Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Основной целью первого этапа проекта было создание конструкций на основе адено-ассоциированных вирусов для экспрессии последовательностей, кодирующих дрожжевую оксидазу D-аминокислот (DAAO) и бактериальную НАДФ+-зависимую дегидрогеназу D-аминокислот (DAAD) и их инактивированные мутанты DAAO(R285A) и DAAD(R36I, R37I), в астроцитах, тормозных и возбуждающих нейронах. Кроме того, чтобы проводить функциональное тестирование конструкций с DAAD и DAAO нам необходимо было собрать вирусные конструкции для экспрессии генетически кодируемых сенсоров HyPer3 для детекции пероксида водорода и iNap1 и его рН-контроль iNapC для детекции НАДФ-Н. Используя методы молекулярного клонирования, нами были собраны 12 конструкций на основе плазмидного вектора pAAV2 для экспрессии DAAD, DAAO и их инактивированных мутантов под контролем промоторов gfa2, CaMKIIa и fPV. Эти конструкции содержат следующие принципиальные элементы: (1) инвертированные терминальные повторы адено-ассоциированного вируса (AAV) серотипа 2 для упаковки фрагмента ДНК в вирусную частицу; (2) промоторную область gfa2, CaMKIIa или fPV (gfa2 – фрагмент промотора гена глиального фибриллярного кислого белка человека для экспрессии в астроцитах, CaMKIIa – промотор кальмодулин зависимой киназы II альфа для экспрессии в возбуждающих нейронах, fPV – промотор парвальбумина рыбы фугу для экспрессии в парвальбумин-позитивных тормозных нейронах); (3) последовательность, кодирующую красный флуоресцентный белок mRuby2, использующийся в качестве репортера; (4) автокаталитический пептид P2A, позволяющий получать две раздельные полипептдные цепи с одной открытой рамки считывания, (5) последовательность, кодирующую целевой белок (DAAO, DAAD или их иннактивированные мутанты); и (6) последовательность сигнала полиаденилирования hGH poly(A) signal. Достоверность последовательностей собранных конструкций мы подтверждали секвенированием промоторной области и открытой рамки считывания. Затем собранные нами конструкции были упакованы в вирусные вектора на основе синтетического капсида AAV DJ. Выбор этого капсида был обусловлен тем, что по литературным данным, а также по нашим собственным наблюдениям вирусные векторы на его основе проявляют белее высокую способность трансдукции по сравнению с традиционными для заражения клеток нервной системы капсидами AAV8 и AAV9. Полученные нами вирусные векторы (12 вирусных векторов, соответствующих 12-ти собранных нами конструкциям на основе pAAV2) имели титр не ниже 1Е+11 вирусных геномов/мл. Похожим образом мы сначала собрали плазмидные конструкции на основе pAAV2 для экспрессии HyPer3, iNap1 и iNapC под контролем астроцитарного промотора gfa2 и нейронального промотора hSyn1 (в общей сложности 6 конструкций), а затем эти конструкции были упакованы в адено-ассоциированный вирус серотипа DJ. Чтобы протестировать работоспособность полученных вирусных векторов, мы ими заражали первичные культуры нейронов и астроцитов, полученных из эмбрионального мозга мышей. По флуоресценции репортера mRuby2 (для конструкций с DAAO, DAAD или с их инактивированными мутантами) или сенсора (для конструкций с HyPer3, iNap1 и iNapC) мы сделали вывод о том, что прошло заражение и конструкции экспрессируются. Специфичность экспрессии репортера под контролем нейрон- или астроцит-специфических промоторов, определяли по морфологическим признакам клеток. Для того, чтобы доказать, что целевые ферменты DAAD, DAAO или их инактивированные мутанты синтезируются в нейронах и астроцитах после заражения собранными нами вирусными векторами, мы проводили окрашивание крысиными поликлональными антителами против DAAD и мышиными моноклональными антителами против DAAO. Окраска антителами на DAAD подтвердила синтез фермента и его инактивированной формы в нейронах и астроцитах, экспрессировавших репортер mRuby2, после заражения вирусными векторами, которые несут последовательности, кодирующие DAAD и DAAD(R36I, R37I). В то же время на препаратах, зараженных вирусными конструкциями с DAAO или его инактивированной формой и окрашенных антителами против DAAO, мы не обнаружили клеток, иммунопозитивных по DAAO, несмотря на экспрессию репортера mRuby2. Наличие позитивного окрашивания в контрольных клетках линии HEK293, трансфецированных плазмидным вектором pAAV-HyPer-DAAO-NES, свидетельствует о том, что мышиные моноклональные антитела, использованные в работе, действительно выявляют DAAO. Однако, их чувствительности, вероятно, не достаточно для детекции DAAO, экспрессия которого находится под контролем нейрон- и астроцит-специфических промоторов. Поскольку нам не удалось иммуногистохимическим методом доказать синтез рекомбинантного фермента DAAO в целевых клетках, мы провели функциональное тестирование клеток, зараженных вирусными векторами, кодирующими активную форму фермента под контролем нейронального и астроцитаного промоторов. Для этого мы трансдуцировали первичные культуры нейронов и астроцитов парами вирусных векторов: (1) AAV2/DJ_gfa2-mRuby2-P2A-DAAO и AAV2/DJ_gfa2-HyPer3 и (2) AAV2/DJ_CaMKIIa-mRuby2-P2A-DAAO и AAV2/DJ_hSyn1- HyPer3. Затем мы произвели регистрацию рациометрического сигнала сенсора HyPer3 в режиме реального времени в ответ на добавление в раствор, в котором содержались клетки, D-аланина. Анализ полученных данных показал, что в тех клетках, которые одновременно экспрессировали репортер mRuby2 и сенсор HyPer3 (т.е. клетки, зараженные обоими вирусными векторами), увеличивается рациометрический сигнал сенсора HyPer3 в ответ на добавление D-аланина. Мы не наблюдали увеличение сигнала сенсора HyPer3 в контрольных клетках, которые были трансдуцированы только конструкциями с сенсором. Данные, полученные в функциональном тесте, подтверждают синтез активной формы фермента DAAO в целевых клетках. Таким образом, проведенные нами работы и полученные нами результаты позволяют говорить о том, что основная цель первого этапа проекта была достигнута. Мы получили векторы на основе адено-ассоциированных вирусов для экспрессии DAAO, DAAD, их инактивированных мутантов, а также сенсоров для детекции пероксида водорода и НАДФ-Н.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Основная задача текущего этапа проекта состояла в функциональной проверке векторов на основе аденоассоциированных вирусов, которые мы собрали на предыдущем этапе проекта, для дальнейшего их использования в экспериментах in vivo. Для этого мы проводили имиджинг первичных клеточных культур из эмбрионального мозга мышей, ко-трансдуцированных вирусными векторами, кодирующими ферменты (DAAO, DAAD или их инактивированные мутанты) и сенсоры для детекции пероксида водорода и НАДФ-Н (HyPer3, iNap1 и iNapC). Когда мы детектировали продукцию пероксида водорода в нейронах, в которых синтезируется DAAO, при добавлении D-аланина, то обнаружили, что в клеточных ядрах сигнал сенсора HyPer3 возрастает сильнее, чем в цитоплазме. Это свидетельствует о генерации пероксида водорода в ядре. Для того, чтобы в дальнейшем при выполнении проекта избежать неспецифических эффектов, связанных с окислительным повреждением геномной ДНК в результате локальной продукции пероксида водорода, мы пересобрали генетические конструкции с DAAO и его инактивированным мутантом DAAO(R285A), добавив сигнал экспорта из ядра NES к кДНК DAAO и заменив репортер mRuby на RFP для последующей детекции с помощью антител. Кроме того, для детектирования пероксида водорода мы собрали конструкции с более чувствительным и рН-стабильным сенсором HyPer7. На основе новых конструкций были собраны вирусные векторы. Используя новые вирусные векторы, мы показали, что в цитоплазме нейронов и астроцитов продуцируется пероксид водорода в ответ на добавление в среду, в которой содержались клетки, D-аланина. При этом, в нейронах прослеживалась зависимость амплитуды ответа сенсора от концентрации субстрата, тогда как амплитуда ответа сенсора в астроцитах была примерно одинаковой для всех проверенных концентраций субстрата (1, 2, 5 и 10 мМ D-аланина). Похожие результаты на нейронах и астроцитах были получены в экспериментах с добавлением другой D-аминокислоты D-норвалина. Во всех случаях добавление D-аланина или D-норвалина клеткам, экспрессировавшим инактивированный DAAO(R285A), не вызывало ответа сенсора. Таким образом полученные нами конструкции с DAAО могут быть использованы для контролируемой хемогенетической продукции пероксида водорода в нейронах и астроцитах. Начальные попытки продемонстрировать функциональность DAAD с помощью НАДФ-Н-чувствительного сенсора iNap1 и его рН-контроля iNapC в целевых клетках в ответ на добавление в среду D-лизина не увенчались успехом. Мы не смогли зарегистрировать повышения сигнала сенсора iNap1 в ответ на добавление D-лизина. Тогда мы проверили способность сенсора iNap1 реагировать на изменения в пуле НАДФ/НАДФ-Н на более простой модели клетках линии HeLa. Для этого мы собрали конструкции, в которых сенсоры iNap1 и iNapC находились под контролем промотора CMV, и трансфецировали ими клетки. Перед съемкой клетки инкубировали в среде без глюкозы. Это приводит к окислению НАД-Н без изменения уровня восстановленного НАДФ-Н. Поэтому окислительный стресс, вызванный, например, пероксидом водорода, в таких клетках должен приводить окислению НАДФ-Н и, как следствие, к падению рациометрического сигнала сенсора iNap1. Действительно в наших экспериментах добавление пероксида водорода вызывало реакцию сенсора. Поскольку нам не удалось детектировать повышение уровня восстановленного НАДФ-Н в клетках линии HeLa, экспрессирующих DAAD, при добавлении D-лизина, мы изменили дизайн эксперимента. Сначала мы вызывали окислительный стресс клеток пероксидом водорода, а через минуту добавляли субстрат для DAAD. В таком эксперименте мы обнаружили, что в клетках с DAAD сигнал сенсора iNap1 восстанавливается быстрее, по сравнению с сигналом сенсора в клетках с инактивированным мутантом. Эти наблюдение позволили подтвердить функциональную активность DAAD при его экспрессии в клетках. Для демонстрации того, что собранные нами вирусные векторы обеспечивают синтез DAAO, DAAD и их инактивированных мутантов в целевых клетках мозга после заражения, мы с помощью стереотаксической установки ввели вирусные векторы в область зубчатой извилины гиппокампа. Через 14-20 дней после операции животных подвергали эвтаназии. Извлеченный головной мозг резали фронтально на вибратоме. Полученные срезы окрашивали первичными антителами на DAAO и DAAD, а также первичными антителами против белков маркеров клеточных фенотипов: anti-CaMKIIa – возбуждающие нейроны, anti-parvalbumin – тормозные нейроны и anti-GFAP – астроциты. Окрашенные препараты сканировали на конфокальном микроскопе для получения панорамных и детализированных изображений гиппокампа. У всех животных, которым мы вводили вирусные векторы, на панорамных изображениях было выявлено заражение структур гиппокампа и частично коры головного мозга в области трека инъекционной иглы по сигналу репортера красного флуоресцентного белка RFP. Зараженные клетки обнаруживались не только в зубчатой извилине, но и в полях СА1-СА3 гиппокампа. С помощью детальных трехмерных реконструкций зубчатой извилины нам удалось подтвердить специфическую экспрессию DAAO, DAAD и их инактивированных мутантов в возбуждающих нейронах и астроцитах. Однако, конструкции с промотором fPV показали низкую избирательность экспрессии репортера. Сигнал репортера был обнаружен в возбуждающих гранулярных нейронах. В этой связи мы отказались от дальнейших исследований с использованием конструкций с промотором fPV. Пилотный эксперимент, в котором мы исследовали влияние окислительного стресса, индуцированного хемогенетическим методом в гарнулярных нейронах извилины, на пролиферацию прогениторных клеток и выживание новорожденных нейронов, включал три экспериментальные группы животных и состоял из следующих этапов. Сначала животным инъецировали вирусные векторы для экспрессии DAAO и его инактивированного мутанта в гранулярных нейронах. Примерно через 10 дней после операции вводили первую метку 5-йодо-2’-деоксиуридин (ЙоддУ). По этой метке мы в дальнейшем оценивали выживание новорожденных нейронов. Еще через 7 дней, когда все клетки, включившие метку ЙоддУ, прекращают делиться и выходят в дифференцировку, животным одной экспериментальной группы с активным DAAO и одной контрольной группы с инактивированным DAAO(R285A) начинали давать питьевую воду с добавлением D-аланина. Животные третьей контрольной группы с активным DAAO потребляли обычную питьевую воду. Животные содержались на диете с D-аланином на протяжении 3-х недель. Перед эвтаназией всем животным вводили вторую метку 5-этинил-2’-деоксиуридин (ЭдУ) для оценки уровня пролиферации. Подсчет клеток с метками не выявил статистически значимых отличий между группами. Таким образом, в пилотном эксперименте мы не выявили эффекта окислительного стресса, индуцированного хемогенетическим методом в гранулярных нейронах, на нейрогенез в зубчатой извилине. Для того, чтобы выяснить, является ли полученный результат следствием какой-либо технической проблемы, или же окислительный стресс гранулярных нейронов не оказывает никакого эффекта на нейрогенез, мы исследовали влияние хемогенетически индуцированной продукции пероксида водорода на физиологические свойства нейронов, экспрессирующих рекомбинантный DAAO. С этой целью мы вводили мышам собранные нами вирусные векторы для экспрессии DAAO и его инактивированного мутанта в пирамидных нейронах поля СА1, а затем в лаборатории электрофизиологии ФГБУ «Федеральный центр мозга и нейротехнологий ФМБА России» (рук. лаборатории А.В. Розов) проводились исследования синаптической передачи на переживающих срезах. Неожиданно для нас обнаружилось, что D-аланин в концентрациях, которые вызывают заметный ответ сенсора на пероксид водорода HyPer7, обратимо подавляет синаптическую передачу как в нейронах с активным DAAO, так и в нейронах с инактивированным DAAO, что выражалось в снижении амплитуды вызванных постсинаптических токов (ВПСТ). В то же время D-норвалин в концентрациях, вызывающих заметный ответ сенсора HyPer7, не оказывает подобного эффекта. Поэтому далее мы исследовали, как окислительный стресс, вызванный D-норвалином в нейронах, экспрессирующих DAAO, влияет на такое явление, как долговременная потенциация (ДВП). Оказалось, что эндогенно сгенерированный пероксид водорода не препятствует возникновению ДВП, но влияет на ее длительность. В то время, как в нейронах с инактивированным DAAO ДВП поддерживается без изменения амплитуды ВПСТ не менее 30-40 мин, в нейронах с активным DAAO ДВП затухает в течение 15-20 мин. Хотя эти исследования не входили в задачи проекта, полученные в них результаты имеют важное значение, поскольку мы здесь впервые показываем, что пероксид водорода, сгенерированный хемогенетически внутри нейронов, влияет функционирование синапсов. Это открывает новые пути развития исследований, направленных на изучение роли редокс-зависимого метаболизма нейронов в синаптической передаче.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Работы в 2022 году были направлены на достижение главной цели проекта, а именно выяснить, как влияют сдвиги в редокс-состоянии клеток в нише стволовых клеток гиппокампа на нейрогенез. Для этого мы стереотаксически доставляли вирусные вектора, которые несли кДНК для экспрессии дрожжевой оксидазы D-аминокислот (DAAO) или ее инактивированного мутанта DAAO(R285A), билатерально в зубчатую извилину (ЗИ) гиппокампа мышей. С помощью специфических промоторов CaMKIIa и gfa2 мы нацеливали DAAO или DAAO(R285A) либо в возбуждающие нейроны, либо в астроциты. После 10-12-ти суточного восстановления животным внутрибрюшинно вводили аналог тимидина 5-бромо-2’-деоксиуридин (BrdU) или 5-йодо-2’-деоксиуридин (IdU), которые маркируют делящиеся клетки. Через 7 дней после введения меток животным в организм доставляли D-норвалин. Временной промежуток в 7 дней был необходим, чтобы все клетки, которые включили первую метку, закончили цикл делений до начала доставки D-норвалина. В экспериментах D-норвалин мы доставляли в организм мышей двумя способами: через питьевую воду на протяжении 3-х недель или путем ежедневных внутрибрюшинных инъекций в течение 10 дней. В заключительный день эксперимента животным вводили второй аналог тимидина 5-этинил-2’-деоксиуридин (EdU), после чего их усыпляли, ткани мозга перфузировали и фиксировали. Срезы мозга затем окрашивали для выявления введенных меток. По изменению количества клеток с первой меткой BrdU или IdU можно было судить о влиянии хемогенетически вызванного окислительного стресса в нейронах и астроцитах на выживание постмитотических новорожденных нейронов. По изменению количества клеток со второй меткой EdU можно было судить о его влиянии на пролиферацию стволовых и прогениторных клеток. Нами были выполнены четыре серии экспериментов, в каждом из которых использовались когорты самцов мышей С57BL/6J возрастом 2-2.5 месяца. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с законодательством Российской Федерации и положениями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальный и иных научных целей (ETS 123 от 18 марта 1986 г.). Все процедуры с животными, описанные в настоящем проекте, одобрены Институтской Комиссией по контролю за содержанием и использованием животных. Во всех четырех сериях экспериментов животные распределялись между тремя группами: Группа DAAO+D-норвалин (Эксперимент), Группа DAAO(R285A)+D-норвалин (Контроль активности эндогенного DAAO), Группа DAAO+вода/инъекция физиологического раствора (Контроль собственного метаболизма D-аминокислот). В первой серии экспериментов мы изучали влияние вызванного с помощью хемогенетического инструмента окислительного стресса в нейронах на нейрогенез при 21-дневной доставке D-норвалина путем добавления его в питьевую воду. В остальных сериях D-норвалин вводили ежедневно путем внутрибрюшинных инъекций на протяжении 10 дней. Во всех четырех сериях экспериментов мы не смогли выявить достоверных отличий между экспериментальной и контрольными группами ни по выживаемости новорожденных клеток, ни по уровню пролиферативной активности. Этот результат не зависел ни от способа доставки D-норвалина – через питьевую воду или внутрибрюшинные инъекции, ни от целевых клеток – возбуждающих нейронов или астроцитов. В одной из серий экспериментов мы обнаружили дистрофию тканей ЗИ гиппокампа вне зависимости от того, был ли это вирус с DAAO с его инактивированным мутантом DAAO(R285A). Причиной этого являлась очень высокая концентрация вирусных частиц. Поэтому в следующей серии экспериментов при использовании того же самого стокового раствора, но разведенного в 10 раз мы не наблюдали признаков дистрофии ЗИ. Таким образом, мы не смогли установить влияет ли хемогенетически индуцированный окислительный стресс в нейронах и астроцитах ЗИ гиппокампа на нейрогенез или нет. Причинами таких неопределенных результатов могут быть: отсутствие ожидаемых эффектов от внутриклеточного окислительного стресса, вирусная нагрузка, которая по некоторым последним литературным данным может даже полностью подавлять нейрогенез, и недостаточно эффективная продукция пероксида водорода из-за низкой эффективности проникновения субстрата DAAO через гематоэнцефалический барьер. Запланированные на этом этапе работы с применением бактериальной НАДФ+-зависимой дегидрогеназы D-аминокислот (DAAD) выполнены не были из-за прекращения поставок гидрохлорида D-лизина, который является субстратом DAAD. В этой связи нами были выполнены работы взамен экспериментов с DAAD. Мы продолжили эксперименты, связанные с изучением влияния внутриклеточного окислительного стресса на функционирование нейронов. Самцам доставляли вектора для экспрессии DAAO или DAAO(R285A) билатерально в поле СА1 гиппокампа с помощью стереотаксических операций. После периода восстановления животных подвергали эвтаназии, и приготавливали переживающие срезы мозга для электрофизиологических исследований. Электрофизиологические исследования методом патч-кламп на переживающих срезах проводились в лаборатории электрофизиологии ФГБУ «Федеральный центр мозга и нейротехнологий ФМБА России» (рук. лаборатории А.В. Розов). Эксперименты, проведенные на текущем этапе проекта, подтвердили полученные нами ранее данные о подавлении долговременной потенциации (ДВП) пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа. Мы также посмотрели эффекты хемогенетически продуцируемого пероксида водорода на ДВП на уровне отдельных клеток, доставляя субстрат через патч-пипетку. Наши результаты впервые показали, что окислительный стресс в отдельном нейроне приводит к подавлению ДВП. В аналогичном эксперименте мы исключили возможность того, что наблюдаемые эффекты связаны с производным D-норвалина 2-оксовалериановой кислотой, подтвердив таким образом, что наблюдаемые эффекты связаны только пероксидом водорода. Далее мы прововдили эксперименты, направленные на подтверждение того, что в мозге действительно можно продуцировать пероксид водорода с помощью DAAO. Для этого вирусные вектора для экспрессии кДНК для DAAO или DAAO(R285A) и флуоресцентного биосенсора на перокстид водорода HyPer7 в нейронах стереотаксчески вводились в ЗИ гиппокампа мышей. Затем в эту же область имплантировали ферулу. После восстановления животных перевозили в лабораторию фотоники и нелинейной спектроскопии Физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (рук. А.М. Жёлтиков), где на оптической установке проводили регистрацию рациометрического сигнала биосенсора HyPer7 в режиме реального времени через присоединённое к феруле оптическое волокно. Анестезированным животным внутрибрюшинно вводили D-норвалин в той же дозе, что была использована в экспериментах по исследованию нейрогенеза. Увеличение рациометрического сигнала флуоресценции HyPer7 в мозге животных с DAAO и отсутствие изменений рациометрического сигнала флуоресценции HyPer7 в мозге животных с DAAO(R285A) подтвердили хемогенетическую продукцию пероксида водорода в нейронах. Кроме того, в этих экспериментах мы протестировали еще один перспективный субстрат для DAAO D-метионин, который вызывает сходные по амплитуде ответы, что и D-норвалин, но при в 2.5 раза меньшей дозе. Это позволит в будущем снизить нагрузку на клеточный метаболизм. Таким образом, несмотря на то, что эффекты модуляции редокс метаболизма нейронов и астроцитов на нейрогенез не были обнаружены в наших экспериментах, нам удалось показать яркий эффект хемогенетически вызванного окислительного стресса на синаптическую пластичность на уровне отдельных нейронов и доказать возможность применения хемогенетического инструмента на основе DAAO в мозге in vivo. Результаты, полученные на всех трех этапах выполнения проекта, были представлены на публичной лекции под названием «Синтетическая нейробиология: как при помощи генетической инженерии управлять мозгом?» в рамках проекта «Нейрокампус». Вторая часть лекции была посвящена работам, выполненным в рамках настоящего проекта. Лекция доступна в открытой сети «ВКонтакте»: https://vk.com/video-216180485_456239017.