопитающих (Mitiouchkina et al. 2020). Несмотря на это, данная система требует оптимизации, увеличения яркости и дальнейшего изучения для расширения ее функционала. Большая часть исследований в текущем отчетном году была посвящена изучению стадии биосинтеза предшественника люциферина грибов — гиспидина. Биосинтез данного поликетида осуществляют крупные многодоменные ферменты, представителем которых является nnHispS N. nambi. Этот фермент относится, предположительно, к семейству гибридных ферментов, состоящих частично из доменов поликетидсинтаз I типа, объединенным с доменами нерибосомных пептидилсинтаз (Hai, Huang, and Tang 2020). В связи с тем, что nnHispS описана недавно и имеет сложную доменную организацию, затрудняющую ее изучение, на сегодняшний день существует мало информации о данном белке. В ходе нашей работы в этом году удалось с помощью биоинформатических методов предсказать наиболее вероятное доменную архитектуру nnHispS, а также границы кетосинтазного домена. Кроме того, выравнивание аминокислотных последовательностей nnHispS и ее гомологов из родственных биолюминесцентных грибов позволило предсказать положения аминокислотных замен для проведения консенсусного мутагенеза. Данные мутации nnHispS анализировали как по отдельности, так и в различных сочетаниях. Гетерологической системой для проведения такой работы была выбрана линия дрожжей Pichia pastoris. Анализ проводили опираясь на уровень биолюминесцентного сигнала при добавлении кофейной кислоты. Стоит отметить, что все мутанты nnHispS были функциональны, хотя некоторые сочетания мутаций и приводили к снижению уровня биолюминесцентного сигнала. В результате работы ни один из мутантов не приводил к увеличению яркости свечения дрожжей при добавлении субстрата. Таким образом, оптимизацию биосинтеза гиспидина проводили с помощью другого подхода, а именно бикодоновой оптимизации гена nnHispS. Анализ последовательности кодонов и оптимизация их сочетаний позволила получить новый вариант гена nnHispS, который в клетках дрожжей показал прирост биолюминесценции по сравнению с исходной формой гена nnHispS на порядок. Полученный результат, вероятно, отражает важность этапа фолдинга и формирования пространственной структуры доменов для такого крупного фермента как nnHispS, которое выражается в увеличении эффективности биосинтеза гиспидина в гетерологической системе клеток дрожжей. Биосинтез гиспидина, предположительно, может определяться уровнем малонил-КоА — дополнительного субстрата nnHispS. Поэтому увеличение уровня малонил-КоА является еще одним направлением, над которым была проведена работа в рамках оптимизации биосинтеза гиспидина. В ходе работы над данным проектом было проверено два подхода: добавление антибиотика церуленина, блокирующего биосинтез жирных кислот посредством ингибирования синтазы жирных кислот (Leonard et al. 2008), а также введение в систему дополнительного гена ацетил-КоА-карбоксилазы (Tong 2005), синтезирующего малонил-КоА. К сожалению, оба эти подхода не приводили увеличению яркости биолюминесцентного сигнала, что может иметь несколько объяснений. Во-первых, доступность малонил-Коа может не являться ограничивающим фактором для биосинтеза гиспидина. Во-вторых, малонил-КоА может являться аллостерическим регулятором nnHispS или другого фермента биолюминесцентной системы грибов, который при увеличении концентрации оказывает подавляющее действие на систему. В этом году мы количественно оценили свечение люцифераз из разных грибов (Armillaria fuscipes, Armillaria gallica, Armillaria mellea, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos, Neonothopanus gardneri, Omphalotus olearius, Panellus stipticus), а также мутантной формы люциферазы N. nambi, используя для этого гетерологическую систему на основе культуры клеток дрожжей P. pastoris и уже подобранные ранее нами условия для тест-системы для оценки яркости люцифераз. Сравнение проводили путем нормирования сигнала от исследуемой люциферазы на сигнал от референсной люциферазы светляка FFLuc. По полученным данным люцифераза гриба N. nambi обладала наибольшим биолюминесцентным сигналом, превышающим сигнал от остальных люцифераз — в 5-10 раз, а мутантный вариант этой люциферазы — в 3 раза. Мы подтвердили функциональность данной тест-системы и возможность ее использования для количественной оценки свечения разных люцифераз и их мутантных форм для поиска более ярких кандидатов.