КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 17-14-01353

НазваниеМоноаминилирование как консервативный адаптационный механизм в развитии и физиологии животных: от пост-трансляционной модификации белков к генетике развития, физиологии и экологии

РуководительВоронежская Елена Евгеньевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2020 г. - 2021 г. 

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (18).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-106 - Биология развития

Ключевые словаэмбриональное развитие, моноаминилирование, трансглутаминазы, посттрансляционная модификация белков, формирование поведенческих программ, иммунный статус

Код ГРНТИ34.21.17, 34.15.49

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Во время выполнения проекта РНФ нами были раскрыты основные клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе долговременных адаптивных изменений, происходящих в организме, в ответ на изменение уровня серотонина в клетках зародыша в раннем эмбриогенезе (на стадиях дробления и в предимплантационный период). Использование широкого ряда модельных объектов, включая моллюсков, морских ежей, рыбы данио и модельных грызунов, позволило нам проследить путь передачи эпигенетического серотонин-опосредованного сигнала от матери потомкам. Так, мы выявили локальные нервные сети в материнском организме и места нестандартной экспрессии фермента синтеза серотонина – триптофангидроксилазы в ткани эмбрионов, обеспечивающие модуляцию уровня серотонина в клетках раннего зародыша. Проследили изменения в поведении ювенильных особей, происходящие в ответ на такие модуляции. Выявили изменения в экспрессии генов, в том числе вовлеченных в репрограммирование родительского генома, в ответ на повышение серотонина на предимплантационных стадиях развития. Наиболее значимым прорывом в наших исследованиях стало доказательство трансглутаминаз-зависимого серотонилирования ядерных белков в плюрипотентных клетках эмбриона, дающих начало множеству тканей и органов развивающегося организма (Ivashkin et al., ACS ChemNeurosci, 2019). Эти результаты появились одновременно с работой, подтверждающей способность серотонина через серотонилирование гистонов менять активность транскрипционных факторов в дифференцирующихся нервных клетках (Farrelly et al., Nature, 2019). Таким образом, реализация задач проекта привела к подтверждению нашего предположения о роли серотонина, как эпигенетического фактора, участвующего в долговременном изменении программ развития и поведения и открыла перед нами новые перспективы исследования роли серотонина как модулятора клеточной дифференцировки на ранних стадиях развития. Полученные результаты вывели нас на лидирующие позиции в изучении роли моноамин-зависимой посттрансляционной модификации белков в процессах раннего развития. Приоритет нашей группы в исследовании процессов серотонилирования в развитии подтверждается приглашением руководителя проекта, Е.Е. Воронежской, с пленарной лекцией на ведущей международной конференции по исследованию серотонина (ISSR 20), где также будут представлены две пленарные лекции: основателя данного направления Майкла Бадера и руководителя работы по серотонилированию гистонов Ина Мейза. Для закрепления полученного успеха мы планируем сосредоточить свои усилия на одной экспериментальной модели – лабораторных грызунах, наиболее приближенных по физиологическим параметрам развития к высшим млекопитающим и человеку. В предлагаемом проекте мы хотим сконцентрироваться на углубленном изучении двух, связанных между собой процессов: 1) эпигенетических механизмах реализации серотонин-опосредованных долговременных эффектов, 2) влиянии процесса серотонилирования внутриклеточных белков на клеточную дифференцировку. За время выполнения проекта нами были отработаны все классические методы воздействия на серотонинергическую систему, анализ последующих морфологических и физиологических изменений, а также поведения. Наша группа является первой в России, применяющей недавно разработанную методику in vivo маркирования модифицированных белков с помощью деривата серотонина – пропаргил-серотонина (5-РТ, Lin et al., J. Proteome Res., 2014). Этот метод открывает совершенно новые возможности визуализации серотонилированных элементов в разных тканях и внутриклеточных структурах, позволяет проводить биохимический анализ пулов серотонилированных белков, а также масс-спектрометрический анализ конкретных белков с данной посттрансляционной модификацией. Конкретными объектами исследования, на которых мы рассчитываем обнаружить значительные эффекты изменения уровня серотонилирования в раннем развитии, будут: 1) бластоцисты млекопитающих, для которых мы показали влияние серотонина на экспрессию ряда генов, задействованных в развитии и метилировании/деметилировании родительского генома; 2) формирующиеся тимоциты, для которых в пилотных экспериментах мы показали изменение концентрации серотонилированных белков в ядре на разных стадиях деления; 3) участки эмбрионального и ювенильного гиппокампа, для которых мы отметили увеличение делящихся нейробластов у экспериментальных животных; 4) формирующиеся сперматозоиды, так как мы подтвердили, что белок SPEC3, участвующий в цилиогенезе, подвергается моноаминилированию; 5) хромаффинные клетки мозгового вещества надпочечников, для которых совместно с коллегами из Каролинского Института мы выявили совершенно неожиданное значение серотонина в критические периоды дифференцировки надпочечников. Продолжение проекта в выбранном направлении позволит детализовать молекулярные механизмы эпигенетических эффектов серотонина в раннем развитии, выявить конкретные мишени трансглутаминаз-зависимого моноаминилирования в процессе развития и дифференцировки клеток. Эти результаты позволят сохранить приоритет Российской науки в данном направлении и в дальнейшем предложить новые стратегии для разработки фармакологических препаратов нового поколения, корректирующих состояния, вызванные дисбалансом моноаминов в организме.

Ожидаемые результаты
Все результаты продолжения проекта будут связаны с раскрытием механизмов, задействованных в реализации эпигенетической роли серотонина в раннем развитии позвоночных животных. Особое внимание в этих процессах будет уделено трансглутаминаз-опосредованной посттрансляционной модификации белков. Данное направление получило широкое представление в мировой науке за последние 10 лет. Со времени открытия в 2003 г появляется все больше работ, подтверждающих участия неканонического пути действия серотонина в долговременных изменениях самых разнообразных физиологических процессов, от сокращения сосудов до развития сепсиса, от ремоделирования дендритных шипиков до участия в формировании конгломератов белков при нейрогенеративных заболеваниях (обзоры Muma and Mi, 2015; Bader, 2019). Наша группа является на настоящий момент единственной в мире, продемонстрировавшей наличие механизма моноаминилирования у беспозвоночных животных (Ivashkin et al., 2015). Нам также удалось занять лидирующие позиции по исследованию роли серотонилирования именно в процессах развития (Ivashkin et al., 2019), в то время как большинство работ посвящено роли трансглутаминаз-модифицированных белков в функционировании взрослого организма. В случае поддержки продолжения проекта мы будем развивать направления исследований, связанные с эпигенетическими механизмами действия серотонина и с влиянием серотонилирования белков на процессы дифференцировки в раннем развитии позвоночных животных. Так, будет детализована роль серотонилирования белков (гистонов) для реализации эпигенетических эффектов серотонина в раннем развитии млекопитающих (бластоцисты). На бластоцистах предимплантационных стадий развития будет показано распределение участков, имеющих повышенный уровень серотонилированных белков, на разных стадиях дробления. Определено взаимное расположение этих участков и гистонов. Будет установлено влияние повышенного уровня серотонина внутри бластомеров на экспрессию белка TET3, ответственного за активное реметилирование родительского генома. С использованием метода in vivo маркирования модифицированных белков будет определена локализация серотонилированных белков в формирующихся тимоцитах, выявлено взаимное расположение участков конденсирующегося хроматина с местами активного серотонилирования белков, установлено взаимное расположение гистонов с серотонилированными участками. Определены последствия повышенного и пониженного уровня серотонина внутри клетки на пролиферативную активность тимоцитов. Будут детализованы механизмы, вовлеченные в серотонин-зависимую дифференцировку клеток гиппокампа, формирование мужских половых клеток и хромаффинных клеток надпочечников. Определено значение серотонилирования белка SPEC3 для процесса цилиогенеза. Показан вклад активации рецепторов серотонина 5-НТ3, экспрессирующихся в клетках-предшественниках хромаффинных клеток, для формирования надпочечников. В совокупности, наши результаты внесут решающий вклад в понимание фундаментальных механизмов трансгрутаминаз-опосредованной посттрансляционной модификации белков в процессы дифференцировки, происходящие в течение всего развития организма. Будет подтвержден вклад серотонина, как эпигенетического фактора, участвующего в репрограммировании родительского генома и таким образом оказывающего отдаленные долговременные последствия на организм потомков. Глубокое понимание таких механизмов позволит предложить новые стратегии в методах коррекции социально-значимых серотонин-зависимых патологических состояний, начиная с самых ранних стадий развития.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Для раскрытия клеточных и молекулярных звеньев, лежащих в основе серотонин-опосредованных адаптивных изменений, происходящих в организме эмбриона (плода), а затем и ювенильного организма, в ответ на сигнал из материнского организма, мы использовали модель развития лабораторных грызунов: мышей и крыс. По отработанной нами ранее методике уровень серотонина повышали в организме матери на предимплантационных стадиях развития эмбриона и в критический период дифференцировки хромаффинных клеток надпочечников у плода (согласно Furlan et al., 2017). Для визуализации серотонилированных белков в тканях использовали модифицированную нами методику in vivo связывания белков с аналогом серотонина – пропаргил-серотонином (5-РТ) – с последующим выявлением с помощью клик-реакции. Серотонилированные белки обнаружены в клетках бластоцисты, паттерн распределения, выявленный с помощью клик-реакции сходен с паттерном иммуногистохимического маркирования антителами к серотонину. Промаркированные белки локализуются преимущественно в ядрах клеток, в делящихся клетках серотонилированные белки концентрируются вокруг сконденсированных хромосом. На модели органотипической культуры эмбрионального тимуса показано, что блокада рецептора серотонина первого типа ускоряет дифференцировку Т-лимфоцитов на самых ранних стадиях их развития и слабо влияет на образование зрелых форм Т-клеток помощников и цитотоксических Т-лимфоцитов. Присутствие в развивающемся тимусе рецепторов Htr1a лежит в основе прямого влияния серотонина на формирование этого органа. Эти данные подтверждают связующую роль серотонина между сигналами, поступающими из внешней среды, и формирующейся иммунной системой плода. Разобран клеточный механизм, через который серотонин влияет на скорость дифференцировки клеток-предшественников в хромаффинные клетки в мозговом веществе надпочечников во время критических периодов развития. Предложена гипотеза, согласно которой серотонин, выделяемый ранними хромаффинными клетками плода или поступающий из организма матери, активирует рецепторы серотонина на “bridge”-клетках, предшественниках хромаффинных клеток. Повышенный экспериментальным путем уровень серотонина приводит к уменьшению числа ТН-позитивных клеток, составляющих основную часть мозгового вещества надпочечников. В результате снижается уровень вырабатываемых в мозговом веществе гормонов ( норадреналина и адреналина), и меняется поведение потомков. Аналогичные изменения в структуре надпочечников выявлены в дикой популяции рыжей полевки. В естественных условиях, при повышении численности и недостатке кормовой базы с определенной периодичностью наблюдается миграция части популяции полевок из привычного ареала на новые территории. Проведенные нами исследования показали, что относительный размер медуллы надпочечников в группе полевок-мигрантов достоверно ниже, чем в группе резидентов. Результаты, полученные в дикой популяции, позволяют проложить связующий мостик между экспериментальными данными, полученными в лабораторных условиях, по влиянию стресса у беременных самок на уровень серотонина в плаценте и тканях плодов в критические периоды развития, наблюдаемыми изменениями в структуре надпочечников плодов, и поведением потомков, которое помогает им лучше адаптироваться в неблагоприятных условиях окружающей среды.

 

Публикации

1. Каменева П., Кастрити М.Е., Мельникова В.И., Куртова А.И., Калинина Т.С., Кудряшов Н.В.,.....Воронежская Е.Е., Адамейко И.И. Serotonin limits generation of chromaffin cells during adrenal organ development Nature Communications, - (год публикации - 2021)

2. Н. В. Лифанцева, Ц. О. Конеева, С. Н. Воронова, Г. В. Луценко, Л. А. Захарова, В. И. Мельникова ЭКСПРЕССИЯ И РОЛЬ СЕРОТОНИНОВОГО РЕЦЕПТОРА 1а ТИПА В ЭМБРИОНАЛЬНОМ ТИМУСЕ КРЫС Онтогенез, том 51, № 5, с. 338–350 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.31857/S0475145020050055

3. Воронежская Е. Е., Мельникова В. И., Ивашкин Е. Г. Моноамины как адаптивные регуляторы развития: феномен и механизмы действия Журнал высшей нервной деятельности им. И.П.Павлова, - (год публикации - 2021)

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На модели развития лабораторных грызунов – мышей и крыс – мы показали вовлеченность серотонина в клеточные и молекулярные механизмы, опосредующие адаптивные изменения, происходящие в эмбрионе (организме плода), и сохраняющиеся у ювенильных особей, при изменении функционального состояния матери в ранние периоды беременности. Мы подтвердили, что умеренный стресс приводит к повышению уровня серотонина в плаценте и в тканях плода. При этом повышение уровня серотонина сопоставимо с фармакологически индуцированным при введении физиологических доз биохимического предшественника серотонина – 5-НТР. Отработанная методика позволила проводить направленные изменения уровня серотонина в выбранные периоды развития: на предимплантационных стадиях развития эмбриона и в критический период дифференцировки хромаффинных клеток надпочечников у плода, а затем отслеживать долговременные последствия такого воздействия. Мы показали увеличение уровня мРНК ТЕТ3 в бластоцистах мышей при повышении уровня серотонина на предимплантационных стадиях развития, что указывает на возможность реализации эпигенетических эффектов серотонина в раннем развитии через процесс реметилирования родительского генома. Было зарегистрировано увеличение пролиферативной активности в клетках зубчатой фасции гиппокампа, которое сохранялось у мышей до зрелого возраста и сопровождалось снижением проявления депрессивно-подобного поведения. Серотонилированные белки в тканях визуализовались с использованием модифицированной нами методики in vivo связывания белков с аналогом серотонина – пропаргил-серотонином (5-РТ) и последующим выявлением с помощью клик-реакции. Этот метод позволил впервые идентифицировать один из вероятных таргетных белков для трансглутаминазы в мужской репродуктивной системе – белок-гомолог STUM (STUMh). Применение конфокальной микроскопии с cуперразрешением (Airyscan) выявило экспрессию белка STUMh в акросоме и проксимальной части жгутика зрелых сперматозоидов, показана зависимость экспрессии STUMh от стадии сперматогенеза в семенниках крыс. Полученные результаты показывают, что реализация эффектов серотонина в мужской репродуктивной системе может осуществляться не только через рецепторы, но и через неканонический механизм посттрансляционной модификации белков – серотонилирование. Были завершены эксперименты по выяснению механизмов серотонин-опосредованной регуляции числа ТН-позитивных клеток, составляющих основную часть мозгового вещества (медуллы) надпочечников. Подтверждена высказанная нами гипотеза, что ранние хромаффинные клетки плода способны выделять серотонин, который активирует рецепторы серотонина на “bridge"-клетках, предшественниках хромаффинных клеток, что по принципу обратной связи тормозит дифференцировку этих клеток и устанавливает количество хромаффинных клеток на оптимальном уровне. Активация рецепторов серотонина на “bridge-клетках приводит к удлинению клеточного цикла, суммарному снижению числа хромаффинных клеток и уменьшению относительного размера медуллы надпочечников. Такой эффект вызывается любым повышением серотонина в организме матери (стресс, воспаление, фармакологическая индукция) в критический период формирования надпочечников. Уменьшение числа хромаффинных клеток обуславливает снижение продукции вырабатываемых в мозговом веществе гормонов (норадреналина и адреналина) и сдвигу в поведении потомков в сторону реактивного типа реакции на стрессовые условия, который отличается низкой агрессивностью, большей гибкостью, способностью легче адаптироваться к меняющимся внешним условиям. Такие характеристики нашли свое отражение в строении надпочечников у грызунов в дикой популяции грызунов (красная полевка), в период миграционных волн. Полученные результаты позволяют считать серотонин значимым эпигенетическим фактором в процессе развития. При этом конкретный эффект его действия определяется стадией развития эмбриона, моментом дифференцировки определенных структур и экспрессией рецепторов и транспортеров моноаминов на специфических клетках.

 

Публикации

1. Богомолов А.И., Воронежская Е.Е. ПОВЫШЕНИЕ УРОВНЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО СЕРОТОНИНА В БЛАСТОМЕРАХ ПРИВОДИТ К НАРУШЕНИЯМ ПАТТЕРНА СПИРАЛЬНОГО ДРОБЛЕНИЯ У МОЛЛЮСКА LYMNAEA STAGNALIS Онтогенез, т. 53, №2, (год публикации - 2022)

2. Бондаренко Н. С., Воронова С. Н., Воронежская Е. Е., Мельникова В. И. ПРЕНАТАЛЬНЫЙ СТРЕСС И АДАПТИВНОЕ ПОВЕДЕНИЕ ПОТОМКОВ: РОЛЬ ПЛАЦЕНТАРНОГО СЕРОТОНИНА Доклады Академии наук (Биохимия, биофизика, молекулярная биология), - (год публикации - 2021)

3. Каменева П., Мельникова В.И., Кастрити М.Е., Куртова А.И., Крюков Е., Муртазина А., Форэ Л., Артемов А.В., Калинина Т.С., Кудряшов Н.В.,...... Воронежская Е.Е., Адамейко И.И. SEROTONIN LIMITS GENERATION OF CHROMAFFIN CELLS DURING ADRENAL ORGAN DEVELOPMENT Nature Communications, - (год публикации - 2021)

4. Н. В. Лифанцева, Ц. О. Конеева, С. Н. Воронова, Г. В. Луценко, Л. А. Захарова, В. И. Мельникова ЭКСПРЕССИЯ И РОЛЬ СЕРОТОНИНОВОГО РЕЦЕПТОРА 1а ТИПА В ЭМБРИОНАЛЬНОМ ТИМУСЕ КРЫС Онтогенез, том 51, № 5, с. 338–350 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.31857/S0475145020050055

5. Фофанова Е., Майорова Т.Д., Воронежская Е.Е. Dinophiliformia early neurogenesis suggests the evolution of conservative neural structures across the Annelida phylogenetic tree PeerJ, V.9:e12386 ; p. 1-33, (год публикации - 2021) https://doi.org/10.7717/peerj.12386

6. Воронежская Е. Е.,* Мельникова В. И., Ивашкин Е. Г. МОНОАМИНЫ КАК АДАПТИВНЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ РАЗВИТИЯ: ФЕНОМЕН И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ Журнал высшей нервной деятельности им. И.П.Павлова, т. 71, №3, с. 295-305 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.31857/S0044467721030126

7. Воронежская Е.Е. Maternal Serotonin: Shaping Developmental Patterns and Behavioral Strategy on Progeny in Molluscs Frontiers in Ecology and Evolution, Vol. 9, p. 1-8, (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3389/fevo.2021.739787

Возможность практического использования результатов
Выявленное участие серотонинового рецептора третьего типа (Htr3a) в регуляции клеточного цикла клеток-предшественников хромаффинных клеток и числа хромаффинных клеток медуллы надпочечников могут послужить теоретической основой для разработки препаратов коррекции при формировании опухолей, происходящих из симпатоадреналовых клеток-предшественников, таких как нейробластома, феохромоцитома и параганглиома. Параметр относительного размера медуллы надпочечников у грызунов может быть использован для характеристики потенциальной способности популяции к миграции, что важно для предсказания возникновения массовых волн переселений грызунов как в дикой популяции, так и в условиях городской среды.