Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В отчетном 2020 году выполнены следующие виды работ: - Отработана методика изготовления биодеградируемых сосудистых протезов малого диаметра с улучшенными физико-механическими характеристиками, что достигнуто посредством изменения соотношения полимеров в исходном растворе. - Определен оптимальный режим ионизирующего излучения, пригодный для одновременной полимеризации поливинилпирролидона с поверхностью биодеградируемых трубчатых каркасов и стерилизации карксов. - Изучен краевой угол смачивания полученных образцов, исследована структура поверхности и физико-механические характеристики. - Осуществлен синтез серии соединений с рибонуклеазной активностью, содержащих дополнительно функциональную карбоксильную или амино группу, необходимую для ковалентной привязки этих соединений к полимерной поверхности. Оценено количество групп. Для дальнейшей сшивки с полимерной поверхностью выбран амфифил с аминогруппами вследствие большего количества данных реакционных групп. - Проведена оценка гемосовместимости и антибактериальной активности полученных соединений в отношении ряда тест-штаммов грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов. Использование композиции полигидроксибутирата (PHBV) и поликапролактона (PCL) для изготовления трубчатого каркаса будущего сосудистого протеза повышает гемосовместимость и улучшает биосовместимость такого протеза после имплантации в сосудистое русло, но значимо ухудшает физико-механические свойства каркаса. Снижение концентрации раствора PHBV до 2% и увеличение концентрации раствора PCL до 12% позволило получить полимерную композицию PHBV/PCL в соотношении 1:2, на основе которой изготовлены трубчатые каркасы, приближенные по своим прочностным и эластическим характеристикам как к каркасам из PCL, так и к нативным сосудам. Удалось в 2 раза снизить жесткость конструкций PHBV/PCL и нивелировать разницу в данном показателе между каркасами PHBV/PCL и PCL. Режим изготовления методом электроспиннинга трубчатых полимерных каркасов был выбран с таким учетом, чтобы поры на внутренней поверхности не превышали 16 мкм. Такой размер пор достаточен для сиддинга эндотелиальных клеток, но не провоцирует массивного тромбообразования. В качестве дополнительной защиты, препятствующей тромбообразованию, был выбран метод, способный временно сгладить поры, повысить гидрофильность внутренней поверхности и быть способным к присоединению фармакологических веществ с атромбогенными и противомикробными свойствами. Было опробовано два метода усовершенствования характеристик и функциональных свойств поверхности матриксов: 1. Полимеризация поверхности трубчатых каркасов с поливинилпирролидоном (PVP) методом ионизирующего излучения и последующим присоединением илопроста и амфифила (амфифил - в трех терапевтических концентрациях: 0,25, 0,5 и 1 мг/мл) к свободным реакционным группам поливинилпирролидона. Для полимеризации PVP с поверхностью биодеградируемых трубчатых каркасов на основе композиции полигидроксибутирата/валерата и поликапролактона (PHBV/PCL) и только поликапролактона (PCL) использовали два режима ионизирующего излучения в дозе 10 и 15 кГр. 2. Ковалентная сшивка амфифила с полимерной поверхностью. В итоге получено 14 разновидностей биодеградируемых сосудистых протезов с различными вариантами поверхностного модифицирования. При комплексном исследовании in vitro было выявлено, что использованные приемы модифицирования не повысили достоверно гидрофильность поверхности протезов, однако придали ей антибактериальные свойства и улучшили гемосовместимость в случае использования илопроста. Однако высокие концентрации амфифила способствовали гемолизу эритроцитов, повышению адгезии и деформации тромбоцитов, что свидетельствует о способности провоцировать тромбообразование в случае имплантации в сосудистое русло протезов с высоким содержанием амфифилов. Таким образом, совокупность полученных данных позволила определиться с конечным вариантом биодеградируемых сосудистых протезов с атромбогенным и противомикробным покрытием, тестирование которых будет продолжено на модели крупных лабораторных животных – это биодеградируемые сосудистые протезы с присоединением лекарственных препаратов методом комплексообразования (использованное ионизирующее излучение для полимеризации с полимерным каркасом протеза и одновременной стерилизации протезов - 15 кГр): PHBV/PCL-PVP/Илопрост/Амфифил 0,25 мг/мл и PCL-PVP/Илопрост/Амфифил 0,25 мг/мл. Также будет проведено дополнительное модифицирование поверхности биодеградируемых сосудистых протезов PHBV/PCL/Амфифил (ковалентная сшивка) и PCL/Амфифил (ковалентная сшивка) методикой, включающей в себя полимеризацию с поливинилпирролидоном и последующее присоединение методом комплексообразования илопроста к свободным реакционным группам PVP. Такой подход позволит повысить гемосовместимость протезов с амфифилом, сшитым с полимерной поверхностью протезов ковалентно.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. Закончен полный цикл работ по улучшению подходов к модифицированию поверхности сосудистых протезов с ковалентно присоединенным амфифилом с целью повышения гемосовместимости данных протезов. Негативное влияние метода ковалентной сшивки подтвердил анализ цитотоксичности, проведенный на клеточном анализаторе с оценкой показателей в непрерывном режиме реального времени в течение 72 часов. При этом доказано, что используемые илопрост и катионный амфифил не обладают цитотоксичностью, а гибель клеточной культуры в присутствии матриксов с ковалентно присоединенным катионным амфифилом могла быть обусловлена присутствием остатков органических веществ, используемых при проведении модифицирования методом ковалентной сшивки. Данное обстоятельство требует более тщательной отмывки матриксов после проведенного модифицирования. 2. Проведена качественная и количественная оценка содержания илопроста и амфифила на поверхности протезов при разных подходах модифицирования. Выявлено, что количественное содержание катионного амфифила, присоединенного к полимерной поверхности методом ковалентной сшивки, значимо превышает количество амфифила, присоединяемого методом комплексообразования через свободные реакционные группы водорастворимого полимера поливинилпирролидона, предварительно полимеризованного с поверхностью биодеградируемого трубчатого каркаса посредством ионизирующего излучения. Однако большое количество амфифила на поверхности ухудшает гемосовместимость конструкций. Оптимальным оказалось присоединение амфифила методом комплексообразования в количестве 0,25 мг/мл. Также методом инфракрасной спектроскопии выявлено, что использование илопроста в терапевтической концентрации 0,2 мкг/мл для соединения с поверхностью биодеградируемого трубчатого каркаса оказалось недостаточно. Поэтому опытные образцы сосудистых протезов, предназначенные для последующего тестирования in vivo, модифицированы с использованием илопроста в концентрации 0,4 мкг/мл. Доказано, что происходит постепенное высвобождение илопроста с поверхности протезов в течение 20-30 суток, что обеспечит выход илопроста в концентрациях, не превышающих терапевтические. 3. Получены результаты контактного взаимодействия эндотелиальных клеток с поверхностью различных по модификации биодеградируемых сосудистых протезов. Выявлено, что присутствие илопроста в составе протезов значимо снижает адгезию эндотелиальных клеток к их поверхности в отличие от протезов, покрытых только поливинилпирролидогом. Однако илопрост и катионный амфифил в выбранных дозировках не оказывают пагубного влияния на клеточную жизнеспособность и пролиферацию. Таким образом, высвобождение из гидрогеля на основе поливинилпирролидона лекарственных препаратов с атромбогенными и противомикробными свойствами обеспечит тромборезистентность и противомикробную защиту протеза, что явится гарантией последующего формирования полноценной новообразованной сосудистой ткани. 4. Проведена комплексная оценка гемостазиологического профиля интактных, оперируемых и оперированных овец для определения рисков тромбообразования имплантируемых сосудистых протезов и выбора эффективного терапевтического пособия в раннем послеоперационном периоде с целью предупреждения тромбоза имплантированных конструкций. В гемостазиологическом профиле овец и пациентов с ИБС были выявлены существенные различия. Тромбоциты овец имели повышенный ответ на индукцию АДФ, но, практически не отвечали на индукцию адреналином, коллаген - индуцированная агрегация была сопоставимой в исследуемых группах. Коагуляционный гемостаз овец характеризовался повышенной активностью протромбинового комплекса и укорочением тромбинового времени при сопоставимых значениях АЧТВ и фибриногена. При этом у овец обнаружено выраженное снижение активности противосвертывающей и фибринолитической систем по сравнению с пациентами с ИБС. При оценке динамики образования сгустка у животных фаза инициации происходила быстрее, а плотность сгустка превышала таковую у пациентов с ИБС. Таким образом, гемостазиологический профиль овец характеризуется повышенной скоростью тромбообразования, большей прочностью образовавшегося сгустка и меньшей способностью к лизису по сравнению с пациентами с ИБС. 5. Выполнены пилотные исследования по имплантации сосудистых протезов с катионным амфифилом, ковалентно сшитым с поверхностью протезов, в сонную артерию 3 овец. Зафиксирован тромбоз протезов спустя 3 суток после имплантации, что косвенно доказало низкую гемосовместимость таких протезов, доказанную в экспериментах in vitro. Таким образом, дополнительная модификация данных протезов илопростом через комплексообразование с поливинилпирролидоном – весьма оправдана. 6. Начаты эксперименты по имплантации опытных образцов сосудистых протезов PHBV/PCL-PVP/Илопрост 0,4 мкг/мл/Амфифил 0,25 мг/мл, PCL-PVP/Илопрост 0,4 мкг/мл/Амфифил 0,25 мг/мл, PHBV/PCL/Амфифил (ковалентная сшивка)-PVP/Илопрост 0,4 мкг/мл, PCL/Амфифил (ковалентная сшивка)-PVP/Илопрост 0,4 мкг/мл в сонную артерию овец. В каждой группе прооперировано по 5 животных. Срок наблюдения составит 6 месяцев.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Было изготовлено 8 групп опытных образцов биодеградируемых сосудистых протезов, отличавшихся как по вариантам поверхностного модифицирования, так и по наличию антианевризматической внешней обмотки: PHBV/PCL-PVP/Илопрост 0,4 мкг/мл/Амфифил 0,25 мг/мл, PCL-PVP/Илопрост 0,4 мкг/мл/Амфифил 0,25 мг/мл, PHBV/PCL/Амфифил (ковалентная сшивка)-PVP/Илопрост 0,4 мкг/мл, PCL/Амфифил (ковалентная сшивка)-PVP/Илопрост 0,4 мкг/мл, PHBV/PCL-PVP/Илопрост 0,4 мкг/мл/Амфифил 0,25 мг/мл + обмотка (PHBV/PCL/PVP/Ilo/A), PCL-PVP/Илопрост 0,4 мкг/мл/Амфифил 0,25 мг/мл + обмотка (PCL/PVP/Ilo/A), PHBV/PCL/Амфифил (ковалентная сшивка)-PVP/Илопрост 0,4 мкг/мл + обмотка (PHBV/PCL/Аcov/PVP/Ilo), PCL/Амфифил (ковалентная сшивка)-PVP/Илопрост 0,4 мкг/мл + обмотка (PCL/Аcov/PVP/Ilo). Антианевризматический внешний спиралевидный каркас (обмотку) из поликапролактона (PCL) молекулярной массой (Mn) 90000 Да (Sigma Aldrich, США) изготавливали методом экструзии на оригинальной установке, состоящей из каретки с экструдером и вращающегося вала, в следующем режиме: скорость вращения вала - 1 об/сек, скорость движения каретки – 1 мм/сек, скорость подачи пластика – 0,5 мм/сек (сопло экструдера – 0,5 мм), температура подачи волокна - 160°С. Таким образом, основной биодеградируемый трубчатый каркас изготавливали методом электроспиннинга по технологии, представленной в пункте 1.3. Далее штифт с изготовленным трубчатым каркасом устанавливали в экструдер и выполняли намотку дополнительной перекрестной спирали из поликапролактоновой нити при ее подаче в условиях высоких температур таким образом, что сплавление намоточной нити с основным полимерным каркасом осуществлялось только под намоточной нитью с глубиной вплавления нити, не превышавшей 44 мкм. Далее протез снимали со штифта и выполняли поверхностное модифицирование лекарственными препаратами илопростом и катионным амфифилом. В часть протезов антиагрегант илопрост (Ilo) и противомикробное вещество 1,5-Бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромид, являющееся катионным амфифилом (А), были присоединены к поверхности трубчатых полимерных каркасов методом комплексообразования со свободными реакционными группами водорастворимого полимера поливинилпирролидона (PVP), сшитого с полимерной поверхностью посредством ионизирующего излучения. В другой части протезов катионный амфифил (А) был присоединен к трубчатому каркасу протеза посредством ковалентной сшивки (cov), а илопрост – методом комплексообразования с PVP. На модели овцы выполнены преклинические испытания опытных образцов биодеградируемых сосудистых протезов диаметром 4 мм (n=6 в каждой группе, всего n=48). Срок имплантации составил 6 месяцев. Выявлено, что скорость резорбции биодеградируемых сосудистых протезов как на основе PCL, так и на основе PHBV/PCL, имплантированных в сосудистое русло овцы, значимо превысила скорость деградации PCL и PHBV, указанную в научной литературе (3 – 4 года для PCL; не менее 5 месяцев – для PHBV), а также не соответствовала результатам, которые мы получили ранее на модели крысы (Антонова Л.В. и соавт., 2018). Все имплантированные сосудистые протезы, не имевшие внешней анитианевризматической обмотки, подверглись быстрому аневризмообразованию. Аневризмы протезов на основе PCL зафиксировано уже спустя 3 недели имплантации на фоне проходимости в раннем послеоперационном периоде в 83,3% случаев, 6-месячной проходимости – в 50% случаев. Аневризмы в стенке протезов на основе PHBV/PCL фиксировали уже через 1,5 месяца после имплантации на фоне проходимости в раннем послеоперационном периоде в 66,7% случаев, 6-месячной проходимости – в 0% случаев. Сосудистые протезы с антианевризматической обмоткой PCL/PVP/Ilo/A и PHBV/PCL/PVP/Ilo/А также имплантировали в сонную артерию овец на 6 месяцев. Все животные дожили до конца эксперимента. Ни в одном случае не выявлено аневризмообразования в стенках эксплантированных протезов. Через 1 месяц после имплантации первичная проходимость в группах PCL/PVP/Ilo/A и PHBV/PCL/PVP/Ilo/A составила 83,3% и 67,7%, соответственно. Через три месяца после имплантации мы наблюдали снижение проходимости протезов PCL/PVP/Ilo/A до 50,0%, а протезов PHBV/PCL/PVP/Ilo/A - до 33,3%. Проходимость протезов PCL/PVP/Ilo/A не изменилась через 6 мес эксперимента (50,0%), при этом все имплантаты PHBV/PCL/PVP/Ilo/A тромбировались. Трубчатый полимерный каркас также почти полностью заместился новообразованной тканью, однако обмоточные нити сохраняли свою целостность. Гистологический и иммунофлуоресцентный анализы эксплантатов PCL/PVP/Ilo/A подтвердили резорбцию полимера, а также показали формирование трехслойной структуры сосудистой стенки, схожей со строением интактной сонной артерией овцы. В просвете протезов PHBV/PCL/PVP/Ilo/А, PCL/Аcov/PVP/Ilo и PHBV/PCL/Аcov/PVP/Ilo визуализировался обтурирующий тромб, тем не менее основной каркас протезов был практически полностью резорбирован и замещен новообразованной тканью, состоящей из коллагеновых волокон и клеток моноцитарно-макрофагального и фибробластического ряда. Обнаружено много мелких сосудов в стенке протезов по типу vasa vasorum. Значимым результатом транскриптомного и протеомного анализов явилось доказательство того, что рассинхрон между биодеградацией полимерного трубчатого каркаса и регенерации сосудистой ткани de novo отсутствовал. Протезы очень активно метаболизировали, синтезируют и заполняют пустоты внеклеточным матриксом. Ремоделирование по макрофагальному типу ожидаемо, оно неоднократно описано в литературе и совпадало с данными гистологического и иммунофлуоресцентного исследований. Отрицательным моментом явилось отсутствие формирования гладкомышечной стенки (по данным протеомного исследования). Клетки, активно синтезирующие α-актин, по-видимому являлись миофибробластами. В сочетании с отсутствием формирования эластина это привело к тому, что по сути протез представлял собой трубку с внеклеточным матриксом по коллагеновому типу, которая, конечно, не способна обеспечить нужную адаптацию к условиям потока и, следовательно, адекватное изменение диаметра сосудистого просвета на физиологические циклические изменения артериального давления. Дифференцировка приходящих в протез клеток не шла по этому пути даже в позиции овечьей сонной артерии, где присутствует огромное циклическое растяжение за счет гемодинамического удара. Поэтому антианевризматическое усиление внешнего каркаса биодеградируемых сосудистых протезов представляется обязательным для предупреждения переизбыточного растягивания вновь образованной сосудистой ткани на месте протезов. Сосудистые протезы не показали каких-либо молекулярных признаков тромбоза, кальцификации, атеросклероза или инфекции. При этом наиболее эффективнымив плане долгосрочной проходимости оказались сосудистые протезы, основу трубчатого каркаса которых составил поликапролактон. Таким образом, по результатам комплексного тестирования для дальнейшей регистрации в качестве медицинского изделия можно порекомендовать биодеградируемый сосудистый протез PCL/PVP/Ilo/A, основа которого выполнена из 12% поликапролактона, антианевризматическое усиление внешнего каркаса также выполнено из поликапролактона молекулярной массой (Mn) 90000 Да, а поверхностное модифицирование проведено с использованием антиагреганта илопроста в концентрации 0,4 мкг/мл и катионного амфифила 1,5-Бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида в концентрации 0,25 мг/мл методом комплексообразования со свободными реакционными группами поливинилпирролидона, полимеризованного с полимерной поверхностью протеза посредством ионизирующего излучения с общей поглощенной дозой 15 кГр. Потенциальная область применения разработанного протеза - хирургическое лечение ишемической болезни сердца, заболеваний периферических кровеносных сосудов, врожденных пороков развития сосудистой системы, цереброваскулярных заболеваний.