Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В результате работ первого года получены новые данные об антигенотоксическом действии полифенольного комплекса BP-C2 в моделях in vivo с использованием теста ДНК-комет и оценено влияние композиции на репарацию ДНК in vitro. Так, установлено, что композиция ВР-С2 проявляет антигенотоксическую активность в клетках костного мозга, печени и крови мышей in vivo, снижая ДНК-повреждающие эффекты генотоксиканта прооксидантного типа действия диоксидина и генотоксиканта, индуцирующего внутринитевые сшивки ДНК - циклофосфамида. Протекторная активность композиции ВР-С2 по отношению к повреждающим эффектам диоксидина наиболее выражена при ее использовании в дозе 60 мг/кг. По отношению к генотоксическому действию циклофосфамида протекторный эффект композиции ВР-С2 проявляется только в дозе 60 мг/кг, тогда как в дозе 120 мг/кг в клетках печени наблюдается инверсия эффекта из антигенотоксического в прогенотоксический. Совокупность полученных данных свидетельствует о наличии у композиции ВР-С2 антигенотоксической активности и определяет перспективность дальнейших исследований на антимутагенную активность в цитогенетических тестах in vivo на втором году выполнения проекта. Проведенная оценка влияния полифенольного комплекса BP-C2 на эффективность репарации двунитевых разрывов (ДР) ДНК in vitro в культивируемых клетках человека в условиях генотоксического стресса (ионизирующее излучение) показала отсутствие влияния композиции на репарацию ДНК. На следующих этапах выполнения проекта будет продолжен поиск вероятного механизма антигенотоксического действия композиции. Начат эксперимент по индукции радиационного канцерогенеза у крыс – самок. Промежуточные результаты исследования показали, что однократное относительно равномерное облучение всего тела в дозе 4 Гр, помимо немедленного влияния на состояние кроветворной системы, имеет долговременные последствия в виде снижения массы тела экспериментальных животных в течение как минимум 5 месяцев после облучения. Композиция BP-C2 способствовала нормализации данного параметра к концу второго месяца эксперимента. В «остром» периоде опыта отобраны образцы крови для дальнейших исследований методом ДНК-комет, получены и заморожены образцы эритроцитарной массы для последующего определения активности каталазы и супероксиддисмутазы, концентрации продуктов перекисного окисления липидов, а также образцы плазмы крови для определения цитокинов. Разработана модель радиационного повреждения у рыб Danio rerio. Выявлено, что оптимальной дозой ионизирующего облучения для исследований является доза 30Гр, которая в условиях опыта приводит примерно к 50% гибели облученных рыб. Композиция BP-C2 отличается умеренной токсичностью в отношении D. rerio; наиболее целесообразная доза для тестирования – 50 мг/л, режим использования – экспозиция через день с ежедневной сменой среды. В результате работ первого года подтверждено антигенотоксическое действие полифенольного комплекса BP-C2 по отношению к двум генотоксикантам in vivo, подготовлен экспериментальный материал и методы для дальнейших работ по проекту. План проекта выполнен. Проведена пресс-конференция, посвященная проекту, в информационной службе ТАСС. Подготовлены и опубликованы 3 статьи: 2 экспериментальные статьи в журнале «Environmental Research» (WoS, Q1) и обзорная статья в журнале «Успехи геронтологии» (Scopus).

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проект посвящен оценке антимутагенного и антиканцерогенного потенциала полифенольной композиции, содержащей молибден (ВР-С2), для ее использования в качестве средства химиопрофилактики опухолей, возникших под влиянием физических (облучение) или химических канцерогенных агентов. В ходе второго года выполнения проекта получены результаты серии опытов in vitro по изучению влияния полифенольной композиции на выраженность ДНК-повреждающего действия пероксида водорода и метилметансульфоната. Выявлено, что наиболее эффективный режим обработки клеточной линии ФЛЭЧ полифенольной композицией ВР-С2 – прединкубация в течение 24 часов, которая обеспечивает дозозависимое снижение эффекта ДНК-повреждающих агентов до 30-60%; неэффективность использовании BP-C2 после экспозиции клеток к повреждающему агенту свидетельствует о том, что ведущим механизмом действия BP-C2 является не влияние на систему репарации ДНК, а снижение вероятности развития первичных и вторичных повреждений. Проведенное за отчетный период исследование влияния композиции BP-C2 на индуцируемый химическими генотоксикантами кластогенез у мышей in vivo показало, что композиция при ее однократном введении мышам в дозах 60 мг/кг, 80 мг/кг и 120 мг/кг за 1 час до введения повреждающего агента (диоксидин или циклофосфамид) демонстрирует антимутагенную активность по отношению к эффектам обоих мутагенов, на 23,7-49,1% снижая их цитогенетические эффекты. Эти результаты хорошо согласуются с полученными на первом году реализации проекта данными об антигенотоксическом эффекте однократного введения композиции у крыс и мышей. В то же время, при четырехкратном введении BP-C2 экспериментальным животным (суммарные дозы 240 мг/кг, 320 мг/кг и 480 мг/кг за 4 дня) в опытах с использованием диоксидина наблюдается дозозависимая инверсия антимутагенного эффекта в комутагенный, при этом меньшая доза обладает антимутагенным эффектом. В эксперименте с циклофосфамидом наблюдается тенденция комутагенного действия композиции ВР-С2 во всех дозах, со статистически значимым эффектом для дозы 320 мг/кг. В целом, данные этого эксперимента подтвердили, что планируемся в исследовании трансгенерационного канцерогенеза (третий год реализации проекта) у мышей доза BP-C2 20 мг/кг ежедневно (80 мг/кг за 4 дня) принадлежит к диапазону доз, обладающих антигенотоксическим и антимутагенным эффектом. Завершен эксперимент по исследованию BP-C2 в модели радиационного канцерогенеза на крысах-самках Вистар. Кратко, в начале эксперимента 120 крыс-самок были подвергнуты однократному равномерному гамма-облучению в дозе 4 Гр, после чего рандомизированы в 2 группы: группа 1 – облучение (ОК, n=60), группа 2 – облучение + ВР-С2 (n=60). В группу интактного контроля (ИК) включены 60 ложно-облученных животных. Животные группы 2 получали BP-C2 ежедневно с питьевой водой в дозе 30 мг/кг в течение всей жизни. В образцах крови, отобранных через 4 и 72 часа после облучения, методом ДНК-комет показано, что генотоксичное действие выбранной дозы ионизирующей радиации через 4 часа после облучения примерно соответствует повреждениям, возникающим у грызунов под влиянием химических генотоксикантов, использованных на первом году реализации проекта; обнаружена высокая вариабельность индивидуальных значений у облученных животных. В исследовании образцов плазмы крови, отобранных на 11 день после облучения, выявлено, что облучение в дозе 4 Гр приводит к развитию воспалительной реакции у самок крыс, маркирующейся повышением содержания в плазме крови IL-1a, IL-1b и сужением соотношения IL10/IL12. Использование BP-C2 способствовало нормализации содержания IL-1a, снижению содержания цитокина провоспалительного спектра IL-6, повышению содержания плейотропного цитокина IL-10, а также расширением соотношения IL10/IL12. Результаты исследования антиоксидантной активности в лизате эритроцитов экспериментальных животных показали, что облучение вызывает снижение относительной активности каталазы на 40-60% по сравнению со значениями, полученными у контрольной группы, а использование полифенольной композиции способствует нормализации данного параметра. Также наблюдалось закономерное увеличение концентрации продуктов перекисного окисления липидов (ТБК-активных продуктов) у облученных животных и снижение их содержание ниже показателей у ОК при введении ВР-С2. Эксперимент был завершен на 400 день после облучения по достижению 50% гибели животных в группе облученного контроля. Однократное облучение самок крыс в дозе 4 Гр статистически значимо снижало продолжительность жизни облученных крыс по сравнению с интактными животными. В ходе гистологического исследования на срезах тканей крыс, окрашенных гематоксилином и эозином, оценивали частоту и тип развившихся новообразований. К концу эксперимента опухоли были выявлены у 15% интактных животных и у статистически значимого большего количества облученных (у 53% в группе ОК и у 52% в группе BP-С2). При этом множественность опухолей составила 1,44; 1,75 и 1,45 опухолей на животное-опухоленоситель, соответственно. Первое новообразование было выявлено в группе ОК, на 86 сутки опыта, в группе облучённых животных, получавших ВР-С2 - на 134 сутки, в группе ИК – на 263 сутки. Средний латентный период развития опухолей у в группе ИК составил 359,5±16,5 дней; у животных группы ОК - 292,1±12,9 дней (p<0,05); у крыс, получавших ВР-С2 - 305,9±14,9 дней. Опухоли, развивавшиеся у интактных животных, были представлены в основном доброкачественными (фиброаденомами) и одним случаем спонтанной аденокарциномы молочной железы (МЖ). У облученных животных 62,5% выявленных новообразований составили злокачественные аденокарциномы МЖ; введение ВР-С2 снижало частоту их развития на 15%. Таким образом, использование полифенольной композиции ВР-С2 у крыс-самок после облучения снижает множественность развития злокачественных образований и удлиняет период их развития. Вероятным механизмом этого антиканцерогенного действия может являться снижение системной воспалительной реакции, вызванной ионизирующим облучением, реализующегося в том числе через активацию системы антиоксидантной защиты организма. В ходе второго года реализации проекта были подобраны условия облучения, не вызывающие стерильности у взрослых самцов рыб Danio Rerio (5Гр однократно) и проведена оценка влияния препарата BP-C2 на выживаемость и развитие потомства, полученного от таких самцов через 2 месяца после облучения. Показано удовлетворительное развитие икры интактных самок, оплодотворенной спермой облученных самцов; полученное потомство характеризовалось нормальным профилем поведения и активностью, а также отсутствием грубых нарушений морфологии. В то же время, облучение родителей (отцов) статистически значимо снижало темпы роста потомства; при этом использование полифенольной композиции BP-C2 полностью нивелировало данный эффект. На втором этапе проекта начат опыт по трансгенерационному канцерогенезу на мышах BALB/c. За отчетный период были подобраны дозы облучения у самцов мышей BALBc, не вызывающие стерильности. Самцы мышей BALBc были облучены в дозах 6, 4, 2 и 1 Гр и далее разделены на группу облученного контроля (ОК) и экспериментальную группу, дополнительно получавшую ВР-С2 в дозе 40 мг/кг с питьевой водой ежедневно. Группу интактного контроля (ИК) составили «ложно-облученные» мыши. Смертность в течение 30 дней была зафиксирована только при использовании дозы облучения 6 Гр; обнаружена статистически значимое улучшение выживаемости при использовании полифенольной композиции BP-C2. Облучение в меньших дозах не вызывало гибели экспериментальных животных. Обнаружено закономерное снижение массы тела облученных животных. Влияния BP-C2 на этот показатель не выявлено. На 8 сутки опыта у облученных в дозе 6, 4 и 2 Гр мышей наблюдалось снижение массы селезенки, лейкопения и тромбоцитопения; у животных, облученных в дозе 6 Гр, также наблюдалась анемия. Облучение в дозе 1 Гр вызывало меньшие нарушения: снижало массу селезенки и влияло на параметры «красной» крови. Тяжесть физиологических нарушений хорошо коррелировала с дозой облучения; количество выживших животных в опыте во всех группах, кроме ОК в дозе 6 Гр, было достаточным для получения потомства. Для этих целей, на 30-е сутки после облучения выживших самцов перемещали в отдельные клетки и подсаживали к ним по 3 интактные самки BALBc. Жизнеспособное потомство в достаточном количестве для продолжения эксперимента было получено только от самцов мышей, облученных в дозе 1Гр. По достижению трехмесячного возраста все мыши-потомки начали получать канцероген (уретан внутрибрюшинно в дозе 600 мг/кг еженедельно 4 раза); половина каждой группы потомков одновременно с первой инъекцией уретана начала получать полифенольную композицию BP-C2 в дозе 20 мг/кг с питьевой водой ежедневно. На следующем этапе выполнения проекта, в конце периода наблюдения (через 9 месяцев от начала эксперимента) животные будут подвергнуты эвтаназии; будет подсчитана частота и множественность опухолей. Опухоли и основные органы будут подвергнуты патоморфологическому анализу для оценки злокачественности опухолей и тяжести сопутствующих патологий. Также будет проведено сравнение показателей крови, числа жизнеспособных крипт кишечного эпителия, стволовых клеток кишечного эпителия, ряда цитокинов, показателей антиоксидантной системы у животных контрольной и опытных групп. В результате опыта будут получены данные о влиянии ВР-С2 на физиологические показатели потомства облученных мышей, а также трансгенерационную передачу повышенной чувствительности к канцерогенезу. Таким образом, в отчетный период были подобраны дозы облучения, не вызывающие стерильности у самцов мышей BALBc и начат эксперимент по изучения влияния ВР-С2 на химически индуцированный канцерогенез у потомства облученных самцов. Все работы, заявленные для реализации в течение второго года проекта, выполнены полностью. В течение двух лет реализации проекта было опубликовано 4 статьи, в том числе 3 – в журналах, входящих в первый квартиль по цитированию (итого 7 статей). Исходный план публикационной активности (6 статей за 2 года) выполняется с опережением.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
За отчетный период проведена оценка протекторной активности BP-C2 в отношении половых клеток млекопитающих in vivo: методом цитогенетического анализа исследована способность композиции BP-C2 модифицировать цитогенетические эффекты этопозида в ооцитах мышей; методом ДНК-комет исследована способность композиции BP-C2 модифицировать генотоксические эффекты диоксидина и этопозида в клетках семенников мышей. В результате проведенных экспериментов установлено, что композиция ВР-С2 дозозависимо, на 45.5-60.2% снижала анеугенную активность ингибитора топоизомеразы II этопозида в ооцитах мышей in vivo. Композиция ВР-С2 дозонезависимо, на 30-34% снижала ДНК-повреждающую активность генотоксиканта прооксидантного типа действия диоксидина в клетках семенников мышей in vivo. Композиция ВР-С2 не оказывала влияния на индуцируемую этопозидом поврежденность ДНК в клетках семенников, но проявляла цитопротекторную активность, на 30.2-40% снижая индуцируемые генотоксикантом атипичные ДНК-кометы. Таким образом, выявленные в предыдущих исследованиях антимутагенная активность композиции ВР-С2 в соматических клетках подтверждена в половых клетках млекопитающих in vivo. Было проведено исследование влияния полифенольного препарата BP-C2 в трансгенерационного канцерогенеза у трансгенных рыб рыб Danio rerio с индуцибельными доксициклином гепатоцеллюлярными карциномами. В результате изучения трансгенерационных эффектов облучения родителей-самцов (5Гр) на обратное развитие у потомков (гетерозиготных по Tg(fabp10:TA; TRE:xmrk; krt4:GFP)) индуцированной гепатоцеллюлярной карциномы выявлено, что потомство облученных самцов отличается замедленной регрессией опухоли по сравнению с потомством необлученных рыб. При этом экспозиция облученных родителей-самцов к препарату BP-C2 полностью нивелирует данный эффект. За отчетный период завершен опыт по трансгенерационному канцерогенезу на мышах BALB/c. Равномерному гамма-облучению в дозе 1 Гр, позволяющей сохранить фертильность, подвергались самцы мышей BALB/c, часть которых получала после облучения в течение месяца ежедневно ВР-С2 в дозе 80 мг/кг внутрижелудочно, остальные- воду в том же режиме. У их потомков и потомков необлученных самцов химически индуцировали канцерогенез легкого введением уретана (600 мг/кг, 4 раза). Часть потомков получала ВР-С2 в качестве питья. В результате проведенного эксперимента показано, что облучение животных приводит к большей чувствительности их потомства к канцерогену, а применение полифенольного препарата тормозит канцерогенез, только когда его получают непосредственно облученные животные. Таким образом, полифенольный препарат ВР-С2 потенциально может найти применение как средство профилактики трансгенерационной чувствительности к ДНК-повреждающим факторам у людей, подвергающихся таким воздействиям. В ходе выполнения проекта были впервые получены данные о возможности снизить трансгенерационные эффекты повреждения ДНК у родителей с помощью полифенольного препарата. Проведена оценка антигенотоксического, антимутагенного и антиканцерогенного действия изучаемого препарата на различных тест-системах – рыбах, крысах, мышах, клетках человека, причем эти эффекты были доказаны для всех изученных модельных объектов. Данные, полученные в ходе исследования повреждения ДНК в клетках человека и в различных органах мышей согласуются с данными, полученными при исследовании трансгенерационных эффектов повреждения ДНК и возможности их профилактики с помощью полифенольного препарата у мышей и рыб Danio rerio. Таким образом, получена доказательная база, которая дает возможность экстраполировать полученные результаты на человека и рекомендовать ВР-С2 для дальнейшей клинической разработки в качестве перспективного средства сопровождения лучевой и химиотерапии для профилактики трансгенерационных нарушений. За отчетный период результаты представлялись на двух профильных конференциях, было опубликовано 6 печатных работ, в т.ч. 2 тезисов и 4 статьи в журналах, индексируемых WoS или Scopus, в том числе одна – в журнале, входящим в первый квартиль по цитированию. План работ выполнен полностью, все запланированные результаты на третьем году реализации проекта достигнуты.